JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Cancer Research

Voorbereiding van Exosomes van siRNA levering aan kankercellen

Published: December 05, 2018
doi:
10.3791/58814
, ,
1Institute of Pharmaceutical Science,King’s College London

Summary

Een exosome is een nieuwe generatie van drug delivery vervoerders. Wij opgericht een protocol exosome isolatie met een hoge opbrengst en zuiverheid voor siRNA levering. Wij ook ingekapseld fluorescently geëtiketteerde aspecifieke siRNA in exosomes en onderzocht de cellulaire opname van siRNA-geladen exosomes in kankercellen.

Abstract

Extracellulaire blaasjes, in bepaalde exosomes, hebben onlangs verworven belang als roman drug levering vectoren als gevolg van hun biologische oorsprong, overvloed en intrinsieke vermogen in intercellulaire levering van verschillende biomoleculen. Dit werk stelt een protocol van de isolatie om hoge opbrengst en de hoge zuiverheid van exosomes voor siRNA levering te bereiken. Menselijke embryonale nier cellen (cellen HEK-293) worden gekweekt in bioreactor kolven en de cultuur supernatant (visualisering geconditioneerde medium genoemd) wordt geoogst op een wekelijkse basis te maken voor de verrijking van HEK-293 exosomes. Het geconditioneerde medium (CM) wordt vooraf onthaard dode cellen en cellulaire puin door differentiële centrifugeren en is onderworpen aan ultracentrifugatie op een kussen van sacharose gevolgd door een wassen stap, voor het verzamelen van de exosomes. Geïsoleerde HEK-293-exosomes worden gekenmerkt voor opbrengst, morfologie en exosomal marker expressie door nanoparticle tracking analyse, kwantificering van eiwit, elektronenmicroscopie en stroom cytometry, respectievelijk. Klein Mengend RNA (siRNA), fluorescently aangeduid met Atto655, in exosomes wordt geladen door electroporation en overtollige siRNA wordt verwijderd door filtratie van de gel. Cel opname in kankercellen van PANC-1, na 24 uur incuberen bij 37 ° C, wordt bevestigd door stroom cytometry. HEK-293 exosomes zijn 107.0 ± 8.2 nm in diameter. De exosome-opbrengst en deeltje-naar-eiwit ratio (p) verhouding van deze objecttypen zijn respectievelijk 6,99 ± 0,22 × 1012 deeltje/mL en µg/8.3 ± 1,7 × 1010 deeltje. De efficiëntie van de inkapseling van siRNA in exosomes is ~ 10-20%. Veertig procent van de cellen tonen positieve signalen voor Atto655 bij 24 h na incubatie. Kortom, biedt exosome isolatie door ultracentrifugatie op sacharose kussen een combinatie van goede opbrengst en zuiverheid. siRNA zou met succes is geladen in het exosomes door electroporation en vervolgens afgeleverd in kankercellen in vitro. Dit protocol biedt een standaardprocedure voor het ontwikkelen van siRNA-geladen exosomes voor efficiënte levering aan kankercellen.

Introduction

Exosomes zijn een subtype van extracellulaire blaasjes (EV) variërend van 50-200 nm in diameter, uitgescheiden door verschillende celtypes zoals immuuncellen1,2, kanker cellen3,4,5, 6 en7van de cellen van de stam. Exosomes zijn ook aangetoond in verschillende fysiologische vloeistoffen8,9,10,11aanwezig te zijn. De combinatie van de inherente vermogen van exosomes om verschillende biomoleculen (b.v., RNA en eiwitten)12,–13,14 te voeren en de effectieve levering van deze biomoleculen in ontvangende cellen 15 , 16 , 17 belangstelling voor hun potentieel als nano-schaal drug delivery vectoren. Verschillende kleine moleculen die dienen als anti-kanker en anti-inflammatoire drugs zijn aangetoond worden met succes is geladen in het exosomes en geleverd aan target cellen18,19,20, 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. interessant, nucleic zuren zoals siRNA28,29 en microRNA30 zijn ook met succes is geladen in het exosomes via electroporation en geleverd aan de doelcellen.

Onlangs, RNA interferentie (RNAi) via Klein Mengend RNA (siRNA) meer belangstelling heeft opgedaan als de voorkeur mechanisme in gen zwijgen als gevolg van de hoge specificiteit, potent effect, minimale bijwerkingen en gemak van siRNA synthese28, 29. siRNAs zijn double-stranded RNA moleculen variërend van 19 tot 25 nucleotiden in lengte die triggers sequentie-specifieke katalytische mRNA knockdown. Vanwege de grote moleculair gewicht en polyan natuur is passieve opname van naakte siRNA in cellen belemmerd28,29. Het is ook niet mogelijk voor naakte siRNA worden geïnjecteerd in de systemische circulatie als gevolg van de snelle afbraak door plasma nucleasen31. Dus, inkapseling van siRNA in een nanocarrier zou de steun de doeltreffende uitvoering en toepassing van siRNA in de doelcellen.

Exosomes zijn een ideaal systeem voor de inkapseling van siRNA zoals de structuur uit een holle, waterige kern omgeven door een fosfolipide dubbelgelaagde bestaat. Exosomes niet alleen goede stabiliteit in het bloed hebben maar ook natuurlijke targeting eigenschappen te leveren functionele RNA in cellen32hebben. De studie uitgevoerd door Alvarez-Erviti et al. met succes bewezen effectieve levering van siRNA aan de hersenen van muizen met behulp van speciaal ontworpen exosomes met vrijwel geen complicaties31. Het hypothetische is dat exosome gebaseerde therapie relatief veiliger dan andere therapieën is zoals exosomes worden niet gerepliceerd endogeen en cellen zou daarom geen metastatische eigenschappen15vertonen.

Verschillende methoden hebben gemeld met succes isoleren exosomes van celkweek of fysiologische vloeistoffen. De meest populaire methode gebruikt ultracentrifugatie om pellet exosomes vanaf het begin materiële31,32,33. Deze methode kunt u bijvoorbeeld heel hard op exosomes en meestal co precipitaten eiwitten uit het monster. Ultracentrifugatie te combineren met een dichtheid gebaseerde scheiding zoals sucrose verlopen is steeds vaker voor, ter beperking van verontreiniging van de eiwitten en niet-exosomal in de geïsoleerde exosomes19,34. Grootte-uitsluiting chromatography (SEC) scheiding van exosomes van andere soorten extracellulaire blaasjes (EV) kunt door grootte en kan ook resulteren in besmetting van de minimale eiwit maar wordt beperkt door een kleine hoeveelheid grondstof kan verwerken35, 36. Immunoaffinity opname in beslag wordt kralen bekleed met antilichamen die zich binden aan de exosomal oppervlakte-eiwitten zoals tetraspanins of andere cel-specifieke marker waarmee specifieke inname van exosomes in plaats van EVs of andere proteïnen, alsook subpopulatie van isoleren exosomes van hele monsters, maar opnieuw wordt beperkt door de hoeveelheid grondstof en dure36,37is. Polymeer gebaseerde precipitatie van exosomes gebruikt om zijn ook populair, maar aangezien het een nogal ruwe neerslag, het leidt tot een hogere niet-exosomal blaasje en eiwit besmetting38,39.

Electroporation is gemeld voor de inefficiëntie als een methode voor het laden van exosomes met siRNA als gevolg van eiwit aggregatie15,28,31. Transfectie gebaseerde benaderingen werden gedemonstreerd dat efficiëntie en eiwitstabiliteit beter te laden, maar is ongewenst vanwege de giftigheid en de bijwerkingen van transfectie agenten in cellulaire gen expressie28wijzigen. Electroporation heeft dus meer wijd gebruikt in siRNA laden in exosomes zoals het is een veiliger methode. Een geoptimaliseerde encapsulationmethode moet echter worden vastgesteld voor het leveren van voldoende hoeveelheden van siRNA naar de doelsite voor een krachtige gene knockdown.

Hier stellen wij voor het protocol dat gebruikt dichtheid gebaseerde ultracentrifugatie op gewoon een enkele 25% (w/w) sacharose kussen bereid in deuteriumoxide, in plaats van een verloop van sacharose dichtheid in de isolatie van een exosome. Dit is een voordelige methode die omzeilt de moeizame dichtheid kleurovergang voorbereiding en verwerking van grote hoeveelheden grondstof toestaat, maar resulteert in intacte exosomes van hoge opbrengst en zuiverheid geschikt voor latere laden met siRNA. Fluorescerende Atto655-geconjugeerde aspecifieke siRNA was in menselijke embryonale nier cellen (cellen HEK-293) afgeleid exosomes via electroporation geladen en geleverd aan menselijke alvleesklier adenocarcinoom (PANC-1) kankercellen in vitro.

Protocol

1. de celcultuur in een Bioreactor kolf Figuur 1: cultuur van cellen in de kolf van de bioreactor voor de productie van exosome. (A) vereenvoudigd anatomie van de bioreactor kolf. (B) starten cultuur in de bioreactor kolf. Zie Tabel van materialen voor de samenstelling van de normale en exosome-verarmd middellange (C) opruiming geconditioneerd-medium (CM) en het onderhoud van de cultuur in de bioreactor kolf. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. HEK-293 cellen in normale medium cultuur (Zie Tabel van materialen; 5% CO2, 37 ° C) en ze uitbreiden naar 4 x T75 kolven (tot 90% heuvels). Natte het membraan van de bioreactor kolf door toevoeging van 50-100 mL van normale medium in het middelgrote reservoir van de bioreactor kolf. Alle HEK-293-cellen van de 4 x T75 en resuspendeer verzamelen ze in 15 mL exosome-verarmd voedingsbodem (Zie Tabel van materialen). Toevoegen van de celsuspensie HEK-293 tot het compartiment van de cel van de bioreactor kolf met behulp van een spuit van 20 mL verbonden met een botte vulling naald (Zie Tabel van materialen), met zorg voor het verwijderen van een zeepbel die zou hebben gevormd. Vul het middellange reservoir van de bioreactor kolf met normale medium tot 500 mL en houd de kolf in de incubator (5% CO2, 37 ° C) voor een week. 2. de geconditioneerde Medium (CM) oogsten uit de Bioreactor kolf Na 1 week, negeren alle het medium in het middelgrote reservoir van de bioreactor kolf. Verwijder alle het medium in de cel compartiment (dat wil zeggen, de CM) met behulp van een spuit van 20 mL verbonden met een botte vulling naald. Voeg 50-100 mL van normale medium naar het middelgrote reservoir. Voeg toe 15 mL exosome-verarmd middellange tot het compartiment van de cel door verwijderen van het oude medium en het toevoegen van verse exosome-verarmd medium gebruik een 20 mL spuit verbonden met een botte vulling naald. Vul het middellange reservoir van de bioreactor kolf met normale medium tot 500 mL en houd de kolf in de incubator (5% CO2, 37 ° C) voor een week.Opmerking: De cultuur kan worden voortgezet voor meer dan een jaar. Voor stap 2.2, de CM vanaf de eerste oogst zal niet worden gebruikt voor isolatie van de exosome en wordt verwijderd. Voor de 2nd en latere oogst, worden de CM gehouden voor exosome isolatie. 3. Exosome isolatie op een kussen van sacharose Figuur 2: isolatie en karakterisatie van exosomes. (A) pre-ontruimt geoogste geconditioneerde medium (CM) uit dode cellen en cel puin. (B) exosomes van CM naar sacharose kussen te isoleren. (C) wassen stap voor verwijderen van sacharose en contaminerende eiwitten. (D) geïsoleerde exosomes werden vervolgens onderworpen aan fysisch-chemische, biochemische en morfologische karakterisering. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Vooraf schakelt als volgt de CM (uit stap 2.2) door differentiële centrifugeren en filtratie. Centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Breng de bovendrijvende substantie in een nieuwe buis en gooi de pellet. Herhaal deze centrifugeren stap eens te meer het supernatant herstellen en de pellet te verwijderen. Centrifugeer het supernatant uit stap 3.1.1 bij 2.000 x g gedurende 15 minuten en 4 ° C en vervolgens negeren pellet. Filtreer de herstelde supernatant eenmaal door 0,22 µm filters. Tijdens de pre-ontruimt, bereiden u 25% (w/w) sacharoseoplossing in deuteriumoxide door nauwkeurig wegen 1.9 g (± 0,001 g) van sacharose in een universele buis, en vervolgens bijvullen met deuteriumoxide totdat het gewicht 7.6 g (± 0,001 g bereikt). Vul een ultracentrifuge tube (Zie Tabel van materialen) met vooraf gewiste CM. make-up van de CM tot 22,5 mL met 0,22 µm-gefilterd 22.5 mL PBS als het huidige volume is minder dan die. Plaats een glas (Zie Tabel van materialen) Pipetteer in de buis en erdoor, voeg 3 mL van sacharoseoplossing zodat de oplossing vormt een aparte laag onder de CM. Zorgvuldig plaats de buis bevat gelaagde CM/sacharoseoplossing in de emmer van de rotor van een swing-out (Zie Tabel of Materials), en veilig de emmer in de rotor. De rotor in de ultracentrifuge plaatsen (Zie Tabel van materialen) en spin op 100.000 x g gedurende 1,5 uur bij 4 ° C. Verzamelen van 2 mL van de sucrose-laag en voeg dit toe aan een ultracentrifuge fles (Zie Tabel van materialen) met 20 mL PBS gefilterd voor een wassen stap. Plaatsen van de buizen in de rotor van een vaste-hoek (Zie Tabel van materialen) en spin op 100.000 x g gedurende 1,5 uur bij 4 ° C. Verwijder het supernatant serologische Pipetteer 10 mL voorzichtig en resuspendeer de pellet met 400 µL gefilterd PBS. Houd deze exosome voorraad bij 4 ° C of -80 ° C voor korte en lange termijn opslag respectievelijk. 4. karakterisering van Exosome grootte en opbrengst Nanoparticle bijhouden analyse (NTA) Maak 1:1, 000-1:50, 000 verdunningen van de exosome voorraad in 1 mL (minimum 750 µL) volume teneinde 20-80 deeltjes in het kader van de weergave van de NTA instrument (Zie Tabel van materialen) display. Injecteren van de verdunde exosome voorraad in de NTA instrument monsterkamer met behulp van een spuit van 1 mL en voeg de temperatuurvoeler voor een thermometer in de inlaat van de sonde van de temperatuur. Instellen van de NTA-software (Zie Tabel of Materials) voor de registratie als volgt: 3 standaardmaten, 30 s elke, handmatige temperatuur optie uitgeschakeld; en voer de verdunningsfactor onder het tabblad Geavanceerd . Het niveau van de camera instellen tot en met 13 en het vastleggen script uitvoeren op de software van de NTA, injecteren van een verse partij van monster en het invoeren van de temperatuur van de monsterkamer desgevraagd na elke lezing. Stel de drempel tot en met 4 voor de daaropvolgende analyse deel en Let op de gemiddelde modale grootte en deeltje concentratie van de voorraad van de exosome van de metingen. 5. karakterisering van Exosome zuiverheid Particle: eiwit verhouding bepaling Maatregel het eiwitgehalte van de voorraad van de exosome door een bicinchoninic zuur (BCA) eiwit assay kit (Zie Tabel van materialen) als volgt. Bereiden de omschreven normen. De standaard van de hoogste concentratie (500 µg/mL) voor te bereiden door 45 µL van BSA stockoplossing (2 mg/mL – waarin de assay kit) toe te voegen aan een microcentrifuge buis, en maken het tot 180 µL met PBS. Vul 8 microcentrifuge buizen met 90 µL van PBS. Maken van de seriële verdunningen (factor: 0,5) door te nemen 90 µL van de hoogste BSA standaard en het toevoegen van deze in de 1st microcentrifuge tube met PBS (mix goed), dan 90 µL van deze buis en het toe te voegen in de 2nd microcentrifuge buis. Herhaal dit tot de 7e microcentrifuge buis. De 8e buis zullen alleen PBS (dat wil zeggen, de blanco: 0 µg Mo/mL). De exosome monsters bereid door verdunning 1:2 monsters met PBS in een totaal volume van 90 µL (45 µL van monster, 45 µL van PBS). De BCA werken reagens mix voor te bereiden. Bereken het totale volume van BCA werken reagens mix nodig (50 µL per putje, dubbele, met inbegrip van de normen). Meng de individuele BCA reagentia volgens de volgende verhouding: 25 delen reagens A: 24 delen reagens B: 1 deel reagens C. Het uitvoeren van de test en analyse. Voeg 40 µL van elk monster van het standaard en exosome bereid boven in een putje van een 96-wells-plaat (duplicaten voor elke standaard en monster).Opmerking: Aangezien dit een colorimetrische bepaling, juiste pipetting techniek is cruciaal om accurate resultaten te bereiken. Pipetten wijzigen na het toevoegen van elke standaard/monster repliceren in elk van de putten Voeg 50 µL van de bepaling van de eiwitten werken reagens mix in elk putje en Incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 30 minuten.Opmerking: Om te minimaliseren van afwijkingen tussen de duplo’s, voeg de eiwitreagens assay werken in de 1st repliceren van een standaard/monster, gevolgd door het repliceren van de 2nd van dezelfde monster/norm, voordat u deze toevoegt aan de 1st repliceren van een ander monster/standaard. Meet de extinctie op 562 nm op de afleesapparaat (Zie Tabel van materialen). Uitzetten van een standaard curve van de waarden van de extinctie van de normen, en sporten van de eiwitconcentratie in elk monster met behulp van de vergelijking van de curve. Bereken de verhouding deeltjes: eiwit door het verdelen van de opbrengst van de exosome eerder verkregen met de eiwitconcentratie van de voorraad van de exosome gemeten boven. 6. karakterisering van Exosomal Marker expressie door Stroom Cytometry Incubeer 40 µL van exosomes (≥1×1011 deeltjes/mL) met 10 µL van latex kralen aldehyde/sulfaat (onverdund uit voorraad) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (RT). Voeg 5 µL van 100 µM BSA oplossing (Zie Tabel van materialen) aan het exosome-kraal-mengsel te bereiken een eindconcentratie van 10 mM en incubeer gedurende 15 minuten op RT. Voeg 1 mL PBS toe en incubeer gedurende 75 min op RT in een microcentrifuge buis met milde agitatie op een rockende shaker (~ 150 rpm). Centrifugeer de schorsing bij 580 x g gedurende 5 min op RT en verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet met 1 mL van 100 mM glycine oplossing (Zie Tabel van materialen) en incubeer gedurende 30 min op RT. Centrifugeren van de suspensie voor 5 min op 580 x g. negeren het supernatant en resuspendeer de pellet met 1 mL 3% FBS/PBS (Zie Tabel van materialen). Herhaal deze stap wassen en resuspendeer de pellet in 350 µL van 3% FBS/PBS. Verdeel de schorsing in 7 buizen, elk met 50 µL van schorsing en hen met fluorophore-geconjugeerde anti-CD81, anti-CD9 en anti-CD63 antilichamen en hun overeenkomstige isotype-besturingselementen uit te broeden (1:10 verdunning), respectievelijk, voor 45 min bij 4 ° C. Houd 1 van de buisjes als een onbevlekt controle maar de dezelfde verwerking ondergaan. Voeg vervolgens 1 mL van 3% FBS/PBS aan elk tube, gedurende 5 min op 580 x g centrifugeren en verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet met 200-400 µL van 3% FBS/PBS en analyseren van het monster op de stroom cytometer (Zie Tabel van materialen) onder de daartoe geëigende kanalen. 7. karakterisering van Exosome morfologie door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) Fix exosome waterige dispersies in goede concentraties zoals 1010 p/mL bij de vaststelling van de oplossing (Zie Tabel van materialen) gedurende 15 minuten. Plaats de monsters op 300 mesh koolstof gecoat koper rasters en laat lucht droog. Negatief vlek de monsters met 0,22 µm-gefilterd waterige uranyl-acetaat (Zie Tabel of Materials) voor 4 min, gevolgd door twee 50% methanol/H2O wassen (Zie Tabel van materialen). Lucht drogen het monster. Observeren van de monsters onder TEM (Zie Tabel van materialen). De versnellende spanning vastgesteldop 80 kV en de grootte van de plek bij 2. Gebruik objectieve diafragma met alle monsters. 8. siRNA inkapseling in Exosomes door Electroporation Vooraf de electroporation cuvette chill (Zie Tabel van materialen) op ijs voor 30 min vóór electroporation. Mix-7.0 µg exosomes (32 µL uit 7 x 1012 p/mL voorraad in PBS) met 0,33 µg siRNA (12 µL uit 2 µM voorraad in RNase-gratis water) in de microcentrifuge buis. Vul het volume tot 150 µL met citroenzuur buffer (Zie Tabel van materialen). De exosome siRNA molaire ratio is in dit geval 1:60. Breng het mengsel naar electroporation cuvette. Cap de meetcel en plaatst u deze in de houder van de meetcel van de electroporator (Zie Tabel van materialen). Het muiswiel draaien 180° met de klok mee.Opmerking: Het wiel moet ingeschakeld zijn volledig naar de vergrendelde positie, om de cuvette contact opnemen met de elektroden. Selecteer het gewenste electroporation programma (bijvoorbeeld X-01, X-05, A-20, T-20, T-30, etc.) en electroporation starten door op de knop Start te drukken.Opmerking: Een succesvolle puls wordt aangegeven door het tonen van “OK” op het display. Eenmaal electroporated, verwijderen van de Cuvet na weg terug het wiel 180° linksom. Het intrekken van het monster van de Cuvet met de plastic pipet voor verdere verwerking. 9. verwijdering van gratis siRNA Using Size Exclusion Chromatography (SEC) De kolom SEC equilibreer (2.9 cm [H] x 1.3 cm [W]; Zie Tabel van materialen) door het passeren van 3,5 mL gefilterde PBS tweemaal. Los 150 μl van electroporated monster in 350 μL van gefilterde PBS en dit overbrengen in de kolom van de SEC om de gratis siRNA verwijdering uitvoeren. De eerste 500 μL breuk die geëlueerd verzamelen uit de kolom (F0). Voeg 500 μL van gefilterde PBS toe aan de kolom en verzamel de volgende 500 μL breuk (F1). Herhaal de bovengenoemde stap tot een totaal van 10 x 500 μL breuken (tot F9) wordt opgehaald. F1 en F2 moet bevatten de exosomes siRNA ingekapseld. Was de kolom met gefilterde PBS (tweemaal, minstens) te verwijderen van elk monster residuen. 10. in Vitro opname van siRNA-geladen Exosomes in cellen van de PANC-1 Zaad PANC-1 cellen in 24-well forfaitaire beneden platen (Zie Tabel van materialen) bij een dichtheid van 50.000 cellen per goed 24 h vóór de opname bestuderen en Incubeer de cellen in de incubator (5% CO2, 37 ° C). Electroporate HEK-293 exosomes (7.0 μg) met Atto655-siRNA (0.33 μg) per stap 8. Zuiveren van electroporated exosome per stap 9 en resuspendeer in 100 μl van PBS. 50 μl van de electroporated exosomes aan PANC-1 cel toevoegen en Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 voor 4 uur. Verzamelen cellen na incubatie. Spoel de cellen met 1 mL steriele PBS en resuspendeer in 200 μL van PBS in polystyreen ronde onderkant buis (Zie Tabel van materialen). Analyseren van cellen door stroom cytometer (Zie Tabel van materialen) met 10.000 gebeurtenissen verworven per monster.Opmerking: VN-electroporated exosome-siRNA mengsel monsters en onbehandelde cellen met gefilterde PBS werden gebruikt als besturingselementen.

Representative Results

De fysisch-chemische karakterisering van exosomes van HEK-293 cellen (HEK-293 Exo) geïsoleerd worden samengevat in tabel 1. De grootte gemeten met behulp van de nanoparticle voor het bijhouden van analyse (NTA) instrument was 107.0 ± 8.2 nm. Opbrengst van de Exosome van het HEK-293-cellen, ook geanalyseerd met behulp van het instrument van de NTA, was 6,99 ± 0,22 x 1012 p/mL van ~ 24 mL CM (verkregen uit 2 rondes van de oogst). Zuiverheid van de HEK-293 Exo beoordeeld door het berekenen van het deeltje-naar-eiwitverhouding (p) was 8.3 ± 1,7 × 1010 p/µg. De grootteverdeling van geïsoleerde HEK-293 Exo is afgebeeld in figuur 3A. Morfologische analyse met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) toonden de HEK-293 Exo bolvormige structuren iets boven 100 nm in grootte (figuur 3B). Dit resultaat overeenstemmen met die van de NTA meting (figuur 3A). De geïsoleerde HEK-293 Exo waren positief voor CD81, CD9 en CD63, welke canonieke markeringen gebruikt zijn voor het identificeren van blaasjes als exosomes (Figuur 3 c). Voor zuivering van exosomes met behulp van grootte uitsluiting chromatografie (Figuur 4), werd het percentage herstel van exosomes berekend door de totale exosome deeltje nummer teruggevonden in de 10 breuken verzameld (F0-F9) met de eerste exosome deeltje dat wordt gebruikt, terwijl het percentage herstel van siRNA werd berekend door de intensiteit van de totale fluorescentie verkregen F3, F4 en F5 met de intensiteit van de totale fluorescentie verkregen van alle 10 breuken verzameld. Het herstel van exosome en siRNA na zuivering werd berekend als 75,0% en 80.4%, respectievelijk. De efficiëntie van de inkapseling van siRNA in exosomes werd ~ 10-20%, berekend op basis van de siRNA standaard curve opgericht (figuur 4C). Kwalitatieve analyse van in vitro opname van exosomes geladen met de fluorescerende Atto655-siRNA door stroom cytometry toonde aan dat cellen van de PANC-1 behandeld met siRNA ingekapseld exosomes geregistreerd de grootste verschuiving in fluorescentie signaal (figuur 5A) . PANC-1 cellen behandeld met exosomes siRNA ingekapseld opgenomen een hoger percentage van de bevolking gunstig zijn voor het Atto655 signaal (droeg 39,4%) in vergelijking met die behandeld met gelost exosomes en siRNA mengsel (0,56%), die de opmerking hierboven ( bevestigd Figuur 5B). De mate van cellulaire opname van siRNA (uitgedrukt als het verschil van de vouw in gemiddelde fluorescentie intensiteitswaarden (MFI’s) dan die van onbehandeld cellen) werd ook waargenomen worden aanzienlijk hoger in de cellen van de PANC-1 behandeld met siRNA ingekapseld exosomes (MFI vouwen verschil = 5.1) in vergelijking met die behandeld met het exosome-siRNA-mengsel (MFI vouwen verschil = 1.1) (figuur 5C). Deze waarnemingen blijkt dat de exosomes van siRNA ingekapseld door de cellen van de PANC-1 waren geïnternaliseerd en dat zij effectief geleverd siRNA intracellulair. Figuur 3: biochemische en morfologie analyse van HEK-293 exosomes. (A) het formaat van de verdeling van HEK-293-exosomes met behulp van Nanoparticle Tracking analyse (NTA). De curve toont een bovenliggende histogram van 3 verschillende vangt 30 s tussenpoos met rode gebieden ter aanduiding van de standaardafwijking tussen metingen (n = 3). (B) transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) beelden van de naïeve HEK-293 exosomes. Schaal bar: 100 nm. (C) detecteren van merkers van de exosomal CD81, CD9 en CD63 met behulp van stroom cytometry op HEK-293 exosomes. Exosomes waren gekoppeld aan aldehyde/sulfaat latex kralen vóór detectie. Exosome-kralen complex werden vervolgens gekleurd met fluorophore-geconjugeerde anti-CD81, anti-CD9 en anti-CD63 antilichamen. Mate van expressie van de markers worden uitgedrukt als het verschil van de vouw in mediane fluorescentie intensiteitswaarden (MFI’s) dan die van het besturingselement (exosome-kralen complex gekleurd met de overeenkomstige isotype). Waarden worden uitgedrukt als bedoel ± SD, waar n = 3. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 4: Exosome zuivering post-electroporation. (A) elutie profielen (F0-F9) van Atto655-siRNA en electroporated exosomes met behulp van grootte uitsluiting chormatography. (B) NTA analyse van zowel de Atto655-siRNA en de exosome van F0 tot F9 met behulp van grootte uitsluiting chormatography. (C) de kalibratie curve van Atto655 geëtiketteerd siRNA. Intensiteit van de fluorescentie werden verkregen door afleesapparaat op Ex / Em: 640-10/680 nm; 2800 krijgen. Waarden worden uitgedrukt als bedoel ± SD (n = 3). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 5: cellulaire opname van siRNA ingekapseld in cellen van de PANC-1 op 4 h. exosomes (A) histogrammen cellulaire opname gelost exosomes + siRNA mengsel en siRNA ingekapseld exosomes vergelijken. (B) de vergelijking van de opname van gelost exosomes + siRNA mengsel 4 uur bij kleurcorrectie perceel. (C) de vouw verschil in gemiddelde fluorescentie (MFI) intensiteitswaarden van de monsters getest vergeleken met die van onbehandeld cellen. Waarden worden uitgedrukt als bedoel ± SD, waar n = 3. P < 0,001. NS: niet significant. One-way ANOVA werd gebruikt voor statistische analyse. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Exosome Grootte1,2(nm) Opbrengst1,2,3(p/mL) [Eiwit] 2,4(µg/mL) Deeltje-naar-eiwit (p) verhouding5(p/µg) HEK-293 107.0 ± 8.2 6,99 ± 0,22 x 1012 84.3 ± 9,8 8.3 ± 1,7 x 1010  1 gemeten met behulp van nanoparticle analyse (NTA instrument) bijhouden2 waarden worden uitgedrukt als bedoel ± SD, waar n = 33 opbrengst is verkregen door cel-geconditioneerd medium gebundeld uit 2 rondes van het oogsten van bioreactor kolven (~ 24 mL)4 gemeten met behulp van een eiwit assay kit5 waarde verkregen met behulp van de formule: p ratio = opbrengst / [eiwit] Tabel 1: Fysisch-chemische karakterisatie van exosomes.

Discussion

Het verkrijgen van een fatsoenlijke exosome rendement van gekweekte cellen, is die zijn genoeg voor verschillende rondes van in vitro of in vivo studies, nog steeds een uitdaging. Volgens de fabrikant, waren de bioreactor kolven bedoeld voor de productie van antilichamen en eiwitten met hoge opbrengst van cultuur van verschillende vereeuwigd cellijnen. Hierdoor zijn de cellen die moeten voortdurend verrijken het kweekmedium met het gewenste product, wat resulteert in een geconcentreerde geconditioneerde medium (CM) in de cel-compartiment. Theoretisch, hetzelfde concept zou nuttig zijn in exosome productie van verschillende cellijnen, en inderdaad het kweken van deze cellen in de bioreactor kolven bleek aanzienlijk te verhogen het exosome rendement40. De grote middellange reservoir voortdurend levert nutriënten aan en verwijdert afvalstoffen uit het compartiment van de cel door een semi-permeabel membraan van 10 kDa, waardoor langdurige cultuur zonder een grote hoeveelheid medium in contact met de cellen, of regelmatige kolven wijzigen, waardoor uiteindelijk de totale kosten en de arbeid van hoge-schaal exosome productie40kunnen besparen. Het werd ook aangetoond dat de morfologie, fenotype, evenals de immunomodulerende functies van exosomes cellen op lange termijn bioreactor kolven culturen vergelijkbaar met die afkomstig zijn uit cellen gekweekt in reguliere 75 cm2 flacons40 zijngeïsoleerd. Cultuur van andere vereeuwigd cellijnen als exosome bronnen in de kolf bioreactor zou daarom helpen verhogen van de opbrengst van hun exosome met behoud van hun integriteit en functie. Deze vorm van cultuur is echter niet van toepassing op primaire cellen met beperkte divisie cycli, en degenen die niet kunnen worden gekweekt in een hoge dichtheid.

Aangezien oogst van het GH wordt wekelijks gedaan, en de cellen in cultuur nooit waren gepasseerd, kan worden aangenomen dat de cellen in de bioreactor kolf niet in een enkelgelaagde zoals de regelmatige celkweek groeien. Ze zijn waarschijnlijk te vormen clusters met necrotisch centra, of gewoon loskoppelen van het oppervlak en sterven wanneer de cellen ook confluente voor een enkelgelaagde. Visueel onderzoek van de afdeling van de cel van de bioreactor kolf is niet mogelijk om te bevestigen deze veronderstelling, maar ook blijkt uit het grote aantal dode cellen verkregen tijdens de CM oogsten. Regelmatig verwijderen van slecht aanhangend en niet-levensvatbare cellen uit de bioreactor kolf kunt voorkomen dat de opbouw van materialen op de semi-permeabel membraan dat gevolgen voor de uitwisseling van gas, voedingsstoffen en afvalstoffen tussen de cel compartiment en het medium hebben kan reservoir, waardoor langdurige cultuur in de bioreactor kolven voor > 6 maanden40. In dit verband, deze niet-regelmatigheid van celgroei in de bioreactor kolven is ideaal als we speculeren dat het bootst de werkelijke conditie van tumor groei in vivo nauwer dan de conventionele enkelgelaagde celcultuur, en het is te hopen dat de exosomes geproduceerd door de kanker cellen in de kolf bioreactor zou meer vergelijkbaar is met die uitgescheiden door tumoren in vivo. Dit zou met name zinvol zijn studies op zoek naar de rol van tumor afkomstige exosomes in de progressie van de tumorpathologie. Tumor-afgeleide exosomes zijn gemeld bij intrinsiek en bij voorkeur thuis aan hun weefsel van oorsprong32, daarom hebben exosomes geproduceerd in een systeem nabootsen van hun in-vivo productie zou ook wenselijk zijn in studies kijken het verkennen van het passieve gericht op vermogen van exosomes als drug nanocarriers.

De p-verhouding werd gerapporteerd als een parameter te beoordelen van de zuiverheid van geïsoleerde exosomes van eiwitten uit het kweekmedium van fysiologische vloeistoffen waaruit exosomes waren afkomstig uit41besmetten. De p-verhouding van 8.3 ± 1,7 × 1010 p/µg verkregen in deze studie valt binnen het bereik van de hoge zuiverheid voorgesteld in de studie. Deze verhouding wijst op het gevaar van het gebruik van de eiwitconcentratie wil de opbrengst of de dosis van het exosomes dat werd geïsoleerd of downstream onderzoeken gebruikt respectievelijk, aangezien dit niet met de werkelijke hoeveelheid exosomes beschikbaar in het voorbeeld gegeven van het probleem van de eiwitten overeen besmetting tijdens de isolatie. NTA via instrumenten zoals NanoSight, die de concentratie van exosomes deeltje nalevingspercentage meet, is een verstandiger en nauwkeurige manier van het kwantificeren van de exosomes.

Zeer nauwkeurige wegen tijdens de voorbereiding van de 25% sacharoseoplossing in deuteriumoxide is essentieel aangezien deze methode een dichtheid gebaseerde isolatie is. Exosomes hebben een vrij smalle waaier van flotatie dichtheid in een sacharoseoplossing zodat nauwkeurige voorbereiding van het kussen sacharose besmetting van niet-exosomal blaasjes zoals apoptotic lichamen of Golgi-derived vesicles tijdens isolatie42zal verminderen. Het is aangeraden om niet te houden van de overgebleven sacharoseoplossing en zelfs na een dag te gebruiken om te voorkomen dat risico factoren die de dichtheid zoals verlies veranderen kan of toevoeging van water in de oplossing door verdamping of condensatie van lucht in de buis. Gebruik van de rotor van een swing-out is ook essentieel tijdens centrifugeren op het kussen van sacharose mag zelfs migratie van exosomes vanaf de CM de sacharoseoplossing.

Intrekking van de sacharose oplossing na centrifugeren is ook een delicate stap, en het gaat om het vinden van een compromis tussen het maximaliseren van de hoeveelheid exosomes herstelde, en niet teveel dat eiwit uit kweekmedium aan het exosome monster ingetrokken wordt ingevoerd . De interface tussen de sacharoseoplossing en het medium van de voorwaarde is waar de eiwitten uit het kweekmedium verzamelden na centrifugeren, en meestal kunnen worden gezien als een donkere bruine ring die op de interface zit. In onze handen is terugtrekking van 2 mL van het kussen sacharose uit de eerste 3 mL toegevoegd de optimale volume dat stemt in met het compromis dat hierboven vermeld. De volumes die worden beschreven in dit protocol worden voor de specifieke rotors gebruikt; Daarom is het aangeraden voor het optimaliseren van het volume van sacharose te trekken tijdens het schalen omhoog of omlaag het volume voor de typen rotoren beschikbaar in verschillende voorzieningen. Het is ook belangrijk om te voorkomen dat het gebied recht in het midden van de onderkant van de buis bij intrekking van de sucrose, zoals dit is waar de deeltjes met een hogere dichtheid dan sacharose sediment zal en kan meestal worden gezien als een gebroken witte pellet.

De stap van het wassen met een relatief grote hoeveelheid PBS helpt een verdere verlaging van de mate van eiwit besmetting tijdens exosome isolatie41. Deze stap is ook essentieel in het verwijderen van overtollige sacharose uit de exosomes om te voorkomen dat osmotische schade aan de exosomes zelf of de biomoleculen binnen de exosomal lumen, evenals het verminderen van het risico van bacteriële en/of schimmel groei in de exosome voorraad. Voorbereiding de sacharoseoplossing in deuteriumoxide in plaats van water helpt bij het verminderen van de hoeveelheid sacharose die nodig zijn om de dichtheid van de flotatie exosome voor isolatie, vandaar risico het van zowel osmotische schade en bacteriële besmetting. Na de eerste centrifugeren op het kussen van sacharose, de exosome-bevattende sacharose laag ingetrokken en toegevoegd aan de PBS kan worden opgeslagen bij 4 ° C en de volgende dag verwerkt als geconfronteerd met tijdgebrek.

Tot de beste van onze kennis is de molaire verhouding van exosome/siRNA een belangrijke factor bij het bepalen van de efficiëntie van electroporation. In dit protocol gebruikten we 1:60 als de exosome siRNA molaire verhouding. Als het vermogen van de inkapseling van verschillende soorten exosomes zijn verschillend, raden we dit worden geoptimaliseerd op basis van de case-by-case. De efficiëntie van de inkapseling voorgesteld hierin kunnen echter altijd een parameter voor de selectie van de optimale electroporation voorwaarden.

Daarnaast wordt aggregatie van siRNA verondersteld om één van het gemeenschappelijkste probleem in electroporation. Het is bewezen dat electroporation sterke aggregatie van siRNA, waardoor het nog moeilijker om te gaan exosomes kan veroorzaken. siRNA samenvoegingen worden vaak ten onrechte geïnterpreteerd als inkapseling van siRNA in exosome dus juiste besturingselementen in deze studie werden gebruikt, zoals de vorming van siRNA aggregaten is onvermijdelijk tijdens electroporation28. De doeltreffendheid van de inkapseling percentage van onze zuivering-methode werd berekend aan de hand van genormaliseerde waarden om te minimaliseren van de invloed van andere bronnen zoals achtergrond lawaai, exosome en siRNA aggregaties dat afbreuk aan de betrouwbaarheid van de gegevens doen zou. Op basis van onze bevindingen, was er te verwaarlozen siRNA aggregaties waargenomen in de controle monster dat wil zeggen, met behulp van electroporated en un-electroporated siRNA.

Dit protocol is succesvol gebleken voor de inkapseling van siRNA in exosomes en hun latere intracellulair levering van siRNA aan kanker cellen in vitro. Daarom, verschillende soorten exosomes uit verschillende cellijnen kunnen worden geïsoleerd en gekenmerkt met het voorgestelde protocol, en verladen met verschillende therapeutische siRNA voor verschillende soorten oncogene doelstellingen overdreven uitgedrukt in verschillende kankers. Een interessante toepassing zou moeten onderzoeken de siRNA-leverings- en opname-efficiëntie met behulp van diverse permutaties van exosome bron-target cel paar in vitro. Dit kan dan vertaald worden naar dierlijke modellen om te beoordelen van de efficiëntie van zowel de levering als therapeutische efficiëntie van siRNA ingekapseld exosomes in vivo.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

F. N. Faruqu wordt gefinancierd door de Maleisische regering agentschap Majlis Amanah Rakyat (MARA). L. Xu is een ontvanger van de individuele beurzen voor Marie Sklodowska-Curie (Horizon 2020) (H2020-MSCA-IF-2016). K. T. Al-Jamal erkent financiering uit BBSRC (BB/J008656/1) en de Wellcome Trust (WT103913). De auteurs wil ook Dr. Paul Lavender en Dr David Fear (Department of Respiratory Medicine en allergie, King’s College London) bedanken voor het verstrekken van de electroporator.

Materials

Material
Sterile Newborn Calf Serum Heat Inactivated First Link 08-05-850 500 ml
EMEM medium Thermo Fisher Scientific 11090081 500 ml
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140-122 100 ml
GlutaMax Thermo Fisher Scientific 35050-038 100 ml
Sucrose Fisher Scientific S/8600/60 1 kg
Deuterium oxide (D2O) Sigma-Aldrich 151882 250 g
1X Phosphate Buffered Saline  Thermo Fisher Scientific 10010015 500 ml
Glycine VWR Chemicals 101196X 1 kg
Sepharose CL-2B GE Healthcare Life Sciences 17-0140-01 1 L; Particle Size 60 μm-200 μm
Trypsin-EDTA 0.05% Thermo Fisher Scientific 25300096 100 ml
Aldehyde/sulfate latex beads Thermo Fisher Scientific A37304 4% w/v, 4 µm, 15 ml
MicroBCA kit Thermo Fisher Scientific 23235
CD81 antibody (APC) Thermo Fisher Scientific 17-0819-42 Lot: E15950-104. RRID: AB_11150235. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD81 isotype (APC) Thermo Fisher Scientific 17-4714-81  Lot: 4291563. RRID: AB_763650. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD9 antibody (FITC) Thermo Fisher Scientific 11-0098-41 Lot: 4345870. RRID: AB_10698007. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD9 isotype (FITC) Thermo Fisher Scientific 11-4714-41 Lot: 4299784. RRID: AB_10598647. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD63 antibody (PE) Thermo Fisher Scientific 12-0639-41 Lot: 1930435. RRID: AB_2572564. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD63 isotype (PE) Thermo Fisher Scientific 12-4714-81 Lot: 1937696. RRID: AB_470059. 1:10 dilution in 50 µl sample
Atto655-siRNA Eurogentec     SQ-SIRNA (Labelled-S) UGC-GCU-ACG-AUC-GAC-GAU-G55; (Unlabelled-AS) CAU-CGU-CGA-UCG-UAG-CGC-A55.
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm Millipore SLGP033RS
CELLine AD1000 bioreactor flasks Wheaton WCL1000ad
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima XPN-80
Swing-out rotor Beckman Coulter SW45 Ti
Fixed-angle rotor Beckman Coulter Type 70 Ti
Ultracentrifuge tubes Beckman Coulter 355631 Polycarbonate. Max. fill 32 ml
Ultracentrifuge bottles Beckman Coulter 355618 Polycarbonate. Min. fill 16 ml, max. fill 25 ml
NanoSight Malvern LM10 Software: NanoSight NTA v3.2
Flow Cytometer BD Biosciences FACSCalibur
Centrifuge Eppendorf 5810R
Plate reader BMG Labtech FLUOstar Omega
Flow cytometry tubes BD Biosciences, Falcon 352052
Microfuge tubes Starlab S1615-5500 1.5 ml
Cell culture flasks Fisher Scientific 156499 75 cm2
Transmission electron microscope FEI Electron Optics Philips CM 12 with Tungsten filament and a Veleta – 2k × 2k side-mounted TEM CCD Camera (Olympus, Japan)
Amaxa Nucleofector I Lonza Nucleofector I with Amaxa’s Nucleofector Kits
24-well flat-bottom plates Corning Costar
Blunt fill needle BD Biosciences 305180 18G x 1 1/2" (1.2 mm x 40 mm)
Glass pipettes Fisher Scientific 1156-6963
Name Company Catalog Number Comments
Reagents Composition
Normal medium Eagle's Minimum Essential Medium supplemented with 10% foetal bovine serum (FBS), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax.
Exosome-depleted medium Eagle's Minimum Essential Medium supplemented with 10% exosome-depleted FBS (see below), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax.
Exosome-depleted FBS Subject FBS to ultracentrifugation at 100,000 g for 18 h at 4°C. The FBS supernatant post-centrifugation was collected and sterile-filtered using 0.22 µm filters.
25% w/w sucrose cushion Add 1.9 g (± 0.001 g) of sucrose in a universal tube, and top up with D2O until the weight reaches 7.6 g (± 0.001 g). This makes ~6ml of the 25% w/w sucrose cushion.
3% FBS/PBS Add 1.5 ml exosome-depleted FBS to 48.5 ml 1X PBS to prepare 50 ml of 3% FBS/PBS.
100 µM BSA solution Prepare 1mM BSA solution by adding 0.3325 g to 50 ml PBS. Make 1:10 dilution of this stock to obtain 100 µM BSA solution. Make 5-10 µl aliqouts of this 100 µM BSA solution (for single use) and store them at -20°C. All BSA solution should be stored at -20°C, and discard solutions that have undergone ≥2 freeze-thaw cycles.
100 mM glycine solution Add 0.375 g of glycine to 50 ml PBS to obtain 100 mM glycine solution, store at 4°C.
Citric acid buffer with EDTA Mix 0.1954 g citric acid and 0.2087 g disodium phosphate in 50 mL of deionised water. Add EDTA to 0.1 mM. Adjust pH to 4.4.
Fixing solution Prepare formaldehyde/glutaraldehyde, 2.5% (w/v) each in 0.1 M sodium cacodylate buffer, and adjust pH to 7.4.
Aqueous uranyl acetate Prepare 25% (v/v) uranyl acetate in methanol.
50% methanol/H2O Mix methanol and H2O 1:1 (v/v).
SEC Column packed with Sepharose CL-2B Dilute 37.5 ml Sepharose CL-2B resin with 12.5 ml PBS to obtain 75% Sepharose CL-2B solution. Pour the Sepharose CL-2B solution into a column of dimension 2.9 cm [H] x 1.3 cm [W]. Pour the Sepharose CL-2B to 3-4 mm above the stated height, and then press it down to the stated height with the filter for optimal packing.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zitvogel, L., et al. Eradication of established murine tumors using a novel cell-free vaccine: dendritic cell derived exosomes. Nature Medicine. 4 (5), 594-600 (1998).
  2. Raffai, R., Li, K., Wong, D., Hong, J. Therapeutic control of systemic inflammation & atherosclerosis with ApoE-polarized macrophage exosomes. Atherosclerosis. , e5-e6 (2017).
  3. Masamune, A., et al. Exosomes derived from pancreatic cancer cells induce activation and profibrogenic activities in pancreatic stellate cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 71-77 (2018).
  4. Gangoda, L., et al. Proteomic Profiling of Exosomes Secreted by Breast Cancer Cells with Varying Metastatic Potential. Proteomics. 17 (23-24), 1600370 (2017).
  5. Wozniak, M., Peczek, L., Czernek, L., Düchler, M. Analysis of the miRNA Profiles of Melanoma Exosomes Derived Under Normoxic and Hypoxic Culture Conditions. Anticancer Research. 37 (12), 6779-6789 (2017).
  6. Salimu, J., et al. Dominant immunosuppression of dendritic cell function by prostate-cancer-derived exosomes. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1368823 (2017).
  7. Lankford, K. L., et al. Intravenously delivered mesenchymal stem cell-derived exosomes target M2-type macrophages in the injured spinal cord. PLoS ONE. 13 (1), e0190358 (2018).
  8. Khalyfa, A., et al. Plasma Exosomes and Improvements in Endothelial Function by Angiotensin 2 Type 1 Receptor or Cyclooxygenase 2 Blockade following Intermittent Hypoxia. Frontiers in Neurology. 8, 709 (2017).
  9. Manek, R., et al. Protein Biomarkers and Neuroproteomics Characterization of Microvesicles/Exosomes from Human Cerebrospinal Fluid Following Traumatic Brain Injury. Molecular Neurobiology. 55 (7), 6112-6128 (2018).
  10. Pathare, G., et al. Changes in V-ATPase subunits of human urinary exosomes reflect the renal response to acute acid/alkali loading and the defects in distal renal tubular acidosis. Kidney International. 93 (4), 871-880 (2018).
  11. Liao, Y., Du, X., Li, J., Lönnerdal, B. Human milk exosomes and their microRNAs survive digestion in vitro and are taken up by human intestinal cells. Molecular nutrition & food research. 61 (11), 1700082 (2017).
  12. Kim, J., et al. Cyclooxygenase-2 expression is induced by celecoxib treatment in lung cancer cells and is transferred to neighbor cells via exosomes. International Journal of Oncology. 52 (2), 613-620 (2017).
  13. Sterzenbach, U., et al. Engineered Exosomes as Vehicles for Biologically Active Proteins. Molecular Therapy. 25 (6), 1269-1278 (2018).
  14. Conigliaro, A., Fontana, S., Raimondo, S., Alessandro, R. Exosomes: Nanocarriers of Biological Messages. In Exosomes in Cardiovascular Diseases. 998, 23-43 (2017).
  15. El Andaloussi, S., Lakhal, S., Mäger, I., Wood, M. J. A. Exosomes for targeted siRNA delivery across biological barriers. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (3), 391-397 (2013).
  16. Simhadri, V. R., et al. Dendritic cells release HLA-B-associated transcript-3 positive exosomes to regulate natural killer function. PLoS ONE. 3 (10), e3377 (2008).
  17. Santos, J. C., et al. Exosome-mediated breast cancer chemoresistance via miR-155 transfer. Scientific Reports. 8 (1), 829-829 (2018).
  18. Hadla, M., et al. Exosomes increase the therapeutic index of doxorubicin in breast and ovarian cancer mouse models. Nanomedicine. 11 (18), 2431-2441 (2016).
  19. Smyth, T., et al. Biodistribution and delivery efficiency of unmodified tumor-derived exosomes. Journal of Controlled Release. 199, 145-155 (2015).
  20. Tian, Y., et al. A doxorubicin delivery platform using engineered natural membrane vesicle exosomes for targeted tumor therapy. Biomaterials. 35 (7), 2383-2390 (2014).
  21. Kim, M. S., et al. Engineering macrophage-derived exosomes for targeted paclitaxel delivery to pulmonary metastases: in vitro and in vivo evaluations. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 14 (1), 195-204 (2018).
  22. Bellavia, D., et al. Interleukin 3- receptor targeted exosomes inhibit in vitro and in vivo Chronic Myelogenous Leukemia cell growth. Theranostics. 7 (5), 1333-1345 (2017).
  23. Sun, D., et al. A novel nanoparticle drug delivery system: The anti-inflammatory activity of curcumin is enhanced when encapsulated in exosomes. Molecular Therapy. 18 (9), 1606-1614 (2010).
  24. Tian, T., et al. Surface functionalized exosomes as targeted drug delivery vehicles for cerebral ischemia therapy. Biomaterials. 150, 137-149 (2017).
  25. Zhuang, X., et al. Treatment of brain inflammatory diseases by delivering exosome encapsulated anti-inflammatory drugs from the nasal region to the brain. Molecular Therapy. 19 (10), 1769-1779 (2011).
  26. Iessi, E., et al. Acridine Orange/exosomes increase the delivery and the effectiveness of Acridine Orange in human melanoma cells: A new prototype for theranostics of tumors. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 32 (1), 648-657 (2017).
  27. Aqil, F., et al. Exosomal delivery of berry anthocyanidins for the management of ovarian cancer. Food & Function. 8 (11), 4100-4107 (2017).
  28. Shtam, T. A., et al. Exosomes are natural carriers of exogenous siRNA to human cells in vitro. Cell Communication and Signaling. 11 (1), 1-10 (2013).
  29. Wahlgren, J., et al. Plasma exosomes can deliver exogenous short interfering RNA to monocytes and lymphocytes. Nucleic Acids Research. 40 (17), e130-e130 (2012).
  30. Yang, J., Zhang, X., Chen, X., Wang, L., Yang, G. Exosome Mediated Delivery of miR-124 Promotes Neurogenesis after Ischemia. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 7, 278-287 (2017).
  31. Alvarez-Erviti, L., et al. Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes. Nature Biotechnology. 29 (4), 341-345 (2011).
  32. Wiklander, O. P. B., et al. Extracellular vesicle in vivo biodistribution is determined by cell source, route of administration and targeting. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 1-13 (2015).
  33. Varga, Z., et al. Radiolabeling of Extracellular Vesicles with 99m Tc for Quantitative In Vivo Imaging Studies. Cancer Biotherapy and Radiopharmaceuticals. 31 (5), 168-173 (2016).
  34. Smyth, T. J., Redzic, J. S., Graner, M. W., Anchordoquy, T. J. Examination of the specificity of tumor cell derived exosomes with tumor cells in vitro. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1838 (11), 2954-2965 (2014).
  35. Boing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 23430 (2014).
  36. Sharma, P., et al. Immunoaffinity-based isolation of melanoma cell-derived exosomes from plasma of patients with melanoma. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1435138 (2018).
  37. Clayton, A., et al. Analysis of antigen presenting cell derived exosomes, based on immuno-magnetic isolation and flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 247 (1), 163-174 (2001).
  38. Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. Exosome Isolation for Proteomic Analyses and RNA Profiling. In Serum/Plasma Proteomics: Methods and Protocols. , 235-246 (2011).
  39. Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney International. 82 (9), 1024-1032 (2012).
  40. Mitchell, J. P., Mason, M. D., Tabi, Z., Clayton, A. Increased exosome production from tumour cell cultures using the Integra CELLine Culture System. Journal of Immunological Methods. 335 (1-2), 98-105 (2008).
  41. Webber, J., Clayton, A. How pure are your vesicles?. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 1-6 (2013).
  42. Chiou, N. -. T., Ansel, K. M. Improved exosome isolation by sucrose gradient fractionation of ultracentrifuged crude exosome pellets. Nature Protocol Exchange. , (2016).

Tags

ExosomesSiRNA DeliveryCancer CellsBioreactorUltracentrifugationSucrose CushionHEK-293 CellsExosome-depleted MediumPre-clearingCentrifugation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Faruqu, F. N., Xu, L., Al-Jamal, K. T. Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells. J. Vis. Exp. (142), e58814, doi:10.3791/58814 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image