إعداد اكسوسوميس ل siRNA إيصالها إلى "الخلايا السرطانية"
Summary
اكسوسومي جيل جديد من حاملات تسليم المخدرات. وأنشأنا بروتوكولا عزلة اكسوسومي مع عالية الغلة والنقاء لتسليم siRNA. ونحن أيضا مغلفة المسمى فلوريسسينتلي غير محددة siRNA في اكسوسوميس والتحقيق استيعاب الخلوية لتحميل siRNA اكسوسوميس في الخلايا السرطانية.
Abstract
حويصلات خارج الخلية، في اكسوسوميس معينة، قد اكتسبت في الآونة الأخيرة الاهتمام كالمخدرات رواية ناقلات التسليم نظراً لأصل بيولوجي، ووفرة، والقدرة الذاتية في التسليم بين الخلايا من الجزيئات الحيوية المختلفة. ويحدد هذا العمل بروتوكولا عزل لتحقيق المردود العالي ودرجة نقاء عالية من اكسوسوميس لإيصال siRNA. تستزرع خلايا “الكلي الجنينية” البشرية (الخلايا HEK-293) في قوارير مفاعل حيوي وحصاد الثقافة طافية (الممتلكات المشار إليها كوسيلة مشروطة) على أساس أسبوعي للسماح لإثراء اكسوسوميس HEK-293. قبل إلغاء تحديد الخلايا الميتة والحطام الخلوية بالطرد المركزي التفاضلي المتوسطة مكيفة (سم) وهي تتعرض تنبيذ فائق على وسادة سكروز تليها خطوة غسيل، جمع في اكسوسوميس. تتميز اكسوسوميس HEK-293 معزولة للتعبير علامة الغلة ومورفولوجيا واكسوسومال نانوحبيبات تتبع التحليل الكمي البروتين والمجهر الإلكتروني والتدفق الخلوي، على التوالي. تم تحميله صغيرة تدخل الجيش الملكي النيبالي (siRNA)، المسمى فلوريسسينتلي مع Atto655، في اكسوسوميس انهانسر ويتم إزالة siRNA الزائدة عن طريق الترشيح هلام. ويؤكد الإقبال الخلية في الخلايا السرطانية PANC-1، بعد 24 ساعة في الحضانة عند 37 درجة مئوية، التدفق الخلوي. اكسوسوميس HEK-293 من 107.0 شمال البحر الأبيض المتوسط ± 8.2 في القطر. اكسوسومي الغلة والجسيمات للبروتين نسبة نسبة (P:P) هي 6.99 ± 0.22 × 1012 الجسيمات مليلتر والجسيمات10 ± 8.3 1.7 × 10/ميكروغرام، على التوالي. يتم تغليف كفاءة siRNA في اكسوسوميس ~ 10-20%. أربعين بالمائة الخلايا إظهار إشارات إيجابية ل Atto655 في 24 ساعة بعد انتهاء الحضانة. وفي الختام، عزل اكسوسومي بواسطة تنبيذ فائق على وسادة السكروز يوفر مزيجاً من محصول جيد والنقاء. يمكن تحميلها بنجاح في اكسوسوميس التي انهانسر siRNA وتسليمها في وقت لاحق إلى الخلايا السرطانية في المختبر. ويوفر هذا البروتوكول إجراءات موحدة لتطوير اكسوسوميس محملة siRNA للتسليم الفعال للخلايا السرطانية.
Introduction
اكسوسوميس نوع فرعي حويصلات خارج الخلية (EV) تتراوح بين 50-200 نانومتر في القطر، ويفرز بواسطة مختلف أنواع الخلايا مثل الخلايا المناعية1،2، خلايا السرطان3،،من45، 6 والخلايا الجذعية7. وقد أظهرت أيضا اكسوسوميس أن يكون حاضرا في مختلف السوائل الفيزيولوجية8،،،من910،11. أن الجمع بين القدرة الكامنة من اكسوسوميس على تحمل مختلف الجزيئات الحيوية (مثل الحمض النووي الريبي والبروتينات)12،،من1314 والإنجاز الفعال لهذه الجزيئات الحيوية في الخلايا المتلقية 15 , 16 , 17 اجتذب اهتماما لامكاناتهم كمقياس نانو المخدرات تسليم ناقلات. مختلف الجزيئات الصغيرة التي تخدم كما قد أثبتت تحميلها بنجاح إلى اكسوسوميس العقاقير المضادة للسرطان والالتهابات وتسليمها إلى هدف خلايا18،،من1920، 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27-من المثير للاهتمام، الأحماض النووية مثل siRNA،من2829 وميكرورنا30 أيضا تم تحميلها بنجاح في اكسوسوميس عن طريق انهانسر وتسليمها إلى الخلايا المستهدفة.
في الآونة الأخيرة، اكتسب الجيش الملكي النيبالي التدخل ([رني]) عن طريق رنا التدخل الصغيرة (siRNA) مزيدا من الاهتمام كآلية المفضل في إسكات الجينات نظراً لخصوصية عالية وتأثير قوي، والحد الأدنى من الآثار الجانبية وسهولة siRNA توليف28، 29. سيرناس جزيئات الحمض النووي الريبي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل تتراوح ما بين 19 إلى 25 النيوكليوتيدات في طول هذه المشغلات الخاصة بتسلسل الحفاز مرناً ضربة قاضية. نظراً للوزن الجزيئي كبير وطبيعة بوليانيونيك، هو السلبي الإقبال siRNA عارية في خلايا أعاقت28،29. كما أنها لا يمكن siRNA عاريا بالحقن إلى الدوران الجهازي بسبب التدهور السريع بالبلازما نوكليسيس31. وهكذا، سيساعد تغليف siRNA في nanocarrier الإنجاز الفعال والإقبال على siRNA في الخلايا الهدف.
اكسوسوميس نظام مثالي لتغليف siRNA هيكلها يتكون من نواة جوفاء، مائي يلفها ببلير فسفوليبيد. اكسوسوميس استقرار جيدة في الدم بل لها أيضا خصائص استهداف الطبيعية لتسليم الوظيفية الحمض النووي الريبي في الخلايا32. أظهرت الدراسة التي أجرتها ألفاريز-ارفيتي وآخرون بنجاح إيصال siRNA لأدمغة الفئران باستخدام إجراء هندسة عكسية اكسوسوميس مع تقريبا لا مضاعفات31. هو الافتراض بأن العلاج القائم على اكسوسومي نسبيا أكثر أماناً من العلاجات الأخرى كما لا النسخ المتماثل اكسوسوميس اندوجينوسلي كما أن الخلايا وذلك لا يحمل خصائص المنتشر15.
أبلغ عن أساليب مختلفة لعزل اكسوسوميس من زراعة الخلايا أو السوائل الفيزيولوجية بنجاح. يستخدم الأسلوب الأكثر شعبية تنبيذ فائق لبيليه اكسوسوميس من انطلاق المواد31،32،33. هذا الأسلوب يمكن أن تكون قاسية جداً على اكسوسوميس والبروتينات رواسب المشارك من العينة عادة. الجمع بين تنبيذ فائق مع فصل القائم على كثافة مثل التدرجات السكروز أصبحت أكثر شيوعاً، للحد من تلوث البروتين وغير اكسوسومال في19،اكسوسوميس معزولة34. حجم الاستبعاد اللوني (SEC) تسمح بفصل اكسوسوميس عن أنواع أخرى من حويصلات خارج الخلية (EV) بحجم ويمكن أن يؤدي أيضا إلى تلوث الحد الأدنى من البروتين غير محدودة بمقدار صغير من ابتداء من المواد فإنه يمكن معالجة35، 36. يستخدم إيمونوافينيتي التقاط الخرز المغلفة بالأجسام المضادة التي تربط بالبروتينات السطحية اكسوسومال مثل تيتراسبانينس أو علامة الخلية المحددة الأخرى التي تتيح التقاط محددة من اكسوسوميس بدلاً من المركبات الكهربائية أو غيرها من البروتينات، فضلا عن عزل السكان الفرعية اكسوسوميس من كل العينات، ولكن مرة أخرى محدودة بمقدار ابتداء من المواد و تكلفة36،37. هطول الأمطار على أساس البوليمر من اكسوسوميس اعتادت أن تكون شعبية جداً، ولكن نظراً هطول الأمطار بدلاً من النفط خام، فإنه يؤدي إلى أعلى غير اكسوسومال حويصلة والبروتين تلوث38،39.
أبلغ انهانسر لعدم الكفاءة، كأسلوب لتحميل اكسوسوميس مع siRNA بسبب بروتين التجميع15،،من2831. النهج القائم على تعداء أظهرت أن يكون تحميل أفضل كفاءة واستقرار البروتين، ولكن غير مرغوب فيه بسبب سميتها والآثار الجانبية لوكلاء تعداء في تغيير الجينات الخلوية التعبير28. وهكذا، انهانسر قد استخدمت على نطاق واسع في تحميل siRNA في اكسوسوميس، وطريقة أكثر أماناً. ومع ذلك، طريقة تغليف أمثل يلزم إنشاء بغية تسليم كميات كافية من siRNA إلى الموقع المستهدف لضربة قاضية جينات قوية.
هنا، فإننا نقترح بروتوكولا عزلة اكسوسومي استخدام المستندة إلى كثافة تنبيذ فائق على مجرد واحد 25% (w/w) سكروز وسادة أعدت في أكسيد الديوتريوم، بدلاً من أن تدرج كثافة سكروز. هذا هو أسلوب فعال من حيث التكلفة التي تلتف إعداد التدرج كثافة شاقة ويتيح تجهيز كميات كبيرة من ابتداء من المواد، ولكن النتائج في اكسوسوميس سليمة عالية الغلة ونقاء مناسبة لتحميل اللاحقة مع siRNA. تم تحميله إلى اكسوسوميس “الكلي الجنينية البشرية” خلايا (خلايا HEK-293) المتأتية عن طريق انهانسر siRNA غير محددة مترافق Atto655 نيون وتسليمها إلى الخلايا السرطانية البشرية غدية البنكرياس (PANC-1) في المختبر.
Protocol
Representative Results
Discussion
الحصول على عائد اكسوسومي لائق من الخلايا المزروعة، التي تكفي لعدة جولات من الدراسات في المختبر أو في الجسم الحي ، لا يزال يمثل تحديا. ووفقا للشركة المصنعة، ترمي قوارير مفاعل حيوي لإنتاج الأجسام المضادة، والبروتينات مع عالية الغلة من الثقافة من مختلف خطوط الخلايا مخلدة. وهذا يسمح للخلايا باستمرار إثراء الثقافة المتوسطة مع المنتج المطلوب، أسفر عن وسيلة مكيفة مركزة (سم) في الخلية-المقصورة. نظرياً، سيكون مفيداً في إنتاج اكسوسومي من خطوط الخلايا المختلفة نفس المفهوم، وتجلى الواقع استزراع هذه الخلايا في قوارير مفاعل حيوي زيادة الغلة اكسوسومي40. إمدادات المواد المغذية للخزان المتوسطة الكبيرة باستمرار، وإزالة النفايات من حجرة الخلية من خلال غشاء شبه منفذ 10 كاتشين، السماح للثقافة فترات طويلة دون الحاجة إلى كمية كبيرة من المتوسط لتكون على اتصال بالخلايا، أو العادية قوارير المتغيرة، التي يمكن في نهاية المطاف إنقاذ التكلفة الإجمالية والعمل اكسوسومي عالية-حجم الإنتاج40. كما اتضح أن مورفولوجية والنمط الظاهري، فضلا عن وظائف إيمونومودولاتوري اكسوسوميس عزل الخلايا الثقافات قوارير مفاعل حيوي طويل الأجل مماثلة للتي مصدرها الخلايا المستزرعة في العادية 75 سم2 قوارير40. ولذلك سيساعد ثقافة أخرى خطوط خلية مخلدة كمصادر اكسوسومي في قارورة مفاعل حيوي زيادة الغلة اكسوسومي بهم مع الحفاظ على سلامتهن والدالة. لا هذا النموذج من الثقافة ولكن لا ينطبق على الخلايا الأولية مع دورات شعبة محدودة، وتلك التي لا يمكن مثقف في كثافة عالية.
حيث يتم الحصاد سم أسبوعيا، وكانت ابدأ باساجيد الخلايا في الثقافة، يمكن الافتراض بأن الخلايا في قارورة مفاعل حيوي لا تنمو في أحادي الطبقة مثل ثقافة الخلية العادية. هم الأكثر احتمالاً تشكيل مجموعات مع مراكز نخرية، أو ببساطة فصل من السطح وتموت عند المتلاقية جداً لأحادي الطبقة الخلايا. الفحص البصري لحجرة الخلية من قارورة مفاعل حيوي لا يمكن تأكيد هذا الافتراض، ولكن ينعكس من خلال عدد كبير من الخلايا الميتة التي تم الحصول عليها أثناء الحصاد سم. إزالة منتظمة من الخلايا ملتصقة ضعيف وغير قادر على الاستمرار في قارورة مفاعل حيوي يمكن منع تراكم المواد المتعلقة شبه نفاذية الأغشية التي يمكن أن تؤثر سلبا على تبادل الغاز والمواد الغذائية والنفايات بين حجرة الخلية والمتوسطة الخزان، مما يسمح للثقافة المطولة في قوارير مفاعل حيوي > 6 أشهر40. وفي هذا السياق، هذا عدم انتظام نمو الخلايا في قوارير مفاعل حيوي مثالي كما يمكننا التكهن بأنه يقلد الحالة الفعلية للورم النمو في فيفو أوثق من ثقافة الخلية أحادي الطبقة التقليدية، ومن المأمول أن اكسوسوميس ينتج سرطان خلايا في قارورة مفاعل حيوي سيكون أكثر مماثلة للتي تفرزها الأورام في فيفو. وهذا سيكون مفيداً بصورة خاصة في دراسات تبحث في دور اكسوسوميس المستمدة من ورم في تطور علم الأمراض السرطانية. اكسوسوميس المستمدة من الورم قد أبلغت إلى المنزل ارتباطاً وثيقا، وترتبط بشكل تفضيلي إلى تلك الأنسجة من أصل32، وذلك بعد اكسوسوميس المنتجة في نظام محاكاة بهم في فيفو الإنتاج المرغوب فيه أيضا في دراسات تبحث في استكشاف قدرة الاستهداف السلبي اكسوسوميس نانوكاريرس المخدرات.
وذكر نسبة P:P كمعلمة لتقييم نقاء اكسوسوميس المعزولة من تلويث البروتينات من المتوسط الثقافة من السوائل الفسيولوجية التي كان مصدرها اكسوسوميس41. نسبة P:P ± 1.7 × 10 8.310 ف/ميكروغرام تم الحصول عليها في هذه الدراسة يقع ضمن النطاق عالية النقاء المقترحة في الدراسة. ويبرز هذا النسبة خطر استخدام تركيز البروتين للتعبير عن العائد أو جرعة من اكسوسوميس معزولة أو المستخدمة في الدراسات النهائية على التوالي، كما لا يعكس هذا المبلغ الحقيقي من اكسوسوميس المتوفرة في العينة نظراً لمشكلة البروتين التلوث أثناء العزلة. الإدارة الوطنية للسياحة عن طريق الصكوك مثل نانوسايت، الذي يقيس تركيز اكسوسوميس من حيث عدد الجسيمات، طريقة أكثر منطقية وأكثر دقة لقياس اكسوسوميس.
موازنة دقيقة للغاية أثناء إعداد محلول 25% في أكسيد الديوتريوم أمر حاسم بهذا الأسلوب عزلة على أساس كثافة. وقد اكسوسوميس مجموعة ضيقة من كثافة التعويم في محلول السكروز حتى إعداد دقيقة لوسادة السكروز سيتم الحد من تلوث من حويصلات غير اكسوسومال مثل الهيئات apoptotic أو حويصلات غولجي-مشتقة خلال عزل42. ينصح لا للحفاظ على بقايا محلول واستخدامه حتى بعد يوم واحد تجنبا لمخاطر عوامل التي يمكن أن تغير كثافته مثل فقدان أو إضافة المياه في الحل بالتبخر أو التكثيف في الهواء في الأنبوب. استخدام دوار البديل التدريجي ضروري أيضا أثناء الطرد المركزي على وسادة السكروز للسماح بالهجرة حتى من اكسوسوميس من مجلس الوزراء حل السكروز.
سحب الطرد المركزي بعد حل السكروز أيضا خطوة حساسة، وأنها تنطوي على إيجاد حل وسط بين تعظيم مقدار اكسوسوميس المستردة، وليس كثيرا أن البروتين من الثقافة المتوسطة عرض لسحب العينة اكسوسومي . هي الواجهة بين محلول السكروز والمتوسطة شرط فيها البروتينات من المتوسط الثقافة بجمع بعد الطرد المركزي، وعادة ما يمكن اعتباره حلقة بني داكن أن يجلس على الواجهة. في أيدينا، هو سحب 2 مل وسادة السكروز من الأولى 3 مل إضافة وحدة التخزين الأمثل الذي يتفق مع الحل التوفيقي المشار إليها أعلاه. الكميات المبينة في هذا البروتوكول للدوارات المحددة المستخدمة؛ ولذلك، فإنه ينصح لتحسين حجم السكروز سحب عند القياس أعلى أو أسفل وحدات التخزين لأنواع الدوارات المتاحة في مرافق مختلفة. من المهم أيضا تجنب حق المنطقة في وسط أسفل الأنبوبة عند سحب السكروز، هذا هو حيث سيتم الجسيمات من أعلى كثافة من السكروز الرواسب ويمكن عادة اعتبار بيليه البيض.
خطوة الغسيل بكمية كبيرة نسبيا من برنامج تلفزيوني يساعد على الحد من زيادة درجة التلوث البروتين خلال العزلة اكسوسومي41. هذه الخطوة ضروري أيضا في إزالة الزائدة السكروز من اكسوسوميس لتفادي الضرر ناضح اكسوسوميس أنفسهم أو الجزيئات الحيوية داخل التجويف اكسوسومال، فضلا عن الحد من خطر النمو البكتيرية أو الفطرية في الأسهم اكسوسومي. إعداد محلول السكروز في أكسيد الديوتريوم بدلاً من الماء يساعد على تقليل كمية السكروز اللازمة لتحقيق كثافة تعويم اكسوسومي للعزلة، ومن ثم تقليل خطر الضرر ناضح والتلوث الميكروبي. بعد الطرد المركزي الأول على وسادة السكروز، المحتوية على اكسوسومي يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية طبقة السكروز سحب وإضافة إلى برنامج تلفزيوني ومعالجتها في اليوم التالي إذا واجهت مع ضيق الوقت.
على حد علمنا، نسبة المولى اكسوسومي/siRNA عاملاً هاما في تحديد كفاءة انهانسر. في هذا البروتوكول، استخدمنا 1:60 اكسوسومي إلى نسبة siRNA المولى. كما قدرة التغليف لأنواع مختلفة من اكسوسوميس مختلفة، ونحن نقترح بقوة هذا الأمثل على أساس حالة بحالة. ومع ذلك، يمكن كفاءة التغليف المقترح هنا دائماً معلمة لتحديد شروط انهانسر الأمثل.
وباﻹضافة إلى ذلك، تجميع siRNA يعتقد أن واحدة من المشاكل الأكثر شيوعاً في انهانسر. وقد ثبت أن انهانسر يمكن الحث على تجميع قوي من siRNA، مما يجعل من الصعب حتى إدخال اكسوسوميس. كثير من الأحيان عن طريق الخطأ تفسير المجموعات siRNA كما تغليف siRNA إلى اكسوسومي الضوابط المناسبة لذلك استخدمت في هذه الدراسة كتشكيل المجاميع siRNA أمر لا مفر منه خلال انهانسر28. وحسبت نسبة كفاءة التغليف لدينا طريقة تنقية باستخدام قيم طبيعية للتقليل من التأثير من مصادر أخرى مثل تجمعات الضوضاء واكسوسومي و siRNA الخلفية التي سوف يؤثر على موثوقية البيانات. استناداً إلى النتائج التي توصلنا إليها، كان هناك تجميعات siRNA لا يعتد بها مراعاة مراقبة العينة أي استخدام siRNA اليكتروبوراتيد والأمم المتحدة–اليكتروبوراتيد.
هذا البروتوكول قد أثبت نجاح تغليف siRNA إلى اكسوسوميس وإيصالها داخل الخلايا اللاحقة siRNA لسرطان الخلايا في المختبر. ولذلك، يمكن أن تكون أنواع مختلفة من اكسوسوميس من خطوط الخلايا المختلفة معزولة وتتميز باستخدام البروتوكول المقترح، وبعد ذلك محملة siRNA علاجية مختلفة لأنواع مختلفة من الأهداف النمطان أعرب عن الإفراط في أنواع مختلفة من السرطان. سيكون تطبيق مثيرة لاهتمام لاستكشاف siRNA التسليم والإقبال على كفاءة استخدام التباديل المختلفة من اكسوسومي مصدر-هدف خلية الزوج في المختبر. ويمكن أن يترجم هذا ثم إلى نماذج حيوانية لتقييم كفاءة عملية التسليم والفعالية العلاجية لتغليف siRNA اكسوسوميس المجراة في.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ف. أ. فاروقو هو تموله وكالة الحكومة الماليزية مجلس أمانة راكيات (مارا). شو لام متلقي لماري سكلودوفسكا كوري “زمالات فردية” (أفق 2020) (H2020-مسكاً-لو-2016). ك. ت. جمال تعترف بتمويل من مؤسسة ويلكوم ترست (WT103913) وبسرك (BB/J008656/1). المؤلفون أيضا يود أن يشكر الدكتور بول خزامي والدكتور ديفيد الخوف (قسم طب الجهاز التنفسي والحساسية، كوليدج لندن كينغز) توفير اليكتروبوراتور.
Materials
| Material | |||
| Sterile Newborn Calf Serum Heat Inactivated | First Link | 08-05-850 | 500 ml |
| EMEM medium | Thermo Fisher Scientific | 11090081 | 500 ml |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | 100 ml |
| GlutaMax | Thermo Fisher Scientific | 35050-038 | 100 ml |
| Sucrose | Fisher Scientific | S/8600/60 | 1 kg |
| Deuterium oxide (D2O) | Sigma-Aldrich | 151882 | 250 g |
| 1X Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific | 10010015 | 500 ml |
| Glycine | VWR Chemicals | 101196X | 1 kg |
| Sepharose CL-2B | GE Healthcare Life Sciences | 17-0140-01 | 1 L; Particle Size 60 μm-200 μm |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300096 | 100 ml |
| Aldehyde/sulfate latex beads | Thermo Fisher Scientific | A37304 | 4% w/v, 4 µm, 15 ml |
| MicroBCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23235 | |
| CD81 antibody (APC) | Thermo Fisher Scientific | 17-0819-42 | Lot: E15950-104. RRID: AB_11150235. 1:10 dilution in 50 µl sample |
| CD81 isotype (APC) | Thermo Fisher Scientific | 17-4714-81 | Lot: 4291563. RRID: AB_763650. 1:10 dilution in 50 µl sample |
| CD9 antibody (FITC) | Thermo Fisher Scientific | 11-0098-41 | Lot: 4345870. RRID: AB_10698007. 1:10 dilution in 50 µl sample |
| CD9 isotype (FITC) | Thermo Fisher Scientific | 11-4714-41 | Lot: 4299784. RRID: AB_10598647. 1:10 dilution in 50 µl sample |
| CD63 antibody (PE) | Thermo Fisher Scientific | 12-0639-41 | Lot: 1930435. RRID: AB_2572564. 1:10 dilution in 50 µl sample |
| CD63 isotype (PE) | Thermo Fisher Scientific | 12-4714-81 | Lot: 1937696. RRID: AB_470059. 1:10 dilution in 50 µl sample |
| Atto655-siRNA | Eurogentec | SQ-SIRNA | (Labelled-S) UGC-GCU-ACG-AUC-GAC-GAU-G55; (Unlabelled-AS) CAU-CGU-CGA-UCG-UAG-CGC-A55. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm | Millipore | SLGP033RS | |
| CELLine AD1000 bioreactor flasks | Wheaton | WCL1000ad | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima XPN-80 | |
| Swing-out rotor | Beckman Coulter | SW45 Ti | |
| Fixed-angle rotor | Beckman Coulter | Type 70 Ti | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 355631 | Polycarbonate. Max. fill 32 ml |
| Ultracentrifuge bottles | Beckman Coulter | 355618 | Polycarbonate. Min. fill 16 ml, max. fill 25 ml |
| NanoSight | Malvern | LM10 | Software: NanoSight NTA v3.2 |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Plate reader | BMG Labtech | FLUOstar Omega | |
| Flow cytometry tubes | BD Biosciences, Falcon | 352052 | |
| Microfuge tubes | Starlab | S1615-5500 | 1.5 ml |
| Cell culture flasks | Fisher Scientific | 156499 | 75 cm2 |
| Transmission electron microscope | FEI Electron Optics | Philips CM 12 | with Tungsten filament and a Veleta – 2k × 2k side-mounted TEM CCD Camera (Olympus, Japan) |
| Amaxa Nucleofector I | Lonza | Nucleofector I | with Amaxa’s Nucleofector Kits |
| 24-well flat-bottom plates | Corning | Costar | |
| Blunt fill needle | BD Biosciences | 305180 | 18G x 1 1/2" (1.2 mm x 40 mm) |
| Glass pipettes | Fisher Scientific | 1156-6963 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | Composition | ||
| Normal medium | Eagle's Minimum Essential Medium supplemented with 10% foetal bovine serum (FBS), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax. | ||
| Exosome-depleted medium | Eagle's Minimum Essential Medium supplemented with 10% exosome-depleted FBS (see below), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax. | ||
| Exosome-depleted FBS | Subject FBS to ultracentrifugation at 100,000 g for 18 h at 4°C. The FBS supernatant post-centrifugation was collected and sterile-filtered using 0.22 µm filters. | ||
| 25% w/w sucrose cushion | Add 1.9 g (± 0.001 g) of sucrose in a universal tube, and top up with D2O until the weight reaches 7.6 g (± 0.001 g). This makes ~6ml of the 25% w/w sucrose cushion. | ||
| 3% FBS/PBS | Add 1.5 ml exosome-depleted FBS to 48.5 ml 1X PBS to prepare 50 ml of 3% FBS/PBS. | ||
| 100 µM BSA solution | Prepare 1mM BSA solution by adding 0.3325 g to 50 ml PBS. Make 1:10 dilution of this stock to obtain 100 µM BSA solution. Make 5-10 µl aliqouts of this 100 µM BSA solution (for single use) and store them at -20°C. All BSA solution should be stored at -20°C, and discard solutions that have undergone ≥2 freeze-thaw cycles. | ||
| 100 mM glycine solution | Add 0.375 g of glycine to 50 ml PBS to obtain 100 mM glycine solution, store at 4°C. | ||
| Citric acid buffer with EDTA | Mix 0.1954 g citric acid and 0.2087 g disodium phosphate in 50 mL of deionised water. Add EDTA to 0.1 mM. Adjust pH to 4.4. | ||
| Fixing solution | Prepare formaldehyde/glutaraldehyde, 2.5% (w/v) each in 0.1 M sodium cacodylate buffer, and adjust pH to 7.4. | ||
| Aqueous uranyl acetate | Prepare 25% (v/v) uranyl acetate in methanol. | ||
| 50% methanol/H2O | Mix methanol and H2O 1:1 (v/v). | ||
| SEC Column packed with Sepharose CL-2B | Dilute 37.5 ml Sepharose CL-2B resin with 12.5 ml PBS to obtain 75% Sepharose CL-2B solution. Pour the Sepharose CL-2B solution into a column of dimension 2.9 cm [H] x 1.3 cm [W]. Pour the Sepharose CL-2B to 3-4 mm above the stated height, and then press it down to the stated height with the filter for optimal packing. |
References
- Zitvogel, L., et al. Eradication of established murine tumors using a novel cell-free vaccine: dendritic cell derived exosomes. Nature Medicine. 4 (5), 594-600 (1998).
- Raffai, R., Li, K., Wong, D., Hong, J. Therapeutic control of systemic inflammation & atherosclerosis with ApoE-polarized macrophage exosomes. Atherosclerosis. , e5-e6 (2017).
- Masamune, A., et al. Exosomes derived from pancreatic cancer cells induce activation and profibrogenic activities in pancreatic stellate cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 71-77 (2018).
- Gangoda, L., et al. Proteomic Profiling of Exosomes Secreted by Breast Cancer Cells with Varying Metastatic Potential. Proteomics. 17 (23-24), 1600370 (2017).
- Wozniak, M., Peczek, L., Czernek, L., Düchler, M. Analysis of the miRNA Profiles of Melanoma Exosomes Derived Under Normoxic and Hypoxic Culture Conditions. Anticancer Research. 37 (12), 6779-6789 (2017).
- Salimu, J., et al. Dominant immunosuppression of dendritic cell function by prostate-cancer-derived exosomes. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1368823 (2017).
- Lankford, K. L., et al. Intravenously delivered mesenchymal stem cell-derived exosomes target M2-type macrophages in the injured spinal cord. PLoS ONE. 13 (1), e0190358 (2018).
- Khalyfa, A., et al. Plasma Exosomes and Improvements in Endothelial Function by Angiotensin 2 Type 1 Receptor or Cyclooxygenase 2 Blockade following Intermittent Hypoxia. Frontiers in Neurology. 8, 709 (2017).
- Manek, R., et al. Protein Biomarkers and Neuroproteomics Characterization of Microvesicles/Exosomes from Human Cerebrospinal Fluid Following Traumatic Brain Injury. Molecular Neurobiology. 55 (7), 6112-6128 (2018).
- Pathare, G., et al. Changes in V-ATPase subunits of human urinary exosomes reflect the renal response to acute acid/alkali loading and the defects in distal renal tubular acidosis. Kidney International. 93 (4), 871-880 (2018).
- Liao, Y., Du, X., Li, J., Lönnerdal, B. Human milk exosomes and their microRNAs survive digestion in vitro and are taken up by human intestinal cells. Molecular nutrition & food research. 61 (11), 1700082 (2017).
- Kim, J., et al. Cyclooxygenase-2 expression is induced by celecoxib treatment in lung cancer cells and is transferred to neighbor cells via exosomes. International Journal of Oncology. 52 (2), 613-620 (2017).
- Sterzenbach, U., et al. Engineered Exosomes as Vehicles for Biologically Active Proteins. Molecular Therapy. 25 (6), 1269-1278 (2018).
- Conigliaro, A., Fontana, S., Raimondo, S., Alessandro, R. Exosomes: Nanocarriers of Biological Messages. In Exosomes in Cardiovascular Diseases. 998, 23-43 (2017).
- El Andaloussi, S., Lakhal, S., Mäger, I., Wood, M. J. A. Exosomes for targeted siRNA delivery across biological barriers. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (3), 391-397 (2013).
- Simhadri, V. R., et al. Dendritic cells release HLA-B-associated transcript-3 positive exosomes to regulate natural killer function. PLoS ONE. 3 (10), e3377 (2008).
- Santos, J. C., et al. Exosome-mediated breast cancer chemoresistance via miR-155 transfer. Scientific Reports. 8 (1), 829-829 (2018).
- Hadla, M., et al. Exosomes increase the therapeutic index of doxorubicin in breast and ovarian cancer mouse models. Nanomedicine. 11 (18), 2431-2441 (2016).
- Smyth, T., et al. Biodistribution and delivery efficiency of unmodified tumor-derived exosomes. Journal of Controlled Release. 199, 145-155 (2015).
- Tian, Y., et al. A doxorubicin delivery platform using engineered natural membrane vesicle exosomes for targeted tumor therapy. Biomaterials. 35 (7), 2383-2390 (2014).
- Kim, M. S., et al. Engineering macrophage-derived exosomes for targeted paclitaxel delivery to pulmonary metastases: in vitro and in vivo evaluations. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 14 (1), 195-204 (2018).
- Bellavia, D., et al. Interleukin 3- receptor targeted exosomes inhibit in vitro and in vivo Chronic Myelogenous Leukemia cell growth. Theranostics. 7 (5), 1333-1345 (2017).
- Sun, D., et al. A novel nanoparticle drug delivery system: The anti-inflammatory activity of curcumin is enhanced when encapsulated in exosomes. Molecular Therapy. 18 (9), 1606-1614 (2010).
- Tian, T., et al. Surface functionalized exosomes as targeted drug delivery vehicles for cerebral ischemia therapy. Biomaterials. 150, 137-149 (2017).
- Zhuang, X., et al. Treatment of brain inflammatory diseases by delivering exosome encapsulated anti-inflammatory drugs from the nasal region to the brain. Molecular Therapy. 19 (10), 1769-1779 (2011).
- Iessi, E., et al. Acridine Orange/exosomes increase the delivery and the effectiveness of Acridine Orange in human melanoma cells: A new prototype for theranostics of tumors. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 32 (1), 648-657 (2017).
- Aqil, F., et al. Exosomal delivery of berry anthocyanidins for the management of ovarian cancer. Food & Function. 8 (11), 4100-4107 (2017).
- Shtam, T. A., et al. Exosomes are natural carriers of exogenous siRNA to human cells in vitro. Cell Communication and Signaling. 11 (1), 1-10 (2013).
- Wahlgren, J., et al. Plasma exosomes can deliver exogenous short interfering RNA to monocytes and lymphocytes. Nucleic Acids Research. 40 (17), e130-e130 (2012).
- Yang, J., Zhang, X., Chen, X., Wang, L., Yang, G. Exosome Mediated Delivery of miR-124 Promotes Neurogenesis after Ischemia. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 7, 278-287 (2017).
- Alvarez-Erviti, L., et al. Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes. Nature Biotechnology. 29 (4), 341-345 (2011).
- Wiklander, O. P. B., et al. Extracellular vesicle in vivo biodistribution is determined by cell source, route of administration and targeting. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 1-13 (2015).
- Varga, Z., et al. Radiolabeling of Extracellular Vesicles with 99m Tc for Quantitative In Vivo Imaging Studies. Cancer Biotherapy and Radiopharmaceuticals. 31 (5), 168-173 (2016).
- Smyth, T. J., Redzic, J. S., Graner, M. W., Anchordoquy, T. J. Examination of the specificity of tumor cell derived exosomes with tumor cells in vitro. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1838 (11), 2954-2965 (2014).
- Boing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 23430 (2014).
- Sharma, P., et al. Immunoaffinity-based isolation of melanoma cell-derived exosomes from plasma of patients with melanoma. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1435138 (2018).
- Clayton, A., et al. Analysis of antigen presenting cell derived exosomes, based on immuno-magnetic isolation and flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 247 (1), 163-174 (2001).
- Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. Exosome Isolation for Proteomic Analyses and RNA Profiling. In Serum/Plasma Proteomics: Methods and Protocols. , 235-246 (2011).
- Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney International. 82 (9), 1024-1032 (2012).
- Mitchell, J. P., Mason, M. D., Tabi, Z., Clayton, A. Increased exosome production from tumour cell cultures using the Integra CELLine Culture System. Journal of Immunological Methods. 335 (1-2), 98-105 (2008).
- Webber, J., Clayton, A. How pure are your vesicles?. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 1-6 (2013).
- Chiou, N. -. T., Ansel, K. M. Improved exosome isolation by sucrose gradient fractionation of ultracentrifuged crude exosome pellets. Nature Protocol Exchange. , (2016).
