Exosome הוא דור חדש של ספקיות שירות משלוח סמים. הקמנו פרוטוקול בידוד exosome עם תשואה גבוהה וטוהר למסירה siRNA. אנו גם אנקפסולציה siRNA שאינם ספציפיים שכותרתה fluorescently לתוך exosomes, חקר את ספיגת הסלולר של siRNA טעונים exosomes בתאים סרטניים.
שלפוחית חוץ-תאית, ב- exosomes מסוים, לאחרונה השיגו עניין כמו סמים הרומן משלוח וקטורים עקב שלהם ממקור ביולוגי, שפע, ויכולת מהותי במשלוח המערכת של מולקולות שונות. עבודה זו מבססת פרוטוקול בידוד כדי להשיג תשואה גבוהה ועל טוהר גבוהה של exosomes למסירה siRNA. תאי הכליה עובריים אנושיים (תאים HEK-293) מתורבתים ב ביוריאקטור מבחנות וקצרו התרבות supernatant (המכונה לכאן בזמן שנסעתי בינוני ממוזגים) היא על בסיס שבועי כדי לאפשר העשרת HEK-293 exosomes. המדיום ממוזגים (ס מ) אינה מסומנת מראש של תאים מתים ופסולת התאית על ידי צנטריפוגה דיפרנציאלית, הוא נתון ultracentrifugation על גבי כרית סוכרוז ואחריו צעד כביסה, כדי לאסוף את exosomes. מבודדים HEK-293 exosomes מאופיינים לביטוי סמן התשואה, מורפולוגיה, exosomal על ידי ניתוח מעקב ננו-חלקיק, כימות חלבון, מיקרוסקופ אלקטרונים cytometry זרימה, בהתאמה. RNA קטנים מפריעות (siRNA), המסומנת fluorescently Atto655, נטען exosomes על ידי אלקטרופורציה, עודף siRNA יוסר על ידי סינון ג’ל. ספיגת תאים בתאי סרטן PANC-1, לאחר דגירה 24 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס, אושר על ידי cytometry זרימה. HEK-293 exosomes הם nm 107.0 ± 8.2 בקוטר. יחס יחס (P:P) exosome תשואה של חלקיקים-כדי-חלבון הם ב- 6.99 ± 0.22 × 1012 חלקיקים/mL ו חלקיקים10 ± 8.3 1.7 × 10/µg, בהתאמה. היעילות כימוס של siRNA ב exosomes הוא ~ 10-20%. 40% של התאים מראים אותות חיוביים עבור Atto655 ב 24 שעות שלאחר הדגירה. לסיכום, בידוד exosome על ידי ultracentrifugation על גבי כרית סוכרוז מציע שילוב של התשואה טוב וטוהר. siRNA היתה אפשרות לטעון בהצלחה לתוך exosomes על ידי אלקטרופורציה ונשלח לאחר מכן לתוך תאים סרטניים במבחנה. פרוטוקול זה מציע נוהל סטנדרטי של פיתוח שנטענו siRNA exosomes למסירה יעיל תאים סרטניים.
Exosomes תת סוג של שלפוחית חוץ-תאית (EV) הנע בין 50-200 ננומטר בקוטר, מופרש על ידי סוגי תאים שונים כגון תאים חיסוניים1,2, סרטן בתאי3,4,5, 6 7תאי גזע. Exosomes יש גם הוכח להיות נוכח10,9,8,נוזלים פיזיולוגיים שונים11. השילוב של יכולת מובנית של exosomes נושאים שונים מולקולות (למשל, RNA וחלבונים)12,13,14 ומסירה יעיל של מולקולות אלה לתוך תאים הנמען 15 , 16 , 17 להתעניינות של הפוטנציאל שלהם כמו וקטורים משלוח סמים בקנה מידה ננו. מולקולות קטנות שונות לשמש נגד סרטן ותרופות אנטי דלקתיות הפגינו שיש לטעון בהצלחה לתוך exosomes, ונמסר היעד תאים18,19,20, 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. מעניין, חומצות גרעין כגון siRNA28,29 ו- microRNA30 יש גם בהצלחה נטענת לתוך exosomes ויה אלקטרופורציה, מועברת לתאי המטרה.
לאחרונה, ה-RNA הפרעה (RNAi) דרך קטן מפריעות RNA (siRNA) צברה יותר עניין כמנגנון המועדפת ב ג’ין להחרשת עקב ירידה לפרטים גבוה שלה, אפקט חזק, תופעות לוואי מינימליות וקלות של siRNA סינתזה28, 29. siRNAs הם מולקולות RNA גדילי זוגית ועד 19 נוקלאוטידים 25 אורך זה נוקאאוט mRNA מפעילים קטליטי רצף ספציפי. בשל משקל מולקולרי גדול שלה polyanionic הטבע, ספיגת פסיבי של siRNA עירום לתוך התאים הוא הפריע28,29. . זה גם לא אפשרי עבור siRNA עירום להיות מוזרק למחזור הדם מערכתית עקב להשפלה מהירה על ידי פלזמה nucleases31 לפיכך, ומגעים siRNA ב nanocarrier הסיוע יעילה של ספיגת של siRNA לתוך תאי היעד.
Exosomes הם מערכת אידיאלית לצורך כימוס siRNA המבנה שלו מורכבת גרעין חלול, מימית עטוף בקליפה bilayer פוספוליפיד. Exosomes לא רק יש יציבות טובה בדם, אך יש גם מאפיינים מיקוד טבעי כדי לספק RNA פונקציונלי לתוך תאים32. המחקר שנערך על ידי. אלוורז-Erviti et al. בהצלחה הפגינו יעיל מסירת siRNA אל מוחותיהם של עכברים באמצעות הנדסה לאחור exosomes עם כמעט אין סיבוכים31. זה זה שיערו כי טיפול המבוסס על exosome הוא בטוח יחסית יותר טיפולים אחרים כמו exosomes אינם משתכפלים endogenously תאים היה, לכן לא נספח מאפייני גרורתי15.
שיטות שונות דווחו לבודד בהצלחה exosomes תרבית תאים או נוזלים פיזיולוגיים. השיטה הפופולרית ביותר משתמש ultracentrifugation כדי הצניפה exosomes מן ההתחלה גשמי31,32,33. שיטה זו יכולה להיות די קשה על exosomes, בדרך כלל חלבונים פוחת משקעים שיתוף מדגם. שילוב ultracentrifugation עם הפרדה המבוססת על צפיפות כגון מעברי צבע סוכרוז הופכת שכיחה יותר, כדי לצמצם זיהום חלבון לבין הלא-exosomal ב-19,exosomes מבודדים34. גודל-הדרה כרומטוגרפיה (שניות) מאפשר הפרדה בין exosomes של סוגים אחרים של שלפוחית חוץ-תאית (EV) על-ידי גודל ואני יכול גם לגרום לזיהום חלבון מינימלית אבל הוא מוגבל על ידי כמות קטנה של חומר זה יכול לעבד35, החל 36. לכידת Immunoaffinity משתמשת חרוזים מצופה נוגדנים לאגד exosomal פני שטח חלבונים כגון tetraspanins או הסמן השני התא הספציפי המאפשר ללכוד ספציפיות של exosomes יותר מאשר EVs או חלבונים אחרים, כמו גם לבודד את אוכלוסיית תתי exosomes של כל דגימות, אבל שוב הוא מוגבל על ידי כמות החל חומר והוא יקר36,37. מבוסס פולימר משקעים של exosomes נהגה להיות פופולרי מדי, אבל מאז זה משקעים גולמי למדי, זה מוביל גבוה שאינו exosomal שלפוחית וחלבון זיהום38,39.
אלקטרופורציה דווח על שלה יעילות כשיטה לטעון exosomes עם siRNA עקב חלבון צבירת15,28,31. גישות מבוססות-תקנים היו הפגינו שיהיה כדאי להעמיס חלבון יציבות ויעילות, אבל הוא לא רצויים בשל שלה רעילות תופעות לוואי של תרביות תאים סוכנים של שינוי בביטוי גנים הסלולר28. לפיכך, אלקטרופורציה כבר יותר בשימוש נרחב ב siRNA loading exosomes כמו זו שיטה בטוחה יותר. עם זאת, שיטת אופטימיזציה כימוס צריך להיות הוקמה על מנת לספק כמות מספקת של siRNA לאתר היעד עבור נוקאאוט גנטי חזק.
כאן, אנו מציעים פרוטוקול בידוד exosome משתמש המבוסס על צפיפות ultracentrifugation על גבי פשוט בודד 25% (w/w) סוכרוז כרית המבושלות דאוטריום תחמוצת, במקום הדרגתי צפיפות סוכרוז. זוהי שיטה חסכונית זה עוקף ההכנה הדרגתיות צפיפות מפרך, מאפשרת עיבוד של כמויות גדולות של החומר מתחיל, אולם התוצאה exosomes שלם של תשואה גבוהה וטוהר מתאים לטעינה הבאים עם siRNA. פלורסנט Atto655 מצומדת שאינם ספציפיים siRNA נטען לתוך הכליה עובריים אנושיים תאים (תאים HEK-293) נגזר exosomes ויה אלקטרופורציה ומסר לתאי סרטן אדנוקרצינומה בלבלב האנושי (PANC-1) אין ויטרו.
השגת תשואה סבירה exosome של תאים בתרבית, אשר מספיקים בשביל כמה סבבים של לימודי חוץ גופית בתוך או ויוו , הוא עדיין אתגר. לדברי היצרן, המבחנות ביוריאקטור נועדו לייצור נוגדנים וחלבונים עם תשואה גבוהה מתרבות של שורות תאים מונצחים שונים. דבר זה מאפשר לתאים ללא הרף להעשיר את המדיום תרבות עם המוצר הרצוי, והתוצאה היא מדיום ממוזגים מרוכז (ס מ) בתוך התא-התא. באופן תיאורטי, אותו הקונספט יהיה מועיל בייצור exosome של שורות תאים שונים, אכן culturing תאים אלה בתוך המבחנות ביוריאקטור הודגם להגדיל משמעותית את התשואה exosome40. המאגר בינוני גדול ברציפות אספקת חומרי הזנה ומסירה פסולת של התא לתא דרך קרום חדיר למחצה 10 kDa, ומאפשר תרבות ממושך ללא צורך כמויות גדולות של בינוני עם התאים, או רגיל מבחנות משתנה, אשר יכול בסופו של דבר להציל את העלות הכוללת ועבודה של ייצור גבוהה-סולם exosome40. גם הוכח כי המורפולוגיה, פנוטיפ, כמו גם את הפונקציות immunomodulatory של exosomes מבודדים תאים לטווח ארוך ביוריאקטור מבחנות שהתרבויות דומה לזה הטרייה תאים תרבותי ב רגיל 75 ס מ2 מבחנות40. תרבות של שורות תאים מונצחים אחרים כמקורות exosome בתוך הבקבוק ביוריאקטור יעזור לכן להגדיל את התשואה שלהם exosome תוך שמירה על תקינות ותפקוד שלהם. צורה זו של תרבות היא אולם לא ישים על ראשי תאים עם מחזורי חלוקה מוגבל, ואלה זה לא יכול להיות תרבותי בצפיפות גבוהה.
כיוון הקציר ס מ מתבצע אחת לשבוע, התאים בתרבות מעולם לא היו passaged, ניתן להניח כי התאים הבקבוקון ביוריאקטור לא צומחות ב טפט כמו התרבות התא הרגיל. הם ככל הנראה בצורת אשכולות עם נמק מרכזי, או פשוט ניתוק מן השטח למות אם התאים נמצאים גם confluent עבור טפט. בדיקה ויזואלית של התא לתא + בקבוקי שתייה צידניות ביוריאקטור אינה אפשרית לאשר הנחה זו, אבל הוא בא לידי ביטוי מספר גדול של תאים מתים שהתקבל במהלך מהקצירה ס מ. הסרת רגיל לקוי חסיד ותאי כלכלית מן הבקבוק ביוריאקטור יכול למנוע הצטברות של חומרים על קרום חדיר למחצה, אשר עלולה להשפיע לרעה על חילופי גז, חומרים מזינים, פסולת בין התא לתא את המדיום מאגר המים, ובכך מאפשר התרבות ממושך המבחנות ביוריאקטור עבור > 6 חודשים40. בהקשר זה, זה שאינו קבוע של גידול תאים של המבחנות ביוריאקטור הוא אידיאלי כפי אנו לשער כי היא מחקה את המצב האמיתי של הגידול בצמיחה ויוו באופן הדוק יותר התרבות תאים חד שכבתי המקובלת, יש לקוות כי exosomes הופק על ידי הסרטן בתאים הבקבוקון ביוריאקטור יהיה יותר דומה לזה מופרש על ידי גידולים בתוך vivo. זה יהיה מועיל במיוחד במחקרים בודקים התפקיד של גידול, נגזר exosomes בהתקדמות של הפתולוגיה הגידול. Exosomes נגזר הגידול דווח ממהותם, מעדיפים הביתה לרקמות שלהם של מקור32, לכן יש exosomes המיוצר במערכת מחקה שלהם ויוו הייצור גם יהיה רצוי במחקרים מסתכל חקר את היכולת מיקוד פסיבי של exosomes סמים nanocarriers.
היחס P:P דווח כפרמטר כדי להעריך את טוהר exosomes מבודדים ובלחות חלבונים של המדיום תרבות של נוזלים פיזיולוגיים שממנו היו exosomes הטרייה41. היחס P:P של 8.3 ± 1.7 × 1010 p/µg שהושגו במחקר זה נופל בתוך הטווח טוהר גבוהה המוצע במחקר. יחס זה מדגיש את הסכנה של שימוש ריכוז חלבון כדי לבטא את התשואה או מנה של exosomes מבודדים או שימוש במחקרים במורד הזרם בהתאמה, כמו זה אינו משקף את כמות exosomes זמין במדגם נתון בבעיה של חלבון האמיתי זיהום במהלך בידוד. נ באמצעות כלים כגון NanoSight, אשר מודד את ריכוז exosomes מבחינת מספר החלקיקים, היא דרך הגיונית יותר ומדויק לכמת exosomes.
שקילה ומדויקים במהלך הכנת הפתרון סוכרוז 25% תחמוצת דאוטריום חיוני כמו בשיטה זו הוא בידוד מבוסס-צפיפות. Exosomes יש מגוון צר של הנפקה צפיפות תמיסת סוכרוז כך מדויק הכנת כרית סוכרוז תפחית זיהום של הלא-exosomal שלפוחית כגון גופים אפופטוטיים להיפגע או שלפוחית גולג’י-derived במהלך בידוד42. מומלץ לא לשמור סוכרוז שאריות פתרון ולהשתמש בו גם לאחר יום אחד כדי למנוע סיכון של גורמים יכול לשנות את צפיפות כגון אובדן או תוספת של מים הפתרון על ידי אידוי או עיבוי של האוויר בצינור. שימוש של הרוטור והזזה חיוני גם במהלך צנטריפוגה על גבי כרית סוכרוז לאפשר העברה גם של exosomes מ ס הפתרון סוכרוז.
נסיגה של סוכרוז פתרון פוסט-צנטריפוגה הוא גם צעד עדין, זה כולל מציאת פשרה בין למקסם את כמות exosomes המשוחזר, ואני לא יותר מדי כי חלבון מאמצעי התרבות היא הציגה את הדגימה exosome מופנמים . הממשק בין הפתרון סוכרוז המדיום התנאי הוא שבו חלבונים של המדיום תרבות אוספים שלאחר צנטריפוגה, בדרך כלל ניתן לראות טבעת חום כהה, שיושב על הממשק. בידיים שלנו, מהאמנה 2 מ של כרית סוכרוז mL 3 הראשונית הוסיף הוא אמצעי האחסון האופטימלית מסכימה עם הפשרה שהוזכרו לעיל. אמצעי האחסון שמתואר פרוטוקול זה מיועדות הרוטורים מסוימים להשתמש; לכן, מומלץ כדי למטב את עוצמת הקול של סוכרוז כדי להיות מסוגר בעת שינוי קנה המידה למעלה או למטה את אמצעי האחסון עבור הסוגים של הרוטורים זמין במתקנים שונים. זה חשוב גם למנוע את הזכות אזור במרכז התחתון של הצינור בעת נסיגה של סוכרוז, כמו זה היא היכן חלקיקים של צפיפות גבוהה יותר מאשר סוכרוז המשקע יכול בדרך כלל ניתן לראות על גלולה תפר חוט רקמה אופווייט.
הצעד כביסה עם כמות יחסית גדולה של PBS מסייעת לצמצם עוד יותר את מידת חלבון זיהום במהלך exosome בידוד41. שלב זה חיוני גם הסרת עודפי סוכרוז exosomes כדי למנוע נזק osmotic exosomes עצמם או את מולקולות בתוך לומן exosomal, כמו גם להפחית את הסיכון של גידול חיידקי או פטרייתי במלאי exosome. מכינים את הפתרון סוכרוז ב דאוטריום תחמוצת יותר מאשר מים מסייעת להפחית את כמות סוכרוז צריך להשיג את הצפיפות הנפקה exosome לבידוד, ומכאן לצמצם את הסיכון של נזק osmotic והן זיהום מיקרוביאלי. לאחר צנטריפוגה הראשון על גבי כרית סוכרוז, המכיל exosome שכבה סוכרוז מסוגר ויצורפו לאיש, טוב, מגניב ניתן לאחסן ב 4 ° C ולעבד למחרת אם מתמודד עם אילוצי זמן.
לפי מיטב ידיעתנו, היחס טוחנת exosome/siRNA הוא גורם חשוב בקביעת יעילות אלקטרופורציה. ב פרוטוקול זה, השתמשנו יצירת כמו exosome יחס טוחנת siRNA. כפי היכולת כימוס של סוגים שונים של exosomes שונים, אנו ממליצים מאוד כדי להיות מותאם על בסיס מקרה לגופו. עם זאת, היעילות כימוס המוצע במסמך זה תמיד יכול להיות פרמטר עבור בחירת התנאים אלקטרופורציה אופטימלית.
בנוסף, צבירה של siRNA הוא האמין להיות אחד של הבעיה הנפוצה ביותר באלקטרופורציה. הוכח שאלקטרופורציה הזה יכול לגרום צבירה חזקה של siRNA, עושה את זה אפילו יותר קשה להיכנס exosomes. הצטברויות של siRNA מפורשים לעתים קרובות בטעות כפי ומגעים siRNA לפקדי ולכן ראוי exosome השתמשו במחקר זה כמו היווצרות של אגרגטים siRNA בלתי נמנע במהלך אלקטרופורציה28. כימוס אחוז יעילות שיטת טיהור שלנו מחושב באמצעות ערכים מנורמל כדי למזער את ההשפעה ממקורות אחרים, כגון רקע רעש, exosome ו- siRNA מצבורים שזה ישפיע על אמינות הנתונים. בהתבסס על הממצאים שלנו, היו מצבורים siRNA זניח שנצפתה על הבקרה מדגם קרי, באמצעות electroporated ו un-electroporated siRNA.
פרוטוקול זה הוכיח בהצלחה ומגעים siRNA לתוך exosomes, את הפנייה תאיים עוקבות של siRNA סרטן תאים בתוך חוץ גופית. לכן, סוגים שונים של exosomes של שורות תאים שונים יכול להיות מבודדת, מאופיין באמצעות פרוטוקול המוצעת ואת לאחר מכן עמוסה siRNA טיפוליים שונים עבור סוגים שונים של מטרות oncogenic ביטוי יתר סוגי סרטן שונים. יישום מעניין יהיה לחקור את משלוח siRNA ויעילות ספיגת באמצעות הגלגולים השונים של exosome מקור-יעד תא זוג חוץ גופית בתוך. זה אז יכול להיות מתורגם מודלים בבעלי חיים כדי להעריך את היעילות של הן את המשלוח ויעילות טיפולית אנקפסולציה siRNA exosomes ויוו.
The authors have nothing to disclose.
פ Faruqu ש ממומן על ידי הסוכנות ממשלת מלזיה Rakyat Amanah המג’לס (מרה). Xu ל’ הוא הנמען של מארי קירי Sklodowska בודדים המלגות (אופק 2020) (H2020-MSCA-אם-2016). קיי טי אל-ג’מל מאשר מימון BBSRC (BB/J008656/1) וטרסט (WT103913). המחברים גם רוצה תודה ד ר פול לבנדר, ד ר דוד פחד (המחלקה לרפואה נשימתית, אלרגיה, קולג ‘-לונדון קינגס) למתן את electroporator.
Material | |||
Sterile Newborn Calf Serum Heat Inactivated | First Link | 08-05-850 | 500 ml |
EMEM medium | Thermo Fisher Scientific | 11090081 | 500 ml |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | 100 ml |
GlutaMax | Thermo Fisher Scientific | 35050-038 | 100 ml |
Sucrose | Fisher Scientific | S/8600/60 | 1 kg |
Deuterium oxide (D2O) | Sigma-Aldrich | 151882 | 250 g |
1X Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific | 10010015 | 500 ml |
Glycine | VWR Chemicals | 101196X | 1 kg |
Sepharose CL-2B | GE Healthcare Life Sciences | 17-0140-01 | 1 L; Particle Size 60 μm-200 μm |
Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300096 | 100 ml |
Aldehyde/sulfate latex beads | Thermo Fisher Scientific | A37304 | 4% w/v, 4 µm, 15 ml |
MicroBCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23235 | |
CD81 antibody (APC) | Thermo Fisher Scientific | 17-0819-42 | Lot: E15950-104. RRID: AB_11150235. 1:10 dilution in 50 µl sample |
CD81 isotype (APC) | Thermo Fisher Scientific | 17-4714-81 | Lot: 4291563. RRID: AB_763650. 1:10 dilution in 50 µl sample |
CD9 antibody (FITC) | Thermo Fisher Scientific | 11-0098-41 | Lot: 4345870. RRID: AB_10698007. 1:10 dilution in 50 µl sample |
CD9 isotype (FITC) | Thermo Fisher Scientific | 11-4714-41 | Lot: 4299784. RRID: AB_10598647. 1:10 dilution in 50 µl sample |
CD63 antibody (PE) | Thermo Fisher Scientific | 12-0639-41 | Lot: 1930435. RRID: AB_2572564. 1:10 dilution in 50 µl sample |
CD63 isotype (PE) | Thermo Fisher Scientific | 12-4714-81 | Lot: 1937696. RRID: AB_470059. 1:10 dilution in 50 µl sample |
Atto655-siRNA | Eurogentec | SQ-SIRNA | (Labelled-S) UGC-GCU-ACG-AUC-GAC-GAU-G55; (Unlabelled-AS) CAU-CGU-CGA-UCG-UAG-CGC-A55. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm | Millipore | SLGP033RS | |
CELLine AD1000 bioreactor flasks | Wheaton | WCL1000ad | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima XPN-80 | |
Swing-out rotor | Beckman Coulter | SW45 Ti | |
Fixed-angle rotor | Beckman Coulter | Type 70 Ti | |
Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 355631 | Polycarbonate. Max. fill 32 ml |
Ultracentrifuge bottles | Beckman Coulter | 355618 | Polycarbonate. Min. fill 16 ml, max. fill 25 ml |
NanoSight | Malvern | LM10 | Software: NanoSight NTA v3.2 |
Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Plate reader | BMG Labtech | FLUOstar Omega | |
Flow cytometry tubes | BD Biosciences, Falcon | 352052 | |
Microfuge tubes | Starlab | S1615-5500 | 1.5 ml |
Cell culture flasks | Fisher Scientific | 156499 | 75 cm2 |
Transmission electron microscope | FEI Electron Optics | Philips CM 12 | with Tungsten filament and a Veleta – 2k × 2k side-mounted TEM CCD Camera (Olympus, Japan) |
Amaxa Nucleofector I | Lonza | Nucleofector I | with Amaxa’s Nucleofector Kits |
24-well flat-bottom plates | Corning | Costar | |
Blunt fill needle | BD Biosciences | 305180 | 18G x 1 1/2" (1.2 mm x 40 mm) |
Glass pipettes | Fisher Scientific | 1156-6963 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | Composition | ||
Normal medium | Eagle's Minimum Essential Medium supplemented with 10% foetal bovine serum (FBS), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax. | ||
Exosome-depleted medium | Eagle's Minimum Essential Medium supplemented with 10% exosome-depleted FBS (see below), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax. | ||
Exosome-depleted FBS | Subject FBS to ultracentrifugation at 100,000 g for 18 h at 4°C. The FBS supernatant post-centrifugation was collected and sterile-filtered using 0.22 µm filters. | ||
25% w/w sucrose cushion | Add 1.9 g (± 0.001 g) of sucrose in a universal tube, and top up with D2O until the weight reaches 7.6 g (± 0.001 g). This makes ~6ml of the 25% w/w sucrose cushion. | ||
3% FBS/PBS | Add 1.5 ml exosome-depleted FBS to 48.5 ml 1X PBS to prepare 50 ml of 3% FBS/PBS. | ||
100 µM BSA solution | Prepare 1mM BSA solution by adding 0.3325 g to 50 ml PBS. Make 1:10 dilution of this stock to obtain 100 µM BSA solution. Make 5-10 µl aliqouts of this 100 µM BSA solution (for single use) and store them at -20°C. All BSA solution should be stored at -20°C, and discard solutions that have undergone ≥2 freeze-thaw cycles. | ||
100 mM glycine solution | Add 0.375 g of glycine to 50 ml PBS to obtain 100 mM glycine solution, store at 4°C. | ||
Citric acid buffer with EDTA | Mix 0.1954 g citric acid and 0.2087 g disodium phosphate in 50 mL of deionised water. Add EDTA to 0.1 mM. Adjust pH to 4.4. | ||
Fixing solution | Prepare formaldehyde/glutaraldehyde, 2.5% (w/v) each in 0.1 M sodium cacodylate buffer, and adjust pH to 7.4. | ||
Aqueous uranyl acetate | Prepare 25% (v/v) uranyl acetate in methanol. | ||
50% methanol/H2O | Mix methanol and H2O 1:1 (v/v). | ||
SEC Column packed with Sepharose CL-2B | Dilute 37.5 ml Sepharose CL-2B resin with 12.5 ml PBS to obtain 75% Sepharose CL-2B solution. Pour the Sepharose CL-2B solution into a column of dimension 2.9 cm [H] x 1.3 cm [W]. Pour the Sepharose CL-2B to 3-4 mm above the stated height, and then press it down to the stated height with the filter for optimal packing. |