無機ポリリン酸の細菌のための試金

無機ポリリン酸 (ポリープ) はライフ^1,2,3のすべてのドメインである phosphoanhydride リンク リン酸単位の線形生体高分子です。多様な細菌でポリープは欠かせないストレス反応、運動、バイオ フィルム形成、細胞周期制御、抗生物質耐性、病原性^{4,5,6,7,8 ,9,10,11}。ポリープ細菌で代謝の研究したがって病気を引き起こす、さまざまな環境で繁栄する細菌の能力に根本的な洞察力をもたらす可能性があります。多くの場合、細菌細胞における定量化のポリープとして使用する方法が、これらの研究を制限する要素です。

現在ポリープ生体試料中濃度を測定するために使用するいくつかの方法があります。これらのメソッドは通常 2 つの明瞭なステップを含む: それらの抽出物でポリープを抽出し、ポリープを定量化を提示します。Bru と同僚で¹²フェノールを使用する RNA と DNA 抽出ポリープ酵母酵母として開発した現在の金本位法、クロロホルム、エタノールの沈殿物、治療が続く出芽酵母ポリープ分解酵素 exopolyphosphatase (ScPPX)¹³を使用して定量化は、フリーのりん酸塩を生成するために結果として得られる精製ポリープの消化およびリボヌクレアーゼ (RNase)、デオキシリボヌクレアーゼ (DNase)、マラカイト グリーンを用いた比色定量法。この手順は、非常に数量が、労働集約的な単一の実験で処理することができ、細菌性のサンプルのために最適化されていませんするサンプルの数を制限することです。他の人はさまざまな細胞や組織をシリカビーズ (“glassmilk”) またはシリカ膜列^{6,14,15,16,17を使用してからポリープを抽出を報告しています。 18}。これは主に合成と一般的に考えられている細菌をそれほど考慮これらのメソッドは効率的に短鎖ポリープ (未満 60 リン酸単位)^12,14,15, を抽出できません。長鎖ポリープ³。強い酸^19,20を使用してポリープ抽出のより古い方法はもはや広く利用されてポリープは酸性条件¹²の下で安定しているので。

また、さまざまな定量化ポリープの報告方法があります。最も一般的なの間では 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 蛍光色素の詳細は通常、DNA を染色に使用です。DAPI ポリープ錯体 DAPI DNA 複合体^21,22より異なる蛍光励起と放射マキシマが RNA、ヌクレオチド、イノシトールなど他の細胞部品からかなりの干渉があります。リン酸塩^12,15,16,23, 特異性とこのメソッドを使用してポリープ測定の感受性を減らします。ポリープとアデノシン二リン酸 (ADP) をアデノシン三リン酸 (ATP) を精製した大腸菌を使用してに変換する代わりに、ポリープのキナーゼ (PPK) およびルシフェラーゼ^{14,17 を用いて定量化結果 ATP ,18}。これはポリープの非常に少量の検出が可能、2 つの酵素反応ステップ ルシフェリンと非常に純粋な ADP は、高価な試薬であるが必要です。ScPPX フリーのりん酸塩^6,12,13,24、簡単な方法、しかし ScPPX を使用して検出することができますに特にダイジェスト ポリープは DNA および RNA の¹²によって阻害されます。ポリープを含む必要と DNase、RNase 処理を抽出します。PPK も ScPPX も市販と PPK の浄化は比較的複雑な^25,26。

DAPI 染色^27,28,29,30、チェーン長さの評価を許可して、メソッドは負で、セル lysates または抽出物でポリープのポリアクリルアミドゲルで視覚化できるも低スループットと低い定量。

我々 は今多様な細菌種のレベル ポリープの急速な定量化を可能にする安価な高速、中速のポリープ アッセイを報告します。このメソッドは、複数のサンプルの迅速な処理のために最適化されたシリカ膜列抽出に続いて携帯電話のホスファターゼを不活化する 95 ° c 4 M グアニジン イソチオ シアン酸 (GITC)¹⁴で細菌細胞の分離によって開始します。得られたポリープを含む抽出液は、DNase、RNase の治療の必要性を排除する ScPPX の大過剰と消化されます。ScPPX の mg 量の簡単なニッケル親和性の浄化のためのプロトコルが含まれます。最後に、ポリープ由来フリーのりん酸塩は、単純な敏感なアスコルビン酸ベースの比色定量法²⁴の定量化し、総細胞蛋白質に正規化します。このメソッドは、細菌細胞、ポリープの測定を合理化し、グラム陰性菌、グラム陽性菌、抗酸菌の代表種でその使用を示します。