Um exossomo é uma nova geração de portadores de entrega de drogas. Estabelecemos um protocolo de isolamento do exossomo com alto rendimento e pureza para a entrega de siRNA. Nós também encapsulados fluorescente etiquetado siRNA inespecífico em exosomes e investigou a absorção celular de siRNA-carregado exosomes em células cancerosas.
Vesículas extracelulares, em particular exosomes, recentemente ganharam interesse como droga nova vetores de entrega devido a sua origem biológica, abundância e capacidade intrínseca na entrega intercelular de várias biomoléculas. Este trabalho estabelece um protocolo de isolamento para atingir alto rendimento e alta pureza de exosomes para a entrega de siRNA. Células de rim embrionário humanas (células HEK-293) são cultivadas em frascos de biorreator e a sobrenadante de cultura (aqui referida como meio condicionado) é colhida em uma base semanal, para permitir o enriquecimento de HEK-293 exosomes. O meio condicionado (CM) é previamente limpo de células mortas e restos celulares por centrifugação diferencial e é submetido a ultracentrifugação para uma almofada de sacarose, seguida por uma etapa de lavagem, para recolher a exosomes. Isolado HEK-293 exosomes caracterizam-se por rendimento, morfologia e exosomal expressão de marcador por análise de rastreamento de nanopartículas, quantificação de proteína, microscopia eletrônica e citometria de fluxo, respectivamente. RNA de interferência pequeno (siRNA), fluorescente etiquetado com Atto655, é carregado em exosomes por eletroporação e siRNA em excesso é removido por filtração em gel. Captação de célula em células de câncer PANC-1, após incubação de 24 horas a 37 ° C, é confirmada por citometria de fluxo. Exosomes HEK-293 são 107.0 ± 8,2 nm de diâmetro. A taxa de proporção (estudante) exossomo rendimento e partícula-a-proteína são 6,99 ± 0,22 × 1012 partículas/mL e 8,3 ± 1,7 × 1010 partícula / µ g, respectivamente. A eficiência de encapsulação de siRNA em exosomes é ~ 10-20%. Quarenta por cento das células mostrar sinais positivos para Atto655 em 24h pós-incubação. Em conclusão, exossomo isolamento por ultracentrifugação em coxim de sacarose oferece uma combinação de bom rendimento e pureza. siRNA poderia ser carregado com êxito em exosomes por eletroporação e posteriormente entregue nas células cancerosas in vitro. Este protocolo oferece um procedimento padrão para o desenvolvimento de siRNA-carregado exosomes para entrega eficiente de células cancerosas.
Exosomes são um subtipo de vesículas extracelulares (EV), que variam de 50-200 nm de diâmetro, secretado por vários tipos de células, como células do sistema imunológico1,2, as células cancerosas3,4,5, 6 e tronco células7. Exosomes também se mostraram estar presente em vários fluidos fisiológicos8,9,10,11. A combinação entre a capacidade inerente de exosomes de transportar várias biomoléculas (por exemplo, RNA e proteínas)12,13,14 e a entrega efetiva destas biomoléculas em células destinatários 15 , 16 , 17 atraiu o interesse de seu potencial como vetores de entrega de droga de nano-escala. Várias pequenas moléculas que servem como drogas anti-câncer e anti-inflamatório tem sido demonstradas para ser carregado com êxito em exosomes e entregues ao alvo células18,19,20, 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. Curiosamente, os ácidos nucleicos tais como siRNA28,29 e microRNA30 também foi carregado com êxito no exosomes via eletroporação e entregues às células alvo.
Recentemente, RNA interferência (RNAi) através de interferência RNA pequeno (siRNA) ganhou mais interesse como o mecanismo preferido no silenciamento de genes devido à sua alta especificidade, efeito potente, efeitos colaterais mínimos e facilidade de siRNA síntese28, 29. siRNAs são moléculas de RNA double-stranded variando de 19 a 25 nucleotides no comprimento que nocaute de mRNA catalítico gatilhos sequência específica. Devido ao seu grande peso molecular e natureza polyanionic, absorção passiva de siRNA nua em células é impedido de28,29. Também não é possível para siRNA nua deve ser injetado na circulação sistêmica devido à rápida degradação por nucleases de plasma31. Assim, encapsulamento de siRNA em nanocarreador ajudariam a entrega eficaz e absorção de siRNA dentro das células alvo.
Exosomes é um sistema ideal para encapsulamento de siRNA como sua estrutura é composta de um núcleo oco, aquoso, envelopado por uma BICAMADA de fosfolípidos. Exosomes não só têm boa estabilidade no sangue, mas também têm propriedades naturais de direcionamentos para entregar RNA funcional nas células32. O estudo realizado por Alvarez-Erviti et al com sucesso demonstrado efetiva entrega de siRNA para o cérebro de ratos utilizando engenharia exosomes com praticamente sem complicações de31. A hipótese é de que a terapia baseada em exossomo é relativamente mais segura do que outras terapias, como exosomes não replicar endogenamente como células e, portanto, não apresentam propriedades metastático15.
Vários métodos têm sido relatados para isolar com êxito exosomes de cultura celular ou fluidos fisiológicos. O método mais popular usa a ultracentrifugação para exosomes desde a partida de32,material31,33de Pelotas. Esse método pode ser bastante duro na exosomes e, geralmente, precipitados co proteínas da amostra. Combinando a ultracentrifugação com uma separação baseada na densidade tais como gradientes de sacarose é cada vez mais comum, para reduzir a contaminação de proteína e não-exosomal.19,a exosomes isolada34. Tamanho-exclusão cromatografia (SEC) permite a separação de exosomes de outros tipos de vesículas extracelulares (EV), tamanho e também pode resultar em contaminação mínima de proteína, mas é limitada pela pequena quantidade de material que pode processar35, começar 36. Immunoaffinity captura usa pérolas revestidas com anticorpos que se ligam a proteínas de superfície exosomal, como tetraspanins ou outro marcador de célula específica que permite a captura específica de exosomes, ao invés de EVs ou outras proteínas, bem como isolar a subpopulação de exosomes de todo as amostras, mas novamente é limitada pela quantidade de material começar e é caro36,,37. Baseado em polímero de precipitação de exosomes era popular também, mas já que é uma precipitação bastante cru, conduz a uma maior não-exosomal vesículas e proteína contaminação38,39.
Electroporation foi relatado por sua ineficiência como um método para carregar exosomes com siRNA devido a agregação de proteínas15,28,31. Abordagens de transfeccao foram demonstradas para ter que carregar melhor eficiência e estabilidade de proteínas, mas é indesejáveis devido à sua toxicidade e efeitos colaterais dos agentes de transfecção em alterar a expressão de gene celular28. Assim, eletroporação tem sido mais amplamente utilizada no carregamento de siRNA em exosomes como é um método mais seguro. No entanto, um método de encapsulamento otimizado precisa ser estabelecido para fornecer quantidades adequadas de siRNA para o site de destino para um knockdown potente do gene.
Aqui, propomos um protocolo de isolamento exossomo usando baseado em densidade ultracentrifugação em apenas um único 25% (w/w) sacarose coxim preparado em óxido de deutério, ao invés de um gradiente de densidade de sacarose. Este é um método de baixo custo que contorna a preparação de gradiente de densidade laborioso e permite o processamento de grandes volumes de material começar, no entanto, resulta em exosomes intacto de alto rendimento e pureza adequada para carregamento subsequente com siRNA. Fluorescente Atto655-conjugado específico siRNA foi carregado no rim embrionário humano células (HEK-293) derivadas exosomes via eletroporação e entregue para as células cancerosas humanas adenocarcinoma pancreático (PANC-1) in vitro.
Obtendo um rendimento decente exossomo de culturas de células, que são suficientes para várias rodadas de estudos in vitro ou em vivo , ainda é um desafio. De acordo com o fabricante, destinavam-se os frascos de biorreator para produção de anticorpos e proteínas com alto rendimento de cultura de várias linhas de células imortalizado. Isso permite que as células continuamente enriquecer o meio de cultura com o produto desejado, resultando em meio condicionado concentrado (CM) no compartimento de pilha. Teoricamente, o mesmo conceito seria benéfico na produção do exossomo de várias linhas de células, e de fato cultivo destas células em balões o biorreator foi demonstrada para aumentar significativamente o rendimento de exossomo40. O grande reservatório médio continuamente fornece nutrientes para e remove resíduos do compartimento da pilha através de uma membrana semi-permeável 10 kDa, permitindo que a cultura prolongada sem exigir um grande volume de médio para estar em contacto com as células, ou regular frascos de mudança, que em última análise, podem conservar o custo global e o trabalho do exossomo de alta escala de produção40. Também foi demonstrado que a morfologia, fenótipo, bem como as funções immunomodulatory de exosomes isolaram células culturas de frascos de biorreator a longo prazo são semelhantes às que originária de células cultivadas em regular 75 cm2 frascos40. Cultura de outras linhas de célula imortalizado como fontes exossomo no recipiente de biorreator, portanto, ajudaria a aumentar seu rendimento exossomo, mantendo a sua integridade e função. Esta forma de cultura é no entanto não se aplica para as células primárias com ciclos de divisão limitada e aqueles que não podem ser cultivadas em alta densidade.
Desde a colheita do CM é feita semanalmente, e as células em cultura nunca foram passadas, pode-se supor que as células em balão de biorreator não estão crescendo em uma monocamada como a cultura de célula normal. Eles são mais propensos a formar grupos com centros necróticos, ou simplesmente desconectar-se da superfície e morrem quando as células são também confluentes para uma monocamada. Inspeção visual do compartimento da pilha do balão biorreator não é possível confirmar esta hipótese, mas é reflectida pelo grande número de células mortas, obtidos durante a colheita de CM. Remoção regular de células não viáveis e mal aderentes de balão de biorreator pode prevenir o acúmulo de materiais sobre a membrana semi-permeável que podem afetar adversamente a troca de gases, nutrientes e resíduos entre o compartimento da célula e o meio reservatório, permitindo assim a cultura prolongada nos frascos de biorreator para > 6 meses40. Neste contexto, esta não-regularidade do crescimento celular em balões o biorreator é ideal como nós especulamos que imita o estado real do tumor crescimento na vivo mais pròxima do que a cultura de células convencional monocamada, e espera-se que o exosomes produzido pelo câncer células em balão de biorreator seria mais semelhantes ao secretadas por tumores em vivo. Isso seria particularmente benéfico em estudos investigando o papel do exosomes derivado de tumor na progressão da patologia do tumor. Tumor derivado exosomes têm sido relatados para intrinsecamente e preferencialmente em casa para seus tecidos de origem32, tendo, portanto, exosomes produzido em um sistema imitando seus na vivo produção seria também desejável em estudos olhando explorar a capacidade de direcionamento passiva de exosomes como nanocarriers de drogas.
A relação de amizade foi relatada como um parâmetro para avaliar a pureza de exosomes isoladas de contaminar proteínas do meio de cultura de fluidos fisiológicos, dos quais exosomes eram provenientes de41. A relação de amizade de 8.3 ± 1,7 × 1010 p / µ g obtidos neste estudo fica dentro do intervalo de alta pureza proposto no estudo. Este rácio destaca o perigo de usar a concentração de proteína para expressar o rendimento ou a dose de exosomes isolado ou utilizadas nos estudos a jusante, respectivamente, como isto não reflete a verdadeira quantidade de exosomes disponíveis na amostra dada o problema da proteína contaminação durante o isolamento. NTA através de instrumentos tais como NanoSight, que mede a concentração de exosomes em termos de número de partículas, é uma forma mais sensata e precisa de quantificação dos exosomes.
Alta precisão de pesagem durante a preparação da solução de sacarose de 25% em óxido de deutério é crucial como esse método é uma densidade de isolamento. Exosomes ter uma faixa bastante estreita de densidade de flutuação em solução de sacarose para que preparação exacta da almofada da sacarose irá reduzir a contaminação dos não-exosomal vesículas como corpos apoptotic ou vesículas de Golgi-derivado durante o isolamento42. É aconselhável não manter a solução de sacarose sobras e usá-lo mesmo depois de um dia, a fim de evitar o risco de fatores que podem alterar a sua densidade como perda ou adição de água na solução por evaporação ou condensação de ar no tubo. Uso de um rotor basculante também é essencial durante a centrifugação para a almofada de sacarose para permitir até mesmo migração de exosomes do CM para a solução de sacarose.
Retirar a pós-centrifugação solução de sacarose é também um passo delicado, e envolve encontrar um compromisso entre maximizar a quantidade de exosomes recuperado e não muito que proteínas do meio de cultura é apresentada para a retirada de amostra exossomo . A interface entre a solução de sacarose e o meio de condição é onde iria recolher pós-centrifugação proteínas do meio de cultura e geralmente podem ser vistas como um anel marrom escuro que fica na interface. Em nossas mãos, retirar o inicial 3ml adicionado 2 mL da almofada da sacarose é o volume ideal que concorda com o compromisso acima mencionado. Os volumes descritos no presente protocolo são para os rotores específicos utilizados; Portanto, é aconselhável otimizar o volume de sacarose a ser retirado ao dimensionamento de cima ou para baixo os volumes para os tipos de rotores disponíveis em diferentes instalações. Também é importante evitar o direito de área no centro da parte inferior do tubo quando retirar a sacarose, como este é onde as partículas de maior densidade do que a sacarose serão sedimentos e normalmente pode ser visto como uma pelota de Off-White.
A etapa de lavagem com uma quantidade relativamente grande de PBS ajuda a reduzir ainda mais o grau de contaminação de proteína durante exossomo isolamento41. Esta etapa também é essencial na sacarose excesso retirando a exosomes a fim de evitar danos osmótico para o exosomes eles próprios ou as biomoléculas dentro do lúmen do exosomal, bem como reduzir o risco de crescimento bacteriano e/ou fúngico do exossomo de estoque. Preparar a solução de sacarose em óxido de deutério em vez de água ajuda a reduzir a quantidade de sacarose necessária para atingir a densidade de flutuação do exossomo de isolamento, portanto, reduzindo o risco de tanto dano osmótico e contaminação microbiana. Após a primeira centrifugação para a almofada de sacarose, contendo o exossomo camada de sacarose retirado e adicionado para a PBS pode ser armazenada a 4 ° C e processada no dia seguinte, se depara com limitações de tempo.
O melhor de nosso conhecimento, a relação molar exossomo/siRNA é um fator importante na determinação da eficiência da eletroporação. Neste protocolo, usamos 1: 60 como o exossomo a razão molar de siRNA. Como a capacidade de encapsulação de diferentes tipos de exosomes são diferentes, nós recomendamos fortemente que esta para ser otimizado em uma base caso-a-caso. No entanto, a eficiência de encapsulação proposta neste documento sempre pode ser um parâmetro para selecionar as condições de eletroporação ideal.
Além disso, a agregação de siRNA é acreditada para ser um dos problemas mais comuns na eletroporação. Está provado que electroporation pode induzir forte agregação de siRNA, tornando ainda mais difícil entrar exosomes. siRNA agregações são erroneamente interpretadas como encapsulamento de siRNA em exossomo um controlo adequado, portanto, foram utilizados neste estudo, como a formação de agregados de siRNA é inevitável durante electroporation28. A eficiência de encapsulação de percentagem do nosso método de purificação foi calculada usando valores normalizados para minimizar a influência de outras fontes como agregações fundo ruído, exossomo e siRNA que afetam a confiabilidade de dados. Baseado em nossos achados, havia agregações de siRNA insignificante observadas no controle amostra ou seja, usando siRNA electroporated e un-electroporated.
Este protocolo demonstrou com sucesso o encapsulamento de siRNA em exosomes e sua subsequente entrega intracelular do siRNA para câncer células in vitro. Portanto, vários tipos de exosomes de linhagens celulares diferentes podem ser isolado e caracterizado utilizando o protocolo proposto e posteriormente carregado com vários siRNA terapêuticos para diferentes tipos de alvos oncogênicos over expressos em diferentes tipos de câncer. Uma aplicação interessante seria explorar a eficiência de entrega e captação de siRNA usando várias permutações de exossomo de origem-destino célula par em vitro. Isto então pode ser convertido em modelos animais para avaliar a eficiência de ambos a entrega e eficácia terapêutica de siRNA-encapsulado exosomes in vivo.
The authors have nothing to disclose.
F. s. Faruqu é financiado pela agência do governo da Malásia Rakyat Amanah Majlis (MARA). Xu L. é um receptor da bolsas individuais Marie Sklodowska-Curie (Horizonte 2020) (H2020-ACEM-IF-2016). K. T. Al-Jamal reconhece financiamento do BBSRC (BB/J008656/1) e o Wellcome Trust (WT103913). Os autores também gostaria de agradecer Dr Paul Lavender e o Dr David Fear (departamento de Pneumologia e alergia, College de Londres do King) para o fornecer o electroporator.
Material | |||
Sterile Newborn Calf Serum Heat Inactivated | First Link | 08-05-850 | 500 ml |
EMEM medium | Thermo Fisher Scientific | 11090081 | 500 ml |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | 100 ml |
GlutaMax | Thermo Fisher Scientific | 35050-038 | 100 ml |
Sucrose | Fisher Scientific | S/8600/60 | 1 kg |
Deuterium oxide (D2O) | Sigma-Aldrich | 151882 | 250 g |
1X Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific | 10010015 | 500 ml |
Glycine | VWR Chemicals | 101196X | 1 kg |
Sepharose CL-2B | GE Healthcare Life Sciences | 17-0140-01 | 1 L; Particle Size 60 μm-200 μm |
Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300096 | 100 ml |
Aldehyde/sulfate latex beads | Thermo Fisher Scientific | A37304 | 4% w/v, 4 µm, 15 ml |
MicroBCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23235 | |
CD81 antibody (APC) | Thermo Fisher Scientific | 17-0819-42 | Lot: E15950-104. RRID: AB_11150235. 1:10 dilution in 50 µl sample |
CD81 isotype (APC) | Thermo Fisher Scientific | 17-4714-81 | Lot: 4291563. RRID: AB_763650. 1:10 dilution in 50 µl sample |
CD9 antibody (FITC) | Thermo Fisher Scientific | 11-0098-41 | Lot: 4345870. RRID: AB_10698007. 1:10 dilution in 50 µl sample |
CD9 isotype (FITC) | Thermo Fisher Scientific | 11-4714-41 | Lot: 4299784. RRID: AB_10598647. 1:10 dilution in 50 µl sample |
CD63 antibody (PE) | Thermo Fisher Scientific | 12-0639-41 | Lot: 1930435. RRID: AB_2572564. 1:10 dilution in 50 µl sample |
CD63 isotype (PE) | Thermo Fisher Scientific | 12-4714-81 | Lot: 1937696. RRID: AB_470059. 1:10 dilution in 50 µl sample |
Atto655-siRNA | Eurogentec | SQ-SIRNA | (Labelled-S) UGC-GCU-ACG-AUC-GAC-GAU-G55; (Unlabelled-AS) CAU-CGU-CGA-UCG-UAG-CGC-A55. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm | Millipore | SLGP033RS | |
CELLine AD1000 bioreactor flasks | Wheaton | WCL1000ad | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima XPN-80 | |
Swing-out rotor | Beckman Coulter | SW45 Ti | |
Fixed-angle rotor | Beckman Coulter | Type 70 Ti | |
Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 355631 | Polycarbonate. Max. fill 32 ml |
Ultracentrifuge bottles | Beckman Coulter | 355618 | Polycarbonate. Min. fill 16 ml, max. fill 25 ml |
NanoSight | Malvern | LM10 | Software: NanoSight NTA v3.2 |
Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Plate reader | BMG Labtech | FLUOstar Omega | |
Flow cytometry tubes | BD Biosciences, Falcon | 352052 | |
Microfuge tubes | Starlab | S1615-5500 | 1.5 ml |
Cell culture flasks | Fisher Scientific | 156499 | 75 cm2 |
Transmission electron microscope | FEI Electron Optics | Philips CM 12 | with Tungsten filament and a Veleta – 2k × 2k side-mounted TEM CCD Camera (Olympus, Japan) |
Amaxa Nucleofector I | Lonza | Nucleofector I | with Amaxa’s Nucleofector Kits |
24-well flat-bottom plates | Corning | Costar | |
Blunt fill needle | BD Biosciences | 305180 | 18G x 1 1/2" (1.2 mm x 40 mm) |
Glass pipettes | Fisher Scientific | 1156-6963 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | Composition | ||
Normal medium | Eagle's Minimum Essential Medium supplemented with 10% foetal bovine serum (FBS), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax. | ||
Exosome-depleted medium | Eagle's Minimum Essential Medium supplemented with 10% exosome-depleted FBS (see below), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax. | ||
Exosome-depleted FBS | Subject FBS to ultracentrifugation at 100,000 g for 18 h at 4°C. The FBS supernatant post-centrifugation was collected and sterile-filtered using 0.22 µm filters. | ||
25% w/w sucrose cushion | Add 1.9 g (± 0.001 g) of sucrose in a universal tube, and top up with D2O until the weight reaches 7.6 g (± 0.001 g). This makes ~6ml of the 25% w/w sucrose cushion. | ||
3% FBS/PBS | Add 1.5 ml exosome-depleted FBS to 48.5 ml 1X PBS to prepare 50 ml of 3% FBS/PBS. | ||
100 µM BSA solution | Prepare 1mM BSA solution by adding 0.3325 g to 50 ml PBS. Make 1:10 dilution of this stock to obtain 100 µM BSA solution. Make 5-10 µl aliqouts of this 100 µM BSA solution (for single use) and store them at -20°C. All BSA solution should be stored at -20°C, and discard solutions that have undergone ≥2 freeze-thaw cycles. | ||
100 mM glycine solution | Add 0.375 g of glycine to 50 ml PBS to obtain 100 mM glycine solution, store at 4°C. | ||
Citric acid buffer with EDTA | Mix 0.1954 g citric acid and 0.2087 g disodium phosphate in 50 mL of deionised water. Add EDTA to 0.1 mM. Adjust pH to 4.4. | ||
Fixing solution | Prepare formaldehyde/glutaraldehyde, 2.5% (w/v) each in 0.1 M sodium cacodylate buffer, and adjust pH to 7.4. | ||
Aqueous uranyl acetate | Prepare 25% (v/v) uranyl acetate in methanol. | ||
50% methanol/H2O | Mix methanol and H2O 1:1 (v/v). | ||
SEC Column packed with Sepharose CL-2B | Dilute 37.5 ml Sepharose CL-2B resin with 12.5 ml PBS to obtain 75% Sepharose CL-2B solution. Pour the Sepharose CL-2B solution into a column of dimension 2.9 cm [H] x 1.3 cm [W]. Pour the Sepharose CL-2B to 3-4 mm above the stated height, and then press it down to the stated height with the filter for optimal packing. |