Подготовка Exosomes siRNA доставки раковых клеток
Summary
Exosome представляет новое поколение перевозчиков поставки наркотиков. Мы создали exosome Протокол изоляции с высокой урожайностью и чистоты для доставки siRNA. Мы также инкапсулировать дневно помечены неспецифической малых интерферирующих РНК в exosomes и исследованы клеточного поглощения малых интерферирующих РНК загружен exosomes в раковых клетках.
Abstract
Внеклеточные везикулы, в частности exosomes, недавно получили интерес как роман наркотиков векторов доставки из-за их биологического происхождения, изобилия и внутренние возможности в межклеточных доставки различных биомолекул. Эта работа устанавливает Протокол изоляции для достижения высокой урожайности и высокой чистоты exosomes для доставки siRNA. Человеческих эмбриональных почек (ГЭС-293 клетки) культивировали в биореакторе колбы и культуры супернатанта (расписка называют кондиционером среднего) собирают на еженедельной основе для обогащения exosomes ГЭС-293. Кондиционерами среднего (см) предварительно очищается от отмерших клеток и клеточных обломков, дифференциального центрифугирования и подвергается ultracentrifugation на подушке сахарозы последовал Стиральная шаг, чтобы собрать exosomes. Изолированные exosomes ГЭС-293 характерны для урожайности, морфология и exosomal маркер выражения анализа отслеживания наночастиц, белок количественной оценки, электронной микроскопии и проточной цитометрии, соответственно. Малые интерферирующие РНК (siRNA), дневно помечены Atto655, загружается в exosomes путем электропорации и избыток siRNA удаляется путем фильтрации геля. Поглощения клеток в раковые клетки PANC-1, после 24 ч инкубации при температуре 37 ° C, подтверждается проточной цитометрии. Exosomes ГЭС-293 являются 107.0 Нм ± 8.2 в диаметре. Коэффициент соотношения (аналогично) exosome урожайность и частица белка являются 6.99 ± 0,22 × 1012 частиц/мл и 8,3 ± 1,7 × 1010 частиц/мкг, соответственно. Инкапсуляция эффективность малых интерферирующих РНК в exosomes ~ 10-20%. Сорок процентов клеток Показать позитивные сигналы для Atto655 на 24 ч после инкубации. В заключение exosome изоляции по ultracentrifugation на подушке сахарозы предлагает сочетание чистоты и хороший урожай. малых интерферирующих РНК может быть успешно загружены в exosomes путем электропорации и впоследствии доставлены в раковые клетки в пробирке. Этот протокол предоставляет стандартную процедуру для развивающихся малых интерферирующих РНК загружен exosomes для эффективной доставки на раковые клетки.
Introduction
Exosomes являются подтипом внеклеточного везикулы (EV), начиная от 50-200 Нм в диаметре, выделяемый различных типов клеток, таких как иммунные клетки1,2, раковые клетки3,4,5, 6 и стволовых клеток7. Exosomes, также было показано, присутствовать в различных физиологических жидкостях8,9,10,11. Сочетание присущих exosomes способность выполнять различные биомолекул (например, РНК и белков)12,,13–14 и эффективной доставки Эти биомолекулы в получателей клетки 15 , 16 , 17 привлекла интерес для их потенциал как нано-векторов доставки наркотиков. Различные маленькие молекулы, которые служат противораковых и противовоспалительные препараты проявили успешно загружаться в exosomes и доставлены целевых ячеек18,19,20, 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. интересно, что нуклеиновые кислоты как siRNA28,29 и микроРНК30 также были успешно загружены в exosomes через электропорации и доставлены к клеткам-мишеням.
Недавно РНК интерференции (RNAi) через малые интерферирующие РНК (siRNA) приобрел больше интереса как предпочтительный механизм подавления экспрессии гена из-за его высокой специфичности, мощным эффектом, минимальные побочные эффекты и простота малых интерферирующих РНК синтеза28, 29. малые интерферирующие РНК являются молекулы двуцепочечной РНК от 19 до 25 нуклеотидов в длину что триггеры последовательности конкретные каталитические мРНК нокдаун. Благодаря своей большой молекулярной массой и Полианионная природы пассивное поглощение голый интерферирующей РНК в клетки — препятствуют28,29. Это также не возможно для голый siRNA быть введены в кровообращения за счет быстрой деградации плазмы nucleases31. Таким образом инкапсуляции интерферирующей РНК в nanocarrier будет способствовать эффективной доставки и поглощение малых интерферирующих РНК в клетки-мишени.
Exosomes являются идеальной системой для инкапсуляции siRNA, как его структура состоит из полые, водный ядра, окруженная фосфолипидного бислой. Exosomes не только имеют хорошую стабильность в крови, но также имеют природные нацеливания свойств доставить функциональных РНК в клетки32. Исследование, проведенное Альварес-Эрвити et al. успешно продемонстрировал эффективной доставки интерферирующей РНК в мозг мышей с помощью инженерных exosomes с практически без осложнений31. Можно предположить, что на основе exosome терапия является относительно безопаснее, чем другие виды терапии, как exosomes эндогенно не реплицируются как клетки бы и поэтому не проявляют свойства метастатических15.
Различные методы, как сообщается, успешно изолировать exosomes из клеточной культуры или физиологические жидкости. Наиболее популярным методом использует ultracentrifugation для Пелле exosomes от начального материала31,32,33. Этот метод может быть довольно суровой на exosomes и, как правило, Сопредседатель преципитаты белков из образца. Сочетание ultracentrifugation с на основе плотности разделения например сахароза градиенты становится все более распространенным, чтобы уменьшить загрязнение протеина и не exosomal в изолированных exosomes19,34. Размер-гель-проникающей хроматографии (SEC) позволяет разделение exosomes от других видов внеклеточного везикулы (EV) по размеру и может также привести к минимальным белковых загрязнений, но ограничивается небольшое количество исходного материала, он может обрабатывать35, 36. Immunoaffinity захвата использует бисер покрытием с антителами, которые связывают с exosomal поверхности белки, например tetraspanins или других клеток конкретных маркер, позволяющий конкретные захвата exosomes, вместо того, чтобы EVs или другие белки, а также изоляция подгрупп населения в exosomes от всей образцов, но опять же ограничивается количество исходного материала и является дорогостоящим36,37. На полимерной основе осадков exosomes используется для быть популярным тоже, но так как это довольно сырой осадков, это приводит к более не exosomal везикул и белка загрязнение38,39.
Электропорация сообщалось за ее неэффективности как метод для загрузки exosomes с малых интерферирующих РНК за счет белков агрегации15,28,31. Подходы на основе трансфекции были продемонстрированы иметь лучше загрузки эффективность и стабильность белков, но нежелательно из-за своей токсичности и побочные эффекты трансфекции агентов в изменяя клеточных генов выражение28. Таким образом электропорация более широко использовался в siRNA загрузки в exosomes как это безопасный метод. Однако метод оптимизации Инкапсуляция необходимо быть создан для того, чтобы доставить достаточное количество малых интерферирующих РНК на целевой сайт для мощным генов нокдаун.
Здесь мы предлагаем exosome Протокол изоляции с помощью основанных на плотность ultracentrifugation на только один 25% (w/w) сахарозы подушке в окись дейтерия, вместо того, чтобы градиент плотности сахарозы. Это эффективный метод, который обходит градиента подготовка трудоемкий плотности и позволяет обрабатывать большие объемы исходного материала, но приводит к нетронутым exosomes высокой урожайностью и чистоты подходит для последующей загрузки с siRNA. Флуоресцентный конъюгированных Atto655 неспецифической siRNA была загружена в человеческих эмбриональных почек (клетки ГЭС-293) производные exosomes через электропорации и доставлен раковые клетки человеческого аденокарциномы поджелудочной железы (PANC-1) в пробирке.
Protocol
Representative Results
Discussion
Получение достойной exosome доходность от культивируемых клеток, которые являются достаточно для нескольких раундов в vitro или в vivo исследований, по-прежнему является проблемой. По словам производителя биореактор колбы были предназначены для производства антител и белков с высокой доходности от культуры различных увековечен клеточных линий. Это позволяет клеткам непрерывно обогащают питательной среды с желаемого продукта, приводящих к концентрированной кондиционером среднего (см) в клетки купе. Теоретически же концепция будет полезным в exosome производства из различных клеточных линий, и действительно культивирования этих клеток в колбах биореактор была продемонстрирована значительно увеличить урожайность exosome40. Большой средних водохранилища постоянно поставляет питательные вещества и удаление отходов из клеток отсека через 10 кДа полупроницаемую мембрану, позволяя продолжительной культуре не требуя большого количества средних быть в контакте с клетки, или регулярные Фляги изменения, которые могут в конечном счете сохранить общую стоимость и труда крупномасштабных exosome производства40. Было также продемонстрировано, что морфология, фенотип, а также функции иммуномодулирующих exosomes изолированных клеток, что долгосрочные биореактор колбы культур аналогичны, получены из клетки культивировали в регулярных 75 см2 фляги40. Поэтому культура других увековечен клеточных линий как exosome источников в биореакторе колбу поможет увеличить доходность их exosome при сохранении их целостности и функции. Эта форма культуры является, однако не применимо к первичной ячейки с ограниченным разделение циклов и те, которые нельзя культивировали в высокой плотности.
Так как урожай см делается раз в неделю, и никогда не были пассированной клетки в культуре, можно предположить, что клетки в биореакторе настой не растут в монослое как регулярные клеточной культуры. Они, скорее всего, создавать кластеры с некротическими центрами или просто отсоединить от поверхности и умереть, когда клетки слишком вырожденная для монослоя. Визуальный осмотр клеток отсека биореактор фляга невозможно подтвердить это предположение, но отражается на большое количество отмерших клеток, полученные во время сбора урожая см. Регулярное удаление плохо сторонником и нежизнеспособных клеток от биореактор настой может предотвратить накопление материалов на полупроницаемую мембрану, которая может отрицательно сказаться на обмен газа, питательных веществ и отходов между отсеке клеток и среднего водохранилище, таким образом позволяя в биореакторе колбы для длительного культуры > 6 месяцев40. В этом контексте, это не регулярности роста клеток в колбах биореактор является идеальным, как мы предположить, что он имитирует фактического состояния опухолевого роста в естественных условиях более тесно, чем обычные монослойном культивировании клеток, и следует надеяться, что exosomes производимые раковые клетки в биореакторе колбу будет больше похож на что выделяемый опухоли в vivo. Это было бы особенно полезным в исследованиях, глядя в роли опухоли производные exosomes в прогрессии опухоли патологии. Опухоль производные exosomes сообщили неразрывно и преференциально домой, чтобы их ткани происхождения32, поэтому имея exosomes, производимых в системе, имитируя их в естественных условиях производства было бы также желательно в исследованиях, глядя на изучает пассивной ориентации способность exosomes как nanocarriers препарат.
Аналогично соотношение было сообщено как параметр для оценки чистоты изолированных exosomes от загрязнения белки от питательной среды физиологические жидкости, от которых были получены exosomes из41. Аналогично соотношение 8,3 ± 1,7 × 1010 p/мкг, полученные в настоящем исследовании находится в диапазоне высокой чистоты, предложенные в исследовании. Это соотношение подчеркивается опасность использования концентрацию белка выразить урожайности или дозы exosomes изолированные или используется в нижнем течении исследования соответственно, как это не отражает истинное количество доступных в образце, учитывая проблемы белка exosomes загрязнение в изоляции. НТА через инструменты, такие как NanoSight, который измеряет концентрацию exosomes количеству частиц, является более разумным и точным способом количественной оценки exosomes.
Высокоточные весом в ходе подготовки 25% раствора сахарозы в окись дейтерия имеет решающее значение, как этот метод на основе плотность изоляции. Exosomes имеют довольно узкий диапазон плотности флотации в растворе сахарозы, поэтому точная подготовка сахарозы подушки позволит снизить загрязнение не exosomal пузырьки как apoptotic тела или пузырьков Гольджи, полученных во время изоляции42. Рекомендуется не хранить остатки сахарозы решение и использовать его даже после одного дня с тем, чтобы избежать риска факторов, которые могут изменить его плотность таких потерь или добавление воды в растворе на испарение и конденсация воздуха в трубке. Использование поворотно откидные ротора также важно во время центрифугирования на подушке сахарозы чтобы разрешить даже миграции exosomes см для раствора сахарозы.
Снятие после центрифугирования раствор сахарозы также деликатный шаг, и он включает в себя поиск компромисса между максимальное количество exosomes восстановленные и не слишком много, что белок из питательной среды вводится в exosome пример вывода . Интерфейс между раствора сахарозы и состояния среды, где белки от питательной среды будет собирать после центрифугирования и обычно может рассматриваться как темно коричневый кольцо, которое сидит на интерфейсе. В наших руках снятия 2 мл сахарозы подушки из первоначальных 3 мл добавил является оптимальный объем, который соглашается с компромиссом, упомянутых выше. Тома, указанных в настоящем Протоколе, для конкретных роторов используется; Поэтому рекомендуется оптимизировать объем сахарозы быть отменены при масштабировании вверх или вниз томов для типы роторов, доступных в различных учреждениях. Важно также избежать области право в центре нижней части трубки при снятии сахарозы, как это, где частиц плотность выше, чем сахароза будет отложений и обычно может рассматриваться как белые гранулы.
Стиральная шаг с относительно большим количеством PBS помогает дальнейшему сокращению степени загрязнения белков во время exosome изоляции41. Этот шаг необходим также удаление избыточного сахарозы из exosomes избежание осмотического повреждения exosomes сами или биомолекул в Люмене exosomal, а также снизить риск бактериальных или грибковых роста на складе exosome. Подготовка раствора сахарозы в окись дейтерия, вместо того, чтобы вода помогает уменьшить количество сахарозы, необходимых для достижения плотности флотации exosome для изоляции, поэтому снижение риска осмотического повреждения и микробной контаминации. После первого центрифугированием на подушке сахарозы, exosome содержащих сахарозу слой снят и добавлен в PBS можно хранить при 4 ° C и обработаны на следующий день, если сталкивается с нехваткой времени.
В меру наших знаний exosome/siRNA молярное соотношение является важным фактором в определении эффективности электропорации. В этом протоколе мы использовали 1: 60 как exosome чтобы молярное соотношение siRNA. Как способность инкапсуляции различных видов exosomes разные, мы настоятельно рекомендуем это быть оптимизированы на основе case-by-case. Однако инкапсуляции эффективность предлагаемых здесь всегда может быть параметром для выбора оптимального электропорации условий.
Кроме того совокупность малых интерферирующих РНК считается одним из наиболее распространенных проблем в электропорации. Доказано, что что электропорации может вызвать сильный совокупность малых интерферирующих РНК, что делает его еще труднее ввести exosomes. siRNA агрегаты часто ошибочно воспринимается как инкапсуляция интерферирующей РНК в exosome поэтому надлежащего контроля были использованы в этом исследовании, как формирование агрегатов siRNA неизбежны во время электропорации28. Процент инкапсуляции эффективности нашего метода очистки был рассчитан с помощью нормализованных значений для сведения к минимуму влияние из других источников, таких как фоновый шум, exosome и малых интерферирующих РНК агрегатов, влияющие на надежность данных. Основываясь на наших результатах, было незначительным siRNA агрегатов в управления образец т.е., используя electroporated и ООН electroporated siRNA.
Этот протокол успешно продемонстрировала инкапсуляции малых интерферирующих РНК в exosomes и их последующее внутриклеточных доставка малых интерферирующих РНК рака клеток в пробирке. Таким образом, различные виды exosomes от различных клеточных линий могут быть изолированы и характеризуется использованием предложенного протокола и впоследствии загружается с различных терапевтических siRNA для различных типов онкогенных цели чрезмерно выраженная в различных видов рака. Интересные приложения было бы исследовать эффективность доставки и поглощение siRNA с использованием различных комбинаций exosome источник цель клеток пара в пробирке. Это может быть переведено на животных моделей для оценки эффективности доставки и терапевтическую эффективность малых интерферирующих РНК инкапсулированное exosomes в vivo.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ф. н. Faruqu финансируется Агентством правительства Малайзии Rakyat Amanah Меджлиса (Мара). L. Сюй является получателем индивидуальных стипендий Мария Склодовская-Кюри (Horizon 2020) (H2020-МСКА-если-2016). K. т. Аль-Джамаль признает, финансирование от СИББН (BB/J008656/1) и Уэллком траст (WT103913). Авторы также хотели бы поблагодарить д-р Пол лаванды и д-р Дэвид страх (Департамент респираторной медицины и аллергии, Королевский колледж Лондона) для обеспечения electroporator.
Materials
| Material | |||
| Sterile Newborn Calf Serum Heat Inactivated | First Link | 08-05-850 | 500 ml |
| EMEM medium | Thermo Fisher Scientific | 11090081 | 500 ml |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | 100 ml |
| GlutaMax | Thermo Fisher Scientific | 35050-038 | 100 ml |
| Sucrose | Fisher Scientific | S/8600/60 | 1 kg |
| Deuterium oxide (D2O) | Sigma-Aldrich | 151882 | 250 g |
| 1X Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific | 10010015 | 500 ml |
| Glycine | VWR Chemicals | 101196X | 1 kg |
| Sepharose CL-2B | GE Healthcare Life Sciences | 17-0140-01 | 1 L; Particle Size 60 μm-200 μm |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300096 | 100 ml |
| Aldehyde/sulfate latex beads | Thermo Fisher Scientific | A37304 | 4% w/v, 4 µm, 15 ml |
| MicroBCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23235 | |
| CD81 antibody (APC) | Thermo Fisher Scientific | 17-0819-42 | Lot: E15950-104. RRID: AB_11150235. 1:10 dilution in 50 µl sample |
| CD81 isotype (APC) | Thermo Fisher Scientific | 17-4714-81 | Lot: 4291563. RRID: AB_763650. 1:10 dilution in 50 µl sample |
| CD9 antibody (FITC) | Thermo Fisher Scientific | 11-0098-41 | Lot: 4345870. RRID: AB_10698007. 1:10 dilution in 50 µl sample |
| CD9 isotype (FITC) | Thermo Fisher Scientific | 11-4714-41 | Lot: 4299784. RRID: AB_10598647. 1:10 dilution in 50 µl sample |
| CD63 antibody (PE) | Thermo Fisher Scientific | 12-0639-41 | Lot: 1930435. RRID: AB_2572564. 1:10 dilution in 50 µl sample |
| CD63 isotype (PE) | Thermo Fisher Scientific | 12-4714-81 | Lot: 1937696. RRID: AB_470059. 1:10 dilution in 50 µl sample |
| Atto655-siRNA | Eurogentec | SQ-SIRNA | (Labelled-S) UGC-GCU-ACG-AUC-GAC-GAU-G55; (Unlabelled-AS) CAU-CGU-CGA-UCG-UAG-CGC-A55. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm | Millipore | SLGP033RS | |
| CELLine AD1000 bioreactor flasks | Wheaton | WCL1000ad | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima XPN-80 | |
| Swing-out rotor | Beckman Coulter | SW45 Ti | |
| Fixed-angle rotor | Beckman Coulter | Type 70 Ti | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 355631 | Polycarbonate. Max. fill 32 ml |
| Ultracentrifuge bottles | Beckman Coulter | 355618 | Polycarbonate. Min. fill 16 ml, max. fill 25 ml |
| NanoSight | Malvern | LM10 | Software: NanoSight NTA v3.2 |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Plate reader | BMG Labtech | FLUOstar Omega | |
| Flow cytometry tubes | BD Biosciences, Falcon | 352052 | |
| Microfuge tubes | Starlab | S1615-5500 | 1.5 ml |
| Cell culture flasks | Fisher Scientific | 156499 | 75 cm2 |
| Transmission electron microscope | FEI Electron Optics | Philips CM 12 | with Tungsten filament and a Veleta – 2k × 2k side-mounted TEM CCD Camera (Olympus, Japan) |
| Amaxa Nucleofector I | Lonza | Nucleofector I | with Amaxa’s Nucleofector Kits |
| 24-well flat-bottom plates | Corning | Costar | |
| Blunt fill needle | BD Biosciences | 305180 | 18G x 1 1/2" (1.2 mm x 40 mm) |
| Glass pipettes | Fisher Scientific | 1156-6963 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | Composition | ||
| Normal medium | Eagle's Minimum Essential Medium supplemented with 10% foetal bovine serum (FBS), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax. | ||
| Exosome-depleted medium | Eagle's Minimum Essential Medium supplemented with 10% exosome-depleted FBS (see below), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax. | ||
| Exosome-depleted FBS | Subject FBS to ultracentrifugation at 100,000 g for 18 h at 4°C. The FBS supernatant post-centrifugation was collected and sterile-filtered using 0.22 µm filters. | ||
| 25% w/w sucrose cushion | Add 1.9 g (± 0.001 g) of sucrose in a universal tube, and top up with D2O until the weight reaches 7.6 g (± 0.001 g). This makes ~6ml of the 25% w/w sucrose cushion. | ||
| 3% FBS/PBS | Add 1.5 ml exosome-depleted FBS to 48.5 ml 1X PBS to prepare 50 ml of 3% FBS/PBS. | ||
| 100 µM BSA solution | Prepare 1mM BSA solution by adding 0.3325 g to 50 ml PBS. Make 1:10 dilution of this stock to obtain 100 µM BSA solution. Make 5-10 µl aliqouts of this 100 µM BSA solution (for single use) and store them at -20°C. All BSA solution should be stored at -20°C, and discard solutions that have undergone ≥2 freeze-thaw cycles. | ||
| 100 mM glycine solution | Add 0.375 g of glycine to 50 ml PBS to obtain 100 mM glycine solution, store at 4°C. | ||
| Citric acid buffer with EDTA | Mix 0.1954 g citric acid and 0.2087 g disodium phosphate in 50 mL of deionised water. Add EDTA to 0.1 mM. Adjust pH to 4.4. | ||
| Fixing solution | Prepare formaldehyde/glutaraldehyde, 2.5% (w/v) each in 0.1 M sodium cacodylate buffer, and adjust pH to 7.4. | ||
| Aqueous uranyl acetate | Prepare 25% (v/v) uranyl acetate in methanol. | ||
| 50% methanol/H2O | Mix methanol and H2O 1:1 (v/v). | ||
| SEC Column packed with Sepharose CL-2B | Dilute 37.5 ml Sepharose CL-2B resin with 12.5 ml PBS to obtain 75% Sepharose CL-2B solution. Pour the Sepharose CL-2B solution into a column of dimension 2.9 cm [H] x 1.3 cm [W]. Pour the Sepharose CL-2B to 3-4 mm above the stated height, and then press it down to the stated height with the filter for optimal packing. |
References
- Zitvogel, L., et al. Eradication of established murine tumors using a novel cell-free vaccine: dendritic cell derived exosomes. Nature Medicine. 4 (5), 594-600 (1998).
- Raffai, R., Li, K., Wong, D., Hong, J. Therapeutic control of systemic inflammation & atherosclerosis with ApoE-polarized macrophage exosomes. Atherosclerosis. , e5-e6 (2017).
- Masamune, A., et al. Exosomes derived from pancreatic cancer cells induce activation and profibrogenic activities in pancreatic stellate cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 71-77 (2018).
- Gangoda, L., et al. Proteomic Profiling of Exosomes Secreted by Breast Cancer Cells with Varying Metastatic Potential. Proteomics. 17 (23-24), 1600370 (2017).
- Wozniak, M., Peczek, L., Czernek, L., Düchler, M. Analysis of the miRNA Profiles of Melanoma Exosomes Derived Under Normoxic and Hypoxic Culture Conditions. Anticancer Research. 37 (12), 6779-6789 (2017).
- Salimu, J., et al. Dominant immunosuppression of dendritic cell function by prostate-cancer-derived exosomes. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1368823 (2017).
- Lankford, K. L., et al. Intravenously delivered mesenchymal stem cell-derived exosomes target M2-type macrophages in the injured spinal cord. PLoS ONE. 13 (1), e0190358 (2018).
- Khalyfa, A., et al. Plasma Exosomes and Improvements in Endothelial Function by Angiotensin 2 Type 1 Receptor or Cyclooxygenase 2 Blockade following Intermittent Hypoxia. Frontiers in Neurology. 8, 709 (2017).
- Manek, R., et al. Protein Biomarkers and Neuroproteomics Characterization of Microvesicles/Exosomes from Human Cerebrospinal Fluid Following Traumatic Brain Injury. Molecular Neurobiology. 55 (7), 6112-6128 (2018).
- Pathare, G., et al. Changes in V-ATPase subunits of human urinary exosomes reflect the renal response to acute acid/alkali loading and the defects in distal renal tubular acidosis. Kidney International. 93 (4), 871-880 (2018).
- Liao, Y., Du, X., Li, J., Lönnerdal, B. Human milk exosomes and their microRNAs survive digestion in vitro and are taken up by human intestinal cells. Molecular nutrition & food research. 61 (11), 1700082 (2017).
- Kim, J., et al. Cyclooxygenase-2 expression is induced by celecoxib treatment in lung cancer cells and is transferred to neighbor cells via exosomes. International Journal of Oncology. 52 (2), 613-620 (2017).
- Sterzenbach, U., et al. Engineered Exosomes as Vehicles for Biologically Active Proteins. Molecular Therapy. 25 (6), 1269-1278 (2018).
- Conigliaro, A., Fontana, S., Raimondo, S., Alessandro, R. Exosomes: Nanocarriers of Biological Messages. In Exosomes in Cardiovascular Diseases. 998, 23-43 (2017).
- El Andaloussi, S., Lakhal, S., Mäger, I., Wood, M. J. A. Exosomes for targeted siRNA delivery across biological barriers. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (3), 391-397 (2013).
- Simhadri, V. R., et al. Dendritic cells release HLA-B-associated transcript-3 positive exosomes to regulate natural killer function. PLoS ONE. 3 (10), e3377 (2008).
- Santos, J. C., et al. Exosome-mediated breast cancer chemoresistance via miR-155 transfer. Scientific Reports. 8 (1), 829-829 (2018).
- Hadla, M., et al. Exosomes increase the therapeutic index of doxorubicin in breast and ovarian cancer mouse models. Nanomedicine. 11 (18), 2431-2441 (2016).
- Smyth, T., et al. Biodistribution and delivery efficiency of unmodified tumor-derived exosomes. Journal of Controlled Release. 199, 145-155 (2015).
- Tian, Y., et al. A doxorubicin delivery platform using engineered natural membrane vesicle exosomes for targeted tumor therapy. Biomaterials. 35 (7), 2383-2390 (2014).
- Kim, M. S., et al. Engineering macrophage-derived exosomes for targeted paclitaxel delivery to pulmonary metastases: in vitro and in vivo evaluations. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 14 (1), 195-204 (2018).
- Bellavia, D., et al. Interleukin 3- receptor targeted exosomes inhibit in vitro and in vivo Chronic Myelogenous Leukemia cell growth. Theranostics. 7 (5), 1333-1345 (2017).
- Sun, D., et al. A novel nanoparticle drug delivery system: The anti-inflammatory activity of curcumin is enhanced when encapsulated in exosomes. Molecular Therapy. 18 (9), 1606-1614 (2010).
- Tian, T., et al. Surface functionalized exosomes as targeted drug delivery vehicles for cerebral ischemia therapy. Biomaterials. 150, 137-149 (2017).
- Zhuang, X., et al. Treatment of brain inflammatory diseases by delivering exosome encapsulated anti-inflammatory drugs from the nasal region to the brain. Molecular Therapy. 19 (10), 1769-1779 (2011).
- Iessi, E., et al. Acridine Orange/exosomes increase the delivery and the effectiveness of Acridine Orange in human melanoma cells: A new prototype for theranostics of tumors. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 32 (1), 648-657 (2017).
- Aqil, F., et al. Exosomal delivery of berry anthocyanidins for the management of ovarian cancer. Food & Function. 8 (11), 4100-4107 (2017).
- Shtam, T. A., et al. Exosomes are natural carriers of exogenous siRNA to human cells in vitro. Cell Communication and Signaling. 11 (1), 1-10 (2013).
- Wahlgren, J., et al. Plasma exosomes can deliver exogenous short interfering RNA to monocytes and lymphocytes. Nucleic Acids Research. 40 (17), e130-e130 (2012).
- Yang, J., Zhang, X., Chen, X., Wang, L., Yang, G. Exosome Mediated Delivery of miR-124 Promotes Neurogenesis after Ischemia. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 7, 278-287 (2017).
- Alvarez-Erviti, L., et al. Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes. Nature Biotechnology. 29 (4), 341-345 (2011).
- Wiklander, O. P. B., et al. Extracellular vesicle in vivo biodistribution is determined by cell source, route of administration and targeting. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 1-13 (2015).
- Varga, Z., et al. Radiolabeling of Extracellular Vesicles with 99m Tc for Quantitative In Vivo Imaging Studies. Cancer Biotherapy and Radiopharmaceuticals. 31 (5), 168-173 (2016).
- Smyth, T. J., Redzic, J. S., Graner, M. W., Anchordoquy, T. J. Examination of the specificity of tumor cell derived exosomes with tumor cells in vitro. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1838 (11), 2954-2965 (2014).
- Boing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 23430 (2014).
- Sharma, P., et al. Immunoaffinity-based isolation of melanoma cell-derived exosomes from plasma of patients with melanoma. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1435138 (2018).
- Clayton, A., et al. Analysis of antigen presenting cell derived exosomes, based on immuno-magnetic isolation and flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 247 (1), 163-174 (2001).
- Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. Exosome Isolation for Proteomic Analyses and RNA Profiling. In Serum/Plasma Proteomics: Methods and Protocols. , 235-246 (2011).
- Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney International. 82 (9), 1024-1032 (2012).
- Mitchell, J. P., Mason, M. D., Tabi, Z., Clayton, A. Increased exosome production from tumour cell cultures using the Integra CELLine Culture System. Journal of Immunological Methods. 335 (1-2), 98-105 (2008).
- Webber, J., Clayton, A. How pure are your vesicles?. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 1-6 (2013).
- Chiou, N. -. T., Ansel, K. M. Improved exosome isolation by sucrose gradient fractionation of ultracentrifuged crude exosome pellets. Nature Protocol Exchange. , (2016).
