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Cancer Research

Preparazione degli esosomi per siRNA consegna alle cellule tumorali

Published: December 05, 2018
doi:
10.3791/58814
, ,
1Institute of Pharmaceutical Science,King’s College London

Summary

Un esosomi sono una nuova generazione di vettori di consegna di droga. Abbiamo stabilito un protocollo di isolamento da esosomi con alta resa e purezza per la consegna di siRNA. Abbiamo anche incapsulato fluorescente coniugato non specifici siRNA in esosomi e studiato l’assorbimento cellulare di esosomi siRNA-caricato in cellule tumorali.

Abstract

Vescicole extracellulari, in particolare esosomi, recentemente hanno guadagnato interesse come droga novella vettori di consegna a causa della loro origine biologica, abbondanza e capacità intrinseca in consegna intercellulare di varie biomolecole. Quest’opera costituisce un protocollo di isolamento per ottenere elevata purezza di esosomi per la consegna di siRNA e ad alto rendimento. Cellule di rene embrionale umane (cellule HEK-293) sono coltivate in fiasche di bioreattore e surnatante della cultura (hereon denominati medium condizionato) viene raccolto su una base settimanale per consentire per l’arricchimento degli esosomi HEK-293. Il medium condizionato (CM) è pre-liquidato di cellule morte e detriti cellulari tramite centrifugazione differenziale ed è sottoposto a ultracentrifugazione su un cuscino di saccarosio seguito da una fase di lavaggio, per raccogliere gli esosomi. Isolato HEK-293 esosomi sono caratterizzati per la resa, la morfologia e la exosomal dell’espressione dei marker di nanoparticle tracking analysis, quantificazione della proteina, la microscopia e citometria a flusso, rispettivamente. Piccoli RNA interferente (siRNA), fluorescente etichettati con Atto655, viene caricato in esosomi mediante elettroporazione e siRNA in eccesso viene rimosso mediante gel filtrazione. L’assorbimento delle cellule in cellule tumorali PANC-1, dopo 24 ore di incubazione a 37 ° C, è confermata tramite flusso cytometry. HEK-293 esosomi sono 107.0 ± 8.2 nm di diametro. Il rapporto di rapporto (poliziotto) esosomi resa e della particella–proteina sono 6,99 ± 0,22 × 1012 particelle/mL e 8,3 ± 1,7 × 1010 particella / µ g, rispettivamente. L’efficienza di incapsulamento di siRNA in esosomi è ~ 10-20%. Quaranta per cento delle cellule mostrano segnali positivi per Atto655 a 24 h post-incubazione. In conclusione, esosomi isolamento dall’ultracentrifugazione su cuscino di saccarosio offre una combinazione di buona resa e purezza. siRNA potrebbe essere caricato correttamente in esosomi mediante elettroporazione e successivamente trasportato nelle cellule tumorali in vitro. Questo protocollo offre una procedura standard per lo sviluppo di esosomi siRNA-caricato per la distribuzione efficiente di cellule tumorali.

Introduction

Gli esosomi sono un sottotipo di vescicole extracellulari (EV) che vanno da 50-200 nanometro di diametro, secreta da vari tipi cellulari come cellule immunitarie1,2,3,4,5, le cellule tumorali 6 cellule staminali e7. Esosomi hanno anche dimostrati di essere presente in vari fluidi fisiologici8,9,10,11. La combinazione tra la capacità intrinseca di esosomi di trasportare varie biomolecole (ad es., RNA e proteine)12,13,14 e la consegna efficace di queste biomolecole nelle cellule recettive 15 , 16 , 17 attirato l’interesse per il loro potenziale come vettori di consegna droga su scala nanometrica. Varie piccole molecole che fungono da farmaci anti-cancro e anti-infiammatori sono stati dimostrati per essere correttamente caricati in esosomi e consegnati a destinazione cellule18,19,20, 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. interessante, acidi nucleici come siRNA28,29 e microRNA30 sono stati caricati correttamente in esosomi tramite elettroporazione e trasportato alle cellule bersaglio.

Recentemente, RNA interferenza (RNAi) tramite piccolo RNA interferenti (siRNA) ha guadagnato più interesse come il meccanismo preferito nel silenziamento genico per la sua alta specificità, effetto potente, effetti collaterali minimi e facilità di siRNA sintesi28, 29. siRNAs sono molecole di RNA double-stranded compresa tra 19 e 25 nucleotidi di lunghezza che atterramento di mRNA trigger catalitica di sequenza-specifico. Grazie alla sua grande peso molecolare e la natura polyanionic, l’assorbimento passivo di siRNA nudo nelle cellule è ostacolato28,29. Inoltre non è possibile per siRNA nudo deve essere iniettato nella circolazione sistemica a causa della rapida degradazione da plasma nucleasi a31. Così, incapsulamento di siRNA in un nanocarrier aiuterebbe la consegna efficace e l’assorbimento di siRNA in cellule bersaglio.

Gli esosomi sono un sistema ideale per l’incapsulamento di siRNA come la sua struttura è composto da un nucleo acquoso, cavo avvolto da un doppio strato fosfolipidico. Esosomi non solo hanno una buona stabilità nel sangue, ma hanno anche proprietà naturali targeting per consegnare funzionale RNA nelle cellule32. Lo studio condotto con successo da Alvarez-Erviti et al hanno dimostrato efficace consegna di siRNA ai cervelli dei topi utilizzando ingegnerizzato esosomi con virtualmente nessun complicazioni31. È supposto che la terapia a base di esosomi è relativamente più sicura rispetto ad altre terapie come esosomi non replicare in modo endogeno come cellule farebbe e pertanto non esibiscono proprietà metastatiche15.

Vari metodi sono stati segnalati per isolare con successo esosomi da coltura cellulare o fluidi fisiologici. Il metodo più popolare utilizza ultracentrifugazione a pellet esosomi dalla partenza materiale31,32,33. Questo metodo può essere abbastanza duro su esosomi e solitamente proteine co-precipitati dal campione. La combinazione di ultracentrifugazione con una separazione basata su densità come pendenze del saccarosio sta diventando più comune, per ridurre la contaminazione della proteina e non exosomal nel isolato esosomi19,34. Cromatografia di esclusione dimensionale (SEC) consente la separazione di esosomi da altri tipi di vescicole extracellulari (EV) di dimensioni e può anche provocare contaminazione minima proteina ma è limitata dalla piccola quantità di materiale che può elaborare35, di partenza 36. Immunoaffinità capture utilizza perline ricoperte di anticorpi che si legano a proteine di superficie exosomal come tetraspannine o altri marker di cellula-specifico che permette di catturare specifiche di esosomi anziché EVs o altre proteine, come pure isolare subpopolazione di esosomi da campioni di tutto, ma ancora sono limitato dalla quantità di materiale di partenza ed sono costoso36,37. A base di polimeri di precipitazione di esosomi era troppo popolare, ma dal momento che è una precipitazione piuttosto grezza, conduce ad un più alto non-exosomal della vescicola e proteina contaminazione38,39.

L’elettroporazione è stata segnalata per la sua inefficienza come un metodo per caricare gli esosomi con siRNA a causa della proteina aggregazione15,28,31. Approcci basati su transfezione sono stati dimostrati per avere meglio caricamento efficienza e stabilità proteica, ma non è auspicabile a causa della sua tossicità e gli effetti collaterali degli agenti di transfezione nell’alterazione genica cellulare espressione28. Così, l’elettroporazione è stato più ampiamente utilizzato nel caricamento di siRNA in esosomi poichè è un metodo più sicuro. Tuttavia, un metodo di incapsulamento ottimizzato deve essere stabilito al fine di fornire un’adeguata quantità di siRNA al sito di destinazione per un atterramento di gene potente.

Qui, vi proponiamo un protocollo di isolamento da esosomi usando ultracentrifugazione densità-basata sul solo un cuscino di saccarosio 25% (w/w) unico preparato in ossido di deuterio, piuttosto che un gradiente di densità di saccarosio. Questo è un metodo redditizio che elude la preparazione del gradiente di densità laborioso e permette l’elaborazione di grandi volumi di materiale di partenza, ma si traduce in esosomi intatti di alta resa e purezza adatto a caricamento successivo con siRNA. Atto655-coniugato fluorescente non specifici siRNA è stato caricato nel rene embrionale umano cellule (cellule HEK-293) derivate esosomi tramite elettroporazione e trasportato alle cellule tumorali umane dell’adenocarcinoma pancreatico (PANC-1) in vitro.

Protocol

1. cella cultura in una boccetta di bioreattore Figura 1: cultura delle cellule in boccetta di bioreattori per la produzione di esosomi. (A) semplificato anatomia del matraccio bioreattore. (B) a partire della coltura nella beuta di bioreattore. Vedi Tabella materiali per la composizione della normale ed esosomi-vuotati medio (C) raccolta condizionata medio (CM) e la manutenzione della cultura nella beuta di bioreattore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Coltura di cellule HEK-293 in medium normale (Vedi Tabella materiali; 5% CO2, 37 ° C) ed espanderli in 4 x T75 palloni (fino al 90% confluenti). Bagnate la membrana del matraccio bioreattore aggiungendo 50-100 mL di medium normale nel medio bacino del matraccio bioreattore. Raccogliere tutte le cellule HEK-293 da 4 x T75 e risospendere le loro in 15 mL di terreno di esosomi-vuotati (Vedi Tabella materiali). Aggiungere la sospensione di cellule HEK-293 per il compartimento cellulare del matraccio bioreattore utilizzando una siringa da 20 mL, collegata ad un riempimento smussato dell’ago (Vedi Tabella materiali), con cura per eliminare qualsiasi della bolla che potrebbe hanno formato. Riempire il serbatoio medio del matraccio bioreattore con medium normale a 500 mL e tenere il pallone in incubatrice (5% CO2, 37 ° C) per una settimana. 2. Medium condizionato (CM) raccolta dal pallone bioreattore Dopo 1 settimana, eliminare tutto il terreno nel serbatoio medio del matraccio bioreattore. Rimuovere tutti i media nel compartimento cellulare (vale a dire, il CM) utilizzando una siringa da 20 mL collegata ad un ago smussato riempimento. Aggiungere 50-100 mL di medium normale al serbatoio medio. Aggiungere 15 mL di terreno di esosomi-esaurito il compartimento cellulare rimuovendo il vecchio mezzo e aggiungendo fresco medio esosomi-vuotati utilizzando una siringa da 20 mL, collegata ad un ago smussato riempimento. Riempire il serbatoio medio del matraccio bioreattore con medium normale a 500 mL e tenere il pallone in incubatrice (5% CO2, 37 ° C) per un’altra settimana.Nota: La cultura può essere continuata per più di un anno. Al punto 2.2, il CM dal primo raccolto non servirà per l’isolamento di esosomi e viene scartato. Per il 2° e il raccolto successivo, il CM è tenuto per l’isolamento di esosomi. 3. esosomi isolamento su un cuscino di saccarosio Figura 2: isolamento e caratterizzazione di esosomi. (A) pre-clearing raccolto il medium condizionato (CM) dalle cellule morte e detriti cellulari. (B) isolando esosomi da CM sul cuscino di saccarosio. (C) passo il lavaggio per rimuovere proteine contaminanti e saccarosio. (D) esosomi isolati sono stati sottoposti alla caratterizzazione fisico-chimici, biochimici e morfologici. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Pre-deselezionare il CM (dal punto 2.2) di filtrazione e la centrifugazione differenziale come segue. Centrifugare a 500 g per 5 min a 4 ° C. Trasferire il surnatante in una nuova provetta e scartare il pellet. Ripetere questo passaggio di centrifugazione una volta di più, recuperare il surnatante e scartando il pellet. Centrifugare il surnatante dal punto 3.1.1 a 2.000 x g per 15 min e 4 ° C e poi scartare pellet. Filtrare una volta surnatante recuperata da 0,22 µm filtri. Durante il pre-schiarimento, preparare soluzione di saccarosio (w/w) di 25% in ossido di deuterio accuratamente pesando 1,9 g (± 0,001 g) di saccarosio in un tubo universale, e quindi il rabbocco con ossido di deuterio fino a quando il peso raggiunge 7,6 g (± 0,001 g). Riempire un’ultracentrifuga tubo (Vedi Tabella materiali) con 22,5 mL di pre-sgomberati CM. Make up CM 22,5 ml con 0,22 µm-filtrata PBS se il volume corrente è inferiore a quella. Posto un vetro pipetta (Vedi Tabella materiali) nel tubo e, attraverso di essa, aggiungere 3 mL di soluzione di saccarosio in modo che la soluzione forma uno strato separato sotto il CM. Accuratamente posto la provetta contenente strati soluzione CM/saccarosio nel secchio di un rotore (Vedi Tabella materiali) e fissare il secchio nel rotore. Inserire il rotore l’ultracentrifuga (Vedi Tabella materiali) e spin a 100.000 x g per 1,5 h a 4 ° C. Raccogliere 2 mL del livello di saccarosio e aggiungerla alla bottiglia ultracentrifuga (Vedi Tabella materiali) contenente 20 mL di filtrato PBS per una fase di lavaggio. Disporre le provette in un rotore ad angolo fisso (Vedi Tabella materiali) e spin a 100.000 x g per 1,5 h a 4 ° C. Con attenzione rimuovere il surnatante con una pipetta sierologica 10ml e risospendere il sedimento con 400 µ l filtrata PBS. Mantenere questo stock di esosomi a 4 ° C o da-80 ° C per lo stoccaggio a breve e a lungo termine, rispettivamente. 4. caratterizzazione di esosomi dimensioni e rendimento di Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) Fare 1:1, 000-1:50, 000 diluizioni dello stock da esosomi nel volume di 1 mL (per un minimo di 750 µ l) in modo da ottenere particelle di 20-80 nella zona di visualizzazione del NTA dello strumento (Vedi Tabella materiali) display. Iniettare lo stock di esosomi diluito nella camera del campione di strumento NTA utilizzando una siringa da 1 mL e inserire la sonda di temperatura di un termometro nell’entrata della sonda di temperatura. Impostare il software NTA (Vedi Tabella materiali) per la registrazione come segue: 3 misure standard, 30 s, ogni opzione di temperatura manuale deselezionato; e immettere il fattore di diluizione sotto la scheda Avanzate . Impostare il livello di fotocamera a 13 ed eseguire lo script di cattura sul software NTA, iniettando un lotto fresco di campione e immettendo la temperatura della camera del campione quando richiesto dopo ogni lettura. Impostare la soglia a 4 per la parte di analisi successive e notare la media dimensione modale e concentrazione di particelle dello stock da esosomi dalle misurazioni. 5. caratterizzazione di esosomi purezza di determinazione del rapporto di particella: proteina Misura il contenuto proteico dello stock da esosomi da un’analisi di proteine (BCA) acido bicinconinico kit (Vedi Tabella materiali) come segue. Preparare il definiti standard. Preparare lo standard della più alta concentrazione (500 µ g/mL) con l’aggiunta di 45 µ l di soluzione madre di BSA (2 mg/mL – fornito nel kit di dosaggio) di un tubo del microcentrifuge e renderlo fino a 180 µ l con PBS. Riempire 8 provette per microcentrifuga con 90 µ l di PBS. Effettuare diluizioni seriali (fattore: 0,5) prendendo 90 µ l da BSA più alto standard e l’aggiunta di questo nella microcentrifuga 1st tubo con PBS (mescolare bene), poi prendere 90 µ l da questo tubo e aggiungendolo nel tubo del microcentrifuge 2nd . Ripetere questa operazione fino a quando il tubo del microcentrifuge 7. Il tubo 8 sarà solo PBS (cioè, il vuoto: 0 µ g/mL). Preparare i campioni di esosomi elaborando diluizione 1:2 di campioni con PBS in un volume totale di 90 µ l (45 µ l di campione, 45 µ l di PBS). Preparare la BCA agitare. Calcolare il volume totale di BCA agitare necessari (50 µ l per pozzetto, in duplicati, ivi comprese le norme). Mescolare i reagenti BCA individuali secondo il seguente rapporto: 25 parti a: 24 parti reagente b: 1 parte reagente C. Eseguire il test e analisi. Aggiungere 40 µ l di ciascun campione standard ed esosomi preparato in precedenza in un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti (duplicati per ogni campione e standard).Nota: Poiché si tratta di un saggio colorimetrico, appropriata tecnica di dispensazione è fondamentale per ottenere risultati accurati. Pipette di cambiamento dopo l’aggiunta di ogni replica standard/campione in ciascuno dei pozzetti Aggiungere 50 µ l di analisi della proteina di lavoro agitare in ogni pozzetto e incubare la piastra a 37 ° C per 30 min.Nota: Per ridurre al minimo le deviazioni tra repliche, aggiungere il reattivo di lavoro di analisi della proteina in replica 1st un campione standard, seguita da 2nd replica dello stesso campione/standard, prima di aggiungerlo al 1st la replica di un altro campione/standard. Misurare l’assorbanza a 562 nm del lettore della piastra (Vedi Tabella materiali). Tracciare una curva standard dai valori di assorbanza degli standard e lavorare la concentrazione nella proteina in ciascun campione utilizzando l’equazione della curva. Calcolare il rapporto delle particelle: proteina dividendo la resa di esosomi ottenuta in precedenza con la concentrazione nella proteina dello stock da esosomi misurata di sopra. 6. caratterizzazione dell’espressione dei Marker di Exosomal tramite flusso Cytometry Incubare 40 µ l di esosomi (≥1×1011 particelle/mL) con 10 µ l di granuli di lattice aldeide/solfato (non diluito da stock) per 15 min a temperatura ambiente (TA). Aggiungere 5 µ l di soluzione di BSA 100 µM (Vedi Tabella materiali) alla miscela di esosomi-tallone per ottenere una concentrazione finale di 10 mM e incubare per 15 minuti a TA. Aggiungere 1 mL di PBS e incubare per 75 min a RT in una microcentrifuga con lieve agitazione su un agitatore oscillante (~ 150 giri/min). Centrifugare la sospensione a 580 x g per 5 min a RT e scartare il surnatante. Risospendere il pellet con 1 mL di soluzione di glicina 100 mM (Vedi Tabella materiali) ed incubare per 30 minuti a TA. Centrifugare la sospensione per 5 min a 580 x g. gettare il surnatante e risospendere il pellet con 1 mL di 3% FBS/PBS (Vedi Tabella materiali). Ripetere questo passaggio di lavaggio e risospendere il pellet in 350 µ l del 3% FBS/PBS. Dividere la sospensione in 7 tubi, ciascuno contenente 50 µ l di sospensione e li incubare con fluoroforo-coniugato anti-CD81, anticorpi anti-CD9 e anti-CD63 e i controlli di isotipo corrispondenti (01:10 diluizione), rispettivamente, per 45 min a 4 ° C. Tenere 1 dei tubi come un controllo non colorato ma subendo il trattamento stesso. Aggiungere 1 mL di 3% FBS/PBS a ciascun tubo, centrifugare per 5 min a 580 x g e scartare il surnatante. Risospendere il pellet con 200-400 µ l del 3% FBS/PBS e analizzare il campione sul citofluorimetro (Vedi Tabella materiali) sotto i canali appropriati. 7. caratterizzazione della morfologia di esosomi da microscopia elettronica a trasmissione (TEM) Difficoltà esosomi dispersioni acquose a concentrazioni adeguate come 1010 p/mL in soluzione di fissaggio (Vedi Tabella materiali) per 15 min. Posto i campioni su 300 mesh carbonio rivestito Rame griglie e lasciare all’aria secca. Macchia negativamente i campioni con acetato di uranile acquosa filtrata µm 0.22 (Vedi Tabella materiali) per 4 min seguita da due 50% metanolo/H2O di lavaggio (Vedi Tabella materiali). Asciugare all’aria il campione. Osservare i campioni sotto TEM (Vedi Tabella materiali). Impostare la tensione accelerare a 80 kV e la dimensione dello spot a 2. Utilizzare apertura dell’obiettivo con tutti i campioni. 8. siRNA incapsulamento in esosomi mediante elettroporazione Pre-raffreddare la cuvetta di elettroporazione (Vedi Tabella materiali) in ghiaccio per 30 minuti prima di elettroporazione. Mix 7.0 µ g di esosomi (32 µ l da 7 x 1012 stock p/mL in PBS) con 0.33 µ g di siRNA (12 µ l da 2 stock µM in acqua RNAsi-libera) nel tubo del microcentrifuge. Portare il volume a 150 µ l con buffer di acido citrico (Vedi Tabella materiali). In questo caso l’esosomi al rapporto molare siRNA sono 1: 60. Trasferire il composto in cuvetta di elettroporazione. La cuvetta di Cap e inserirlo nel supporto per cuvette della electroporator (Vedi Tabella materiali). Ruotare la rotella di rotazione 180° in senso orario.Nota: Posizione di blocco, in modo che la cuvetta contattare gli elettrodi, la ruota deve essere completamente spento. Selezionare il programma desiderato elettroporazione (ad es., X-01, X-05, A-20, T-20, T-30, ecc.) e avviare elettroporazione premendo il pulsante Start .Nota: Un impulso di successo è indicato mostrando “OK” sul display. Una volta elettroporate, rimuovere la provetta dopo la rotazione indietro la ruota di 180° in senso antiorario. Prelevare il campione da cuvette con la pipetta di plastica per l’ulteriore elaborazione. 9. rimozione di siRNA Free Using Size Exclusion Chromatography (SEC) Equilibrare la colonna SEC (2,9 centimetri [H] x 1,3 cm [W]; Vedi Tabella materiali) passando 3,5 mL di PBS filtrato due volte. Sciogliere 150 μL di campione individulamente in 350 μL di PBS filtrata e trasferire questo alla colonna SEC per eseguire la rimozione gratuita siRNA. Raccogliere la prima frazione di 500 μL eluiti dalla colonna (F0). Aggiungere 500 µ l di PBS filtrata alla colonna e raccogliere la frazione successiva di 500 μL (F1). Ripetere il passaggio precedente fino a quando è raccolti un totale di frazioni μL 10 x 500 (fino a F9). F1 e F2 dovrebbe contenere gli esosomi siRNA-incapsulato. Lavare la colonna con PBS filtrata (due volte, almeno) per eliminare eventuali residui di campione. 10. in Vitro assorbimento degli esosomi siRNA-caricati nelle cellule PANC-1 Cellule PANC-1 seme in piastre 24 pozzetti a fondo piatto (Vedi Tabella materiali) con una densità di 50.000 cellule per ben 24 ore prima l’assorbimento studiano e incubare le cellule nell’incubatrice (5% CO2, 37 ° C). Electroporate HEK-293 esosomi (7.0 μg) con Atto655-siRNA (0,33 μg) secondo passaggio 8. Purificare individulamente esosomi secondo passaggio 9 e risospendere in 100 μL di PBS. Aggiungere 50 μL degli esosomi individulamente PANC-1 cella e incubare a 37 ° C e 5% di CO2 per 4 h. Raccogliere le cellule dopo incubazione. Lavare le cellule con 1 mL di PBS sterile e risospendere in 200 μL di PBS in polistirolo rotonda-parte inferiore del tubo (Vedi Tabella materiali). Analizzare le cellule di cytometer di flusso (Vedi Tabella materiali) con 10.000 eventi acquisiti per campione.Nota: Campioni di miscela di ONU-individulamente esosomi-siRNA e cellule non trattate con PBS filtrati sono state utilizzate come controlli.

Representative Results

La caratterizzazione fisico-chimica degli esosomi isolati da cellule HEK-293 (Exo HEK-293) sono riassunti nella tabella 1. La dimensione misurata mediante analisi (NTA) strumento di rilevamento di nanoparticelle era 107.0 ± 8.2 nm. Esosomi resa dalle cellule HEK-293, anche analizzato usando lo strumento NTA, era 6.99 ± 0,22 x 1012 p/mL da mL ~ 24 cm (ottenuti da 2 giri del raccolto). Purezza di Exo HEK-293 valutato calcolando il rapporto della particella–proteina (poliziotto) era 8,3 ± 1,7 × 1010 p / µ g. La distribuzione di dimensione di isolato HEK-293 Exo è mostrata in Figura 3A. Analisi morfologica mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM) ha mostrato l’Exo HEK-293 erano strutture sferiche leggermente superiore a 100 nm in dimensione (Figura 3B). Questo risultato accosente con quello dalla misura della NTA (Figura 3A). La Exo HEK-293 isolato erano positive per il CD81, CD9 e CD63, che sono indicatori canonici utilizzati per identificare le vescicole come esosomi (Figura 3). Per la purificazione degli esosomi usando la cromatografia di esclusione di formato (Figura 4), la percentuale di recupero di esosomi è stato calcolato dividendo il numero di particelle di esosomi totale recuperato in 10 frazioni raccolte (F0-F9) con l’iniziale esosomi numero di particelle utilizzato, mentre la percentuale di recupero di siRNA è stato calcolato dividendo l’intensità di fluorescenza totale ottenuta da F3, F4 e F5 con l’intensità di fluorescenza totale ottenuta da tutti i 10 frazioni raccolte. Il recupero di esosomi e siRNA post-purificazione è stato calcolato come 75,0% e 80,4%, rispettivamente. L’efficienza di incapsulamento di siRNA in esosomi era ~ 10-20%, calcolato utilizzando la curva standard siRNA stabilita (Figura 4). Analisi qualitativa dell’assorbimento in vitro degli esosomi caricati con il fluorescente Atto655-siRNA tramite flusso cytometry ha mostrato che PANC-1 cellule trattate con siRNA-incapsulato esosomi registrato il più grande cambiamento nel segnale di fluorescenza (Figura 5A) . PANC-1 cellule trattate con siRNA-incapsulato esosomi registrata una percentuale più elevata della popolazione positiva per il segnale Atto655 (39,4%) rispetto ai trattati con scaricata miscela esosomi e siRNA (0,56%), che ha confermato l’osservazione sopra ( Figura 5B). Il grado di assorbimento cellulare di siRNA (espresso come la differenza di piega a valori di intensità (MFI) media di fluorescenza da quello delle cellule non trattate) inoltre è stato osservato per essere significativamente più alto in PANC-1 cellule trattate con siRNA-incapsulato esosomi (piega MFI differenza = 5.1) rispetto a quello trattato con la miscela di esosomi-siRNA (MFI piegare differenza = 1.1) (Figura 5). Queste osservazioni hanno dimostrato che gli esosomi siRNA-incapsulati sono stati interiorizzati dalle cellule PANC-1 e che ci hanno consegnato in modo efficace gli siRNA intracellulare. Figura 3: biochimica e analisi della morfologia di HEK-293 esosomi. (A) la distribuzione di HEK-293 esosomi usando Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) dimensione. La curva mostra un istogramma sovrapposto da 3 diversi cattura a intervallo di 30 s con aree di colore rosso che indica la deviazione standard tra misurazioni (n = 3). (B) immagini di microscopia elettronica in trasmissione (TEM) di ingenuo esosomi HEK-293. Barra della scala: 100 nm. (C) individuazione di marcatori exosomal CD81, CD9 e CD63 mediante citometria a flusso su HEK-293 esosomi. Gli esosomi sono stati accoppiati a granuli di lattice aldeide/solfato prima della rilevazione. Complesso di esosomi-perline successivamente sono stati macchiati con anticorpi anti-CD81, anti-CD9 e anti-CD63 fluorophore-coniugati. Grado di espressione dei marcatori sono espressi come la differenza di piega a valori di intensità (MFI) mediano di fluorescenza da quello del controllo (complesso di esosomi-perline colorata con l’isotipo corrispondente). I valori sono espressi come media ± SD, dove n = 3. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: esosomi purificazione post-elettroporazione. (A) profili di eluizione (F0-F9) di Atto655-siRNA e individulamente esosomi usando chormatography di esclusione di formato. (B), NTA analisi di Atto655-siRNA ed esosomi da F0 a F9 utilizzando chormatography di esclusione di formato. Curva (C) la taratura di Atto655 etichettati siRNA. Intensità di fluorescenza sono stati ottenuti dal lettore alla Ex / Em: 640-10/680 nm; Guadagno 2800. I valori sono espressi come media ± deviazione standard (n = 3). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5: l’assorbimento cellulare di esosomi siRNA-incapsulato nelle cellule PANC-1 a 4 h. (A) istogrammi confrontando l’assorbimento cellulare di esosomi scaricati + miscela di siRNA e siRNA-incapsulato esosomi. (B) confronto dell’assorbimento di esosomi scaricati + miscela di siRNA a 4 h di trama pseudocolor. (C) la differenza di piega in media di fluorescenza (MFI) i valori di intensità dei campioni testati rispetto a quella di cellule non trattate. I valori sono espressi come media ± SD, dove n = 3. P < 0,001. NS: non significativo. One-way ANOVA è stato utilizzato per l'analisi statistica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Esosomi Dimensioni1,2(nm) Resa1, 2,3(p/mL) [Proteina] 2,4(µ g/mL) Particella / proteine (poliziotto) rapporto5(p / µ g) HEK-293 107.0 ± 8.2 6.99 ± 0,22 x 1012 84,3 ± 9,8 8,3 ± 1,7 x 1010  1 misurato utilizzando nanoparticle tracking analysis (strumento NTA)2 i valori sono espressi come media ± SD, dove n = 33 resa è stata ottenuta dalla cella-condizionato media pool da 2 giri di raccolta da boccette bioreattore (~ 24 mL)4 misurato utilizzando un kit di analisi della proteina5 valore ottenuto usando la formula: rapporto studente = rendimento / [proteina] Tabella 1: Caratterizzazione fisico-chimica di esosomi.

Discussion

Per ottenere un rendimento decente esosomi da cellule coltivate, che sono abbastanza per diversi cicli di studi in vitro o in vivo , è ancora una sfida. Secondo il costruttore, le beute di bioreattore erano destinate alla produzione di anticorpi e proteine con alto rendimento dalla cultura di varie linee cellulari immortalizzate. Questo permette alle cellule di arricchire continuamente il terreno di coltura con il prodotto desiderato, risultante in un concentrato medium condizionato (CM) nel compartimento cellulare. Teoricamente, lo stesso concetto sarebbe utile nella produzione di esosomi da varie linee cellulari, e infatti la coltura queste cellule in beute bioreattore è stata dimostrata di aumentare significativamente la resa di esosomi40. Il grande serbatoio medio continuamente fornisce le sostanze nutrienti per e rimuove i rifiuti dal compartimento cellulare attraverso una membrana semi-permeabile 10 kDa, che permette la coltura prolungata senza richiedere un grande volume di media per essere a contatto con le cellule, o regolare Boccette cambiando, che in definitiva possono salvare il costo complessivo e del lavoro di alto-scala esosomi produzione40. È stato anche dimostrato che la morfologia, fenotipo, nonché le funzioni immunomodulatorie di esosomi isolato cellule culture di boccette di bioreattore a lungo termine sono simili a quelle provenienti da cellule coltivate in regolari 75cm2 boccette40. Cultura di altre linee cellulari immortalizzate come fonti di esosomi nella beuta di bioreattore contribuirebbe pertanto aumentare il loro rendimento di esosomi pur mantenendo l’integrità e la funzione. Questa forma di cultura è tuttavia non applicabile alle cellule primarie con cicli di divisione limitata e quelli che non può essere coltivato in alta densità.

Poiché raccolta del CM viene effettuata settimanalmente e mai sono state attraversate le cellule in coltura, si può presumere che le cellule nella beuta di bioreattore non stanno crescendo in un monostrato come la coltura delle cellule normali. Sono più propensi a formare ammassi con centri necrotici, o semplicemente staccare dalla superficie e muoiono quando le celle sono troppo confluenti per un monostrato. Ispezione visiva del compartimento delle cellule del matraccio bioreattore non è possibile confermare questa ipotesi, ma si riflette dal gran numero di cellule morte ottenuta durante la raccolta di CM. Prelievo regolare di cellule scarsamente aderente e non vitali dalla beuta bioreattore può prevenire l’accumulo di materiali sulla membrana semi-permeabile che possono influenzare negativamente lo scambio di gas, sostanze nutritive e rifiuti tra il compartimento cellulare ed il mezzo serbatoio, permettendo così la coltura prolungata in beute bioreattore per > 6 mesi40. In questo contesto, questa non-regolarità della crescita delle cellule in beute bioreattore è ideale come Speculiamo che imita più da vicino di coltura delle cellule monostrato convenzionale lo stato effettivo della crescita del tumore in vivo , e si spera che gli esosomi prodotto dal cancro cellule nella beuta di bioreattore sarebbe più simile a quello secreto dai tumori in vivo. Questo sarebbe particolarmente utile negli studi che esaminano il ruolo degli esosomi tumore-derivato nella progressione della patologia tumorale. Esosomi tumore-derivati sono stati segnalati a intrinsecamente e preferenzialmente a casa al loro tessuto di origine32, quindi avendo esosomi prodotti in un sistema che imita loro in vivo produzione inoltre sarebbe auspicabile in studi guardando esplorare la possibilità di targeting passiva di esosomi come nanovettori di droga.

Il rapporto del poliziotto è stato segnalato come un parametro per valutare la purezza degli esosomi isolati da contaminanti proteine da terreno di coltura di fluidi fisiologici, da cui gli esosomi sono stati reperiti da41. Il rapporto del poliziotto di 8,3 ± 1,7 × 1010 p / µ g ottenuti in questo studio cade all’interno della gamma di elevata purezza proposta nello studio. Questo rapporto evidenzia il pericolo dell’utilizzo di concentrazione nella proteina di esprimere il rendimento o la dose di esosomi isolati o utilizzato negli studi a valle, rispettivamente, come questo non riflette la vera quantità di esosomi disponibile nell’esempio dato il problema della proteina contaminazione durante l’isolamento. NTA tramite strumenti quali NanoSight, che misura la concentrazione di esosomi in termini di numero di particelle, è un modo più sensibile e accurato di quantificare gli esosomi.

Pesatura altamente accurata durante la preparazione della soluzione di saccarosio al 25% in ossido di deuterio è fondamentale poiché questo metodo è un isolamento basati su densità. Esosomi dispone di una gamma piuttosto ristretta di densità di flottazione nella soluzione di saccarosio così accurata preparazione del cuscino del saccarosio ridurrà la contaminazione del non-exosomal vescicole come corpi apoptotici o vescicole di Golgi-derivato durante l’isolamento42. Si consiglia di non tenere la soluzione di saccarosio avanzi e usarlo anche dopo un giorno in modo da evitare il rischio di fattori che possono alterare la sua densità come la perdita o l’aggiunta di acqua nella soluzione da evaporazione o condensazione dell’aria nel tubo. Utilizzo di un rotore è inoltre essenziale durante la centrifugazione sul cuscino di saccarosio per consentire la migrazione anche di esosomi dai CM per la soluzione di saccarosio.

Ritirare la post-centrifugazione soluzione di saccarosio è anche un passaggio delicato, e si tratta di trovare un compromesso tra massimizzare la quantità di esosomi recuperati e non troppo che proteina da terreno di coltura è stato introdotto per il campione di esosomi ritirato . L’interfaccia tra la soluzione di saccarosio ed il mezzo di condizione è dove proteine da terreno di coltura sarebbero raccogliere post-centrifugazione e di solito possono essere visto come un anello marrone scuro che si trova sull’interfaccia. Nelle nostre mani, prelevare 2 mL del cuscino del saccarosio dall’iniziale 3ml aggiunto è il volume ottimale che concorda con il compromesso di cui sopra. I volumi descritti in questo protocollo sono per i rotori specifici utilizzati; Pertanto, si consiglia di ottimizzare il volume di saccarosio ad essere ritirati durante il ridimensionamento verso l’alto o verso il basso i volumi per i tipi di rotori disponibili in diverse strutture. È anche importante evitare la zona, proprio al centro della parte inferiore del tubo quando ritirare il saccarosio, come questo è dove le particelle di densità maggiore rispetto al saccarosio saranno sedimento e di solito può essere visto come una pallina di colore bianco avorio.

La fase di lavaggio con una quantità relativamente grande di PBS contribuisce a ridurre ulteriormente il grado di contaminazione della proteina durante esosomi isolamento41. Questo passaggio è anche essenziale nella rimozione di saccarosio in eccesso da esosomi in modo da evitare di danneggiare gli esosomi osmotico se stessi o le biomolecole all’interno del lume di exosomal, come pure riducendo il rischio di crescita batterica e/o fungina in stock da esosomi. Preparazione della soluzione di saccarosio in ossido di deuterio, piuttosto che l’acqua aiuta a ridurre la quantità di saccarosio necessario per ottenere la densità di flottazione esosomi per isolamento, quindi riducendo il rischio di danno osmotico e di contaminazione microbica. Dopo la centrifugazione prima sul cuscino di saccarosio, esosomi-contenenti saccarosio strato ritirato e aggiunto il PBS può essere conservato a 4 ° C e trattata il giorno seguente, se affrontato con vincoli di tempo.

Al meglio della nostra conoscenza, il rapporto molare di esosomi/siRNA è un fattore importante nel determinare l’efficienza dell’elettroporazione. In questo protocollo, abbiamo usato 1: 60 come l’esosomi al rapporto molare siRNA. Come la capacità di incapsulamento di diversi tipi di esosomi sono diversi, consigliamo vivamente questo per essere ottimizzati su un caso per caso. Tuttavia, l’efficienza di incapsulamento qui proposto può essere sempre un parametro per selezionare le condizioni ottimali di elettroporazione.

Inoltre, l’aggregazione di siRNA è creduto per essere uno dei problemi più comuni in elettroporazione. È dimostrato che elettroporazione può indurre aggregazione forte di siRNA, rendendo ancora più difficile entrare esosomi. siRNA aggregazioni sono spesso erroneamente interpretate come incapsulamento di siRNA in esosomi pertanto adeguati controlli sono stati utilizzati in questo studio, come la formazione di aggregati di siRNA è inevitabile durante l’elettroporazione28. L’efficienza di incapsulamento di percentuale del nostro metodo di purificazione è stata calcolata utilizzando valori normalizzati per minimizzare l’influenza da altre fonti quali le aggregazioni di siRNA, esosomi e rumore di sfondo che interesserebbero l’affidabilità dei dati. Basato sui nostri risultati, c’era trascurabile siRNA aggregazioni osservate nel controllo campione cioè, utilizzando siRNA individulamente e ONU-individulamente.

Questo protocollo ha dimostrato con successo l’incapsulamento di siRNA in esosomi e loro successiva consegna intracellulare degli siRNA al cancro cellule in vitro. Di conseguenza, vari tipi di esosomi da diverse linee cellulari possono essere isolati e caratterizzati utilizzando il protocollo proposto e successivamente caricato con siRNA terapeutici diversi per diversi tipi di obiettivi oncogenici sovra-espressi in diversi tipi di cancro. Un’applicazione interessante sarebbe quello di esplorare l’efficienza di consegna e l’assorbimento di siRNA utilizzando varie permutazioni di esosomi origine-destinazione cella coppia in vitro. Questo può poi essere tradotto a modelli animali per valutare l’efficienza sia la consegna e l’efficacia terapeutica degli esosomi siRNA-incapsulato in vivo.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

F. N. Faruqu è finanziato dall’agenzia governo malese Majlis Amanah Rakyat (MARA). L. Xu è un destinatario delle borse individuali di Marie Sklodowska-Curie (Orizzonte 2020) (H2020-MSCA-IF-2016). K. T. Al-Jamal riconosce finanziamenti BBSRC (BB/J008656/1) e Wellcome Trust (WT103913). Gli autori inoltre ringraziare Dr Paul Lavender e Dr David Fear (dipartimento di medicina respiratoria e Allergia, College Londra del re) per il conferimento della electroporator.

Materials

Material
Sterile Newborn Calf Serum Heat Inactivated First Link 08-05-850 500 ml
EMEM medium Thermo Fisher Scientific 11090081 500 ml
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140-122 100 ml
GlutaMax Thermo Fisher Scientific 35050-038 100 ml
Sucrose Fisher Scientific S/8600/60 1 kg
Deuterium oxide (D2O) Sigma-Aldrich 151882 250 g
1X Phosphate Buffered Saline  Thermo Fisher Scientific 10010015 500 ml
Glycine VWR Chemicals 101196X 1 kg
Sepharose CL-2B GE Healthcare Life Sciences 17-0140-01 1 L; Particle Size 60 μm-200 μm
Trypsin-EDTA 0.05% Thermo Fisher Scientific 25300096 100 ml
Aldehyde/sulfate latex beads Thermo Fisher Scientific A37304 4% w/v, 4 µm, 15 ml
MicroBCA kit Thermo Fisher Scientific 23235
CD81 antibody (APC) Thermo Fisher Scientific 17-0819-42 Lot: E15950-104. RRID: AB_11150235. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD81 isotype (APC) Thermo Fisher Scientific 17-4714-81  Lot: 4291563. RRID: AB_763650. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD9 antibody (FITC) Thermo Fisher Scientific 11-0098-41 Lot: 4345870. RRID: AB_10698007. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD9 isotype (FITC) Thermo Fisher Scientific 11-4714-41 Lot: 4299784. RRID: AB_10598647. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD63 antibody (PE) Thermo Fisher Scientific 12-0639-41 Lot: 1930435. RRID: AB_2572564. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD63 isotype (PE) Thermo Fisher Scientific 12-4714-81 Lot: 1937696. RRID: AB_470059. 1:10 dilution in 50 µl sample
Atto655-siRNA Eurogentec     SQ-SIRNA (Labelled-S) UGC-GCU-ACG-AUC-GAC-GAU-G55; (Unlabelled-AS) CAU-CGU-CGA-UCG-UAG-CGC-A55.
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm Millipore SLGP033RS
CELLine AD1000 bioreactor flasks Wheaton WCL1000ad
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima XPN-80
Swing-out rotor Beckman Coulter SW45 Ti
Fixed-angle rotor Beckman Coulter Type 70 Ti
Ultracentrifuge tubes Beckman Coulter 355631 Polycarbonate. Max. fill 32 ml
Ultracentrifuge bottles Beckman Coulter 355618 Polycarbonate. Min. fill 16 ml, max. fill 25 ml
NanoSight Malvern LM10 Software: NanoSight NTA v3.2
Flow Cytometer BD Biosciences FACSCalibur
Centrifuge Eppendorf 5810R
Plate reader BMG Labtech FLUOstar Omega
Flow cytometry tubes BD Biosciences, Falcon 352052
Microfuge tubes Starlab S1615-5500 1.5 ml
Cell culture flasks Fisher Scientific 156499 75 cm2
Transmission electron microscope FEI Electron Optics Philips CM 12 with Tungsten filament and a Veleta – 2k × 2k side-mounted TEM CCD Camera (Olympus, Japan)
Amaxa Nucleofector I Lonza Nucleofector I with Amaxa’s Nucleofector Kits
24-well flat-bottom plates Corning Costar
Blunt fill needle BD Biosciences 305180 18G x 1 1/2" (1.2 mm x 40 mm)
Glass pipettes Fisher Scientific 1156-6963
Name Company Catalog Number Comments
Reagents Composition
Normal medium Eagle's Minimum Essential Medium supplemented with 10% foetal bovine serum (FBS), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax.
Exosome-depleted medium Eagle's Minimum Essential Medium supplemented with 10% exosome-depleted FBS (see below), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax.
Exosome-depleted FBS Subject FBS to ultracentrifugation at 100,000 g for 18 h at 4°C. The FBS supernatant post-centrifugation was collected and sterile-filtered using 0.22 µm filters.
25% w/w sucrose cushion Add 1.9 g (± 0.001 g) of sucrose in a universal tube, and top up with D2O until the weight reaches 7.6 g (± 0.001 g). This makes ~6ml of the 25% w/w sucrose cushion.
3% FBS/PBS Add 1.5 ml exosome-depleted FBS to 48.5 ml 1X PBS to prepare 50 ml of 3% FBS/PBS.
100 µM BSA solution Prepare 1mM BSA solution by adding 0.3325 g to 50 ml PBS. Make 1:10 dilution of this stock to obtain 100 µM BSA solution. Make 5-10 µl aliqouts of this 100 µM BSA solution (for single use) and store them at -20°C. All BSA solution should be stored at -20°C, and discard solutions that have undergone ≥2 freeze-thaw cycles.
100 mM glycine solution Add 0.375 g of glycine to 50 ml PBS to obtain 100 mM glycine solution, store at 4°C.
Citric acid buffer with EDTA Mix 0.1954 g citric acid and 0.2087 g disodium phosphate in 50 mL of deionised water. Add EDTA to 0.1 mM. Adjust pH to 4.4.
Fixing solution Prepare formaldehyde/glutaraldehyde, 2.5% (w/v) each in 0.1 M sodium cacodylate buffer, and adjust pH to 7.4.
Aqueous uranyl acetate Prepare 25% (v/v) uranyl acetate in methanol.
50% methanol/H2O Mix methanol and H2O 1:1 (v/v).
SEC Column packed with Sepharose CL-2B Dilute 37.5 ml Sepharose CL-2B resin with 12.5 ml PBS to obtain 75% Sepharose CL-2B solution. Pour the Sepharose CL-2B solution into a column of dimension 2.9 cm [H] x 1.3 cm [W]. Pour the Sepharose CL-2B to 3-4 mm above the stated height, and then press it down to the stated height with the filter for optimal packing.
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Faruqu, F. N., Xu, L., Al-Jamal, K. T. Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells. J. Vis. Exp. (142), e58814, doi:10.3791/58814 (2018).
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