Gen terapisi Polycation kaplama DNA Origami nanoyapıların korunması için ilham.
Summary
Burada, DNA origami nanoyapıların doğal katyonik polisakkarit chitosan ve sentetik doğrusal polyethyleneimine (LPEI) kaplama kullanarak Mg tükenmiş ve nükleaz-zengin medya korunması için bir protokol sunulmuştur.
Abstract
DNA origami nanoyapıların biyolojik ve tıbbi uygulamalarda kullanılmak üzere büyük bir potansiyele sahip. Ancak, düşük tuz koşulları ve enzimler fizyolojik sıvılar içinde denatürasyon ve kendi kendine monte DNA nanoyapıların bozulma ikna etmek. Viral gen teslimi, DNA’ın enzimatik bozulması katyonik bir kabuk olumsuz ücret DNA encapsulation tarafından üstesinden gelmek. Burada, esinlenerek gen teslim gelişmeler, basit, tek adımlı ve sağlam metodoloji sunulan DNA origami nanoyapıların sabitleme için doğrusal polyethyleneimine ile kitosan kaplama tarafından. Polycation kaplama verimli bir şekilde DNA origami nanoyapıların Mg tükenmiş ve nükleaz-zengin medya korur. Bu yöntem aynı zamanda DNA taşınımı, enzim ve aptamer göre functionalization tam adreslenebilirliği korur.
Introduction
DNA için programlanabilir kendinden montajlı olarak nano yapılar1çok yönlü bir yapı taşı olduğunu. DNA nanoyapıların oluşturmak için en popüler yöntem temel DNA origami tekniği olduğunu kendinden montajlı bir uzun dairesel, tek iplikçikli DNA’sı2iskele kısa şekli belirleme sentetik elyaf yüzlerce yardımı ile ayrılmaktadır. Bugün, neredeyse her geometri ve morfoloji DNA nanoyapıların oluşturulması kolayca mümkün olabilir. DNA nanoyapıların site-specifically yüksek hassasiyetli3,4 ile functionalized ve allosteric konformasyon değişiklikleri5,6geçmesi için programlanabilir. Bu nedenle, DNA’yı kullanarak bir yapı malzemesi olarak biosensing, teşhis ve ilaç dağıtım programlanabilir ve duyarlı özel tasarlanmış taşınımı için uygulamalar oluşturmak için eşsiz bir fırsat sunmaktadır. Ancak, DNA nanoyapıların sindirim exo– ve endotarafından yatkındır-nükleaz ve kafes tabanlı 3D DNA origami nanoyapıların genel olarak yüksek tuzluluk arabellekleri gerektirir (Örn., 5-20 mM Mg+ 2) korumak için onların bütünlük7,8.
DNA hızlı yıkımı kan ve hücre dışı matriks mevcut enzimler tarafından genetik ürünlerin verimli vivo içinde teslim hücreleri9içine için önemli bir engeldir. DNA viral gen teslim, bu sınırlamayı aşmak için tanımlanmış bir N/P ücret oranı (oranı fosfatlar DNA’polycation aminlerin)10katyonik bir polimer ile karıştırılır. DNA karmaşık polyplex bilinen katyonik bir polimer ile DNA nükleaz aracılı bozulması korur ve11hücresel alımını artırır. İlham gen teslim gelişmeler, oligolysine12, oligolysine-Polietilen glikol (PEG) kopolimerler13, poli (2-dimetilamino-ethylmethacrylate) (PDMAEMA) tarafından-esaslı polimerler14ve virüs kapsid protein15 DNA origami nanoyapıların sabitleme için kullanılmıştır.
Son zamanlarda, biz DNA origami nanoyapıların Mg tükenmiş olarak korunması için bir yöntem rapor ve doğal katyonik polisakkarit chitosan ve sentetik doğrusal polyethyleneimine (LPEI) kullanarak nükleaz-zengin medya bildirilen16oldu. Bu makalede önceki çalışmalarımız bir uyarlaması ve polyplexes, onların karakterizasyonu, düşük tuz ve nükleaz zengini medyada çıplak ve korumalı nanoyapıların kararlılığını test ve inceleyerek hazırlanması için detaylı protokolünü açıklar enzim ve aptamer functionalized DNA origami nanoyapıların polycation kaplama üzerine adreslenebilirliği.
Protocol
1. Polycation hisse senedi çözüm hazırlanması LPEI hisse senedi çözüm LPEI içeren bir cam kabı içine 10 mg Ekle < H2O. 10 mL LPEI tamamen erimesi için pH 2.0 ulaşan kadar HCl () ekleyin. PH 7. 0 NaOH (10 M) ekleyerek ayarlayın. Son konsantrasyonu 1 mg/mL için ses düzeyini ayarlayın. 0,22 µm membran ile LPEI hisse senedi çözüme filtrate. Kitosan hisse senedi çözüm Kitosan oligosakkarit laktat 16.6 mg dağıtılması (Mw ~ 5 kDa, % 60 oligosakkarit kompozisyon, kitin % 90 deacetylated) 1 ml asetik asit (% 10) sulu medya 10 mg/mL bir konsantrasyon ile hisse senedi bir çözüm hazırlamak için. 2. DNA Origami nanoyapıların saflaştırılması Mix 100 µL DNA origami örneği (5 mM Tris, 1 mM EDTA, 5 mM NaCl arabelleği (TB belirtilir) 18 mM MgCl2de dahil olmak üzere) 22 mM MgCl eşdeğer hacmi ile2 TB desteklenmiştir (100 µL) 1,5 mL tüp içinde. 200 µL arıtma arabelleği ( (w/v) 8.000 PEG, 5 mM Tris, 1 mM EDTA ve 505 mM NaCl) ekleyin. Tüp INVERSION tarafından karışımı yavaşça. 16.000 × g için 25 dk (t.c.) Oda sıcaklığında da örneğine spin. Dikkatle süpernatant atın ve Pelet 16 mM MgCl takıma2 TB arabellekte resuspend. Süpernatant ve Pelet aşırı zımba lifler ve zarlarını DNA origamisi, sırasıyla içerir. Örnek bir thermomixer 650 rpm’de t.c., bir gün için kuluçkaya. Bu adım DNA origamisi tam resuspension için olduğunu. 3. özel jel elektroforez (Yaş) 1.6 g özel ve 80 mL 0.5 x TAE arabelleği (20 mM Tris, 0,5 mM EDTA, 10 mM asetik asit, pH 8) % 2 özel jel hazırlamak için bir cam kabı ekleyin. 5 dakika süreyle mikrodalga bir su banyosunda kabı 1 dk. için içeriğini girdap. MgCl2 (2,5 M) jel ile 11 mM MgCl2hazırlamak için 352 µL ekleyin. Jel 10 µL DNA jel leke ile önceden leke. Jel solüsyonu kuru jel kutusu dökün ve bir jel elektroforez tarak ekleyin. T.c. için 15-30 dakika, kuvvetlendirmek çözüm ver. 11 mM MgCl2ile çalışan tampon (TAE arabellek x 0.5) ek. Örnek 10-20 µL 6 yükleme arabellek ( (v/v) gliserol, %0.25 (w/v) bromophenol mavi, %0.25 (w/v) ksilen cyanol FF) x % 20’si ile karıştırın ve özel jel kuyu yükleyin. 70 V için 2,5 – t.c., jel çalıştırmak 3 h. Jel UV tarayıcıyla görselleştirin. 4. negatif leke transmisyon elektron mikroskobu (nsTEM) 5 µL seyreltilmiş nanostructure veya polyplex bir ışıma taburcu karbon kaplı Cu400 TEM ızgara üzerinde uygulayın. Ca. için absorbe izin 1 dak. Izgarayı kenarından aşırı sıvı bir filtre kağıt parçası tarafından tahliye. 5 µL % 2 uranyl asetat sulu çözüm uygulamak ve için 1 dakika bekleyin. Filtre kağıdı kenar tamamen ızgara kenarından aşırı sıvı boşaltmak için kullanın. TEM enjekte önce kurumasını kılavuz izin. 5. Polyplex oluşumu Not: DNA origamisi ve kitosan N/P 0,01-8 oranları, oluşan bir polyplex hazırlanması için açıklayıcı örnek. Aminler formula-1 (Tablo 1) kullanarak polycation başına sayısını hesaplayın. Bir ultra violet spektrofotometre 260 kullanarak saf DNA origamisi konsantrasyonu ölçmek nm. 2 µL TB arabelleği boş makine ayarlamak için kullanın. Fosfat “” nmol hesaplamak 2 formula kullanarak. Fosfat 1 nmol dahil olmak üzere DNA origami yapısının 15 µL hazırlayın. Formül-3 N/p 0,01-8 polyplex hazırlamak için gerekli kitosan hacmi hesaplamak için kullanın. 1.8 µL chitosan (0,8 mg/mL), örneğin, polyplex N/P 8 hazırlamak için gerekli (N/P 8 olduğunu, fosfat nmol is 1, molekül ağırlığı chitosan şey 5000 g/mol, kitosan hisse senedi çözüm konsantrasyonu 0,8 mg/mL ve aminler kitosan başına sayısı 28). TB 13.2 µL chitosan (0,8 mg/mL) 1.8 µL için ekleyin. Kitosan çözüm (0,8 mg/mL) 15 µL DNA origamisi 15 µL için adım 5.3 DNA origami-chitosan polyplex NP 8 ile almak için ekleyin. Polyplex kendiliğinden oluşur. 5.4 polyplexes farklı N/P oranları, hazırlamak için adımları yineleyin. Bir yaş (Şekil 1A) adım 3’te açıklandığı gibi gerçekleştirin. Çıplak DNA origamisi denetimi olarak içerir. Polyplex (Şekil 2) adım 4’te açıklandığı gibi görüntü.Formula-1) polycation başına Amin grup sayısıFormül-2) fosfat mol=Formül-3) Polycations (µL) hacmi= 6. Dextran sülfat ile kapsülden çıkarma Formül-4 (Tablo 2) kullanarak dextran sülfat başına sülfat grupları sayısını hesaplayın. Polyplex, önceden tanımlanmış bir decomplexation için gerekli dextran sülfat hacmi hesaplamak A / P oranı kullanarak formül-5. A / P şarj polianyon (A) sülfat grupları arasındaki oran DNA origamisi fosfat grupları (P) oranıdır. Dextran sülfat aşırı miktarda (Örneğin 500-1000) polyplexes verimli bir decomplexation için gereklidir. Örneğin, polyplex decomplex için hazırlanan Bölüm 5 (polyplex içeren 1 nmol fosfat) A’da / P 1000, dextran sülfat 40 kDa (50 mg/mL) 3.6 µL gereklidir (A / P 1000, fosfat nmol 1, 40.000 g/mol moleküler ağırlığıdır dextran sülfat dextran sülfat hisse senedi çözüm konsantrasyonu 50 mg/mL ve sülfat sayısı 220). 3.6 µL dextran sülfat (50 mg/mL) polyplex için 5,4 adımından ekleyin ve iyice karıştırın. Eğer chitosan polyplex ile çalışma, NaOH decomplexation sürecini kolaylaştırmak için ekleyin. NaOH 10 mM son bir konsantrasyon için ekleyin. LPEI polyplexes için bu adımı atlayın. Bir yaş (Şekil 1B) adım 3’te açıklandığı gibi gerçekleştirin. Bir çıplak DNA origamisi ve polyplex denetimi olarak içerir.Formül-4) sülfat grupları polianyon başına sayısı =Formül-5) Dextran sülfat (µL) hacmi= 7. istikrar Mg tükenmesi doğru Bir DNA origamisi veya karşılık gelen polyplex (2 nmol fosfat dahil) 20 µL 4 x 600 µL Mg-sıfır arabelleği (5 mM Tris, 1 mM EDTA ve 30 mM NaCl) ile yıkayın Ultrafiltrasyon sütunu kullanarak (MWCO ~ 3 kDa). T.c. 3-5 dk de 14,000 × g her yıkamada spin. Kalan çözüm (80 µL) toplamak ve bir gün bir thermomixer 650 rpm için 37 ° C’de kuluçkaya. LPEI polyplex sınama olumlu sonuçlanırsa, MgCl2 (500 mM) 2.5 µL 16 mM MgCl2son bir konsantrasyon için ekleyin. Daha sonra dextran sülfat-40 kDa (50 mg/mL) 7 µL ekleyin (eşdeğer a / P 1000) core nanoyapıları DNA çözülmeye (kapsülden çıkarma, bkz. Adım 6).Not: chitosan polyplex veya çıplak DNA origami ile çalışıyorsanız bu adımı atlayın. NsTEM görüntüleme (Şekil 2) adım 3’te açıklandığı gibi izleyin. 8. DNaz Ben çıplak DNA Origami nanoyapıların titrasyon tahlil Mix 3 µL 1 nmol fosfat ile 10 x 2 µL dahil olmak üzere çıplak DNA origami DNaz (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl2, 5 mM CaCl2, pH 7,6), MgCl2 (250 mM), su 0.2 ml PCR 12 µL 1 µL tampon tüpleri. DNaz 2 µL ekleyin ben (10 x). DNaz hisse senedi toplama ayarlamak ben (son DNaz almak için 10 x) ben 0,25-2 konsantrasyonları U/mL. Örnekleri için bir thermocycler 1-2 h 37 ° C’de kuluçkaya. Buz örneklerinde bırakın ve nucleolytic etkinlik 500 mM dithiothreitol (DTT) 2 µL ekleyerek devre dışı bırakın ve EGTA (33 mM) 2.5 µL. 3. adımda açıklandığı gibi bir yaş kullanarak örnekleri analiz. 9. Polyplexes doğru DNaz kararlılığını ben Mix 4 µL (fosfat, farklı N/P oranlarıyla hazırlanan 1 nmol dahil olmak üzere) bir polyplex, bir DNaz 1,5 µL ile (10 x) arabellek, TB 8 µL ve 1,5 µL DNaz, ı (100 U/mL) 0.2 mL PCR tüp. Örnek bir thermocycler olarak 37 ° C’de 24 h için kuluçkaya. İndinavir DNaz ı. kuluçkaya bir thermocycler olarak 37 ° C’de 30 dk için sindirimi K (20 mg/mL) 2 µL ekleyin.Not: enzimatik sindirim yerine, ben DTT (500 mM) ekleyerek 1,5 µL ve EGTA (33 mM) 2 µL tarafından gerçekleştirilen DNaz, kimyasal etkinliğini. 3.6 µL dextran sülfat-40 kDa (50 mg/mL), Ekle (eşdeğer a / P 1000) core nanoyapıları DNA çözülmeye. Yaş (Şekil 3A, Şekil 3 c) adım 3’te açıklandığı gibi gerçekleştirin. Ölçüm ve karşılaştırma grubu yoğunluklarda jel üzerinde denetimi olarak taze DNA origamisi içerir. Grup yaş ve özü bir sıkmak tarafından DNA origamisi dondurmak tedarikçi tarafından sağlanan protokolünü temel ayıklama sütun tüketim. NsTEM görüntüleme (Şekil 2) adım 4’te açıklandığı gibi izleyin. 10. istikrar Fetal sığır Serum (FBS) doğru TB + 17 µL ile çıplak DNA origamisi veya (fosfat 1 nmol dahil) onun karşılık gelen polyplex mix 4 µL FBS 0.2 ml PCR tüpleri. Taze çözdürülen FBS kullanın. Örneği bir termal cycler 24 h içinde 37 ˚C’kuluçkaya. Örnek bir buz banyosu içinde bırakın. Polyplex sınama olumlu sonuçlanırsa, dextran sülfat-40 kDa (50 mg/mL) 3.6 µL ekleyerek kapsülden çıkarma işlemi gerçekleştirin. Ayrıca, NaOH (bkz. Adım 6.3) kitosan polyplexes ile çalışıyorsanız Ekle Bir yaş adım 3’te açıklandığı gibi gerçekleştirin. Ölçüm ve karşılaştırma grubu yoğunluklarda jel üzerinde denetimi olarak taze DNA origamisi içerir. Grup yaş üzerinde tüketim ve DNA origamisi bir sıkmak donma ayıklama sütuna göre ayıklayın. 2 µL (20 mg/mL), İndinavir K ayıklanan DNA origami çözüm (20 µL) 0.2 mL PCR tüp içinde ekleyin. Taşınımı için bağlı serum proteinleri sindirmek için bir thermocycler olarak 37 ° C’de 30 dk için kuluçkaya. Örnek 5 x 500 µL 16 mM MgCl2 ultrasantrifüj sütun kullanımı da dahil olmak üzere TB ile yıkayın (MWCO ~ 100 kDa) İndinavir K yıkamak için (MW ~ 28,9 kDa) uzaklıktadır. T.c. 3-5 dk de 14,000 × g her yıkamada spin. NsTEM görüntüleme adım 4 (Şekil 3) açıklandığı gibi gerçekleştirin.Not: Adım 10,6 jel ayıklanan örnek doğrudan nsTEM görüntüleme için kullanılabilir. Ancak, görüntüleme serum protein ek DNA origami taşınımı için nedeniyle çok zor olacaktır. Bu nedenle, İndinavir K tedavi (adım 10,7 10,9) görüntüleme sürecini kolaylaştırmak için önerilir. 11. Horseradish peroksidaz enzim (HRP) adreslenebilirliği test-DNA origamisi kaplama ile Polycations üzerine functionalized 2. adımda açıklandığı gibi kendi kendine monte biotinylated-NR (Biotin-NR) arındırmak. Saf Biotin-NR 200 µL kuluçkaya (36 nM, 16 mM takıma TB arabellek) HRP Birleşik streptavidin 200 µL ile (540 nM, TB arabelleği). MgCl2 (500 mM) 4,8 µL 14 mM son bir konsantrasyon için ekleyin. T.c. 12 h bir thermomixer 650 rpm için kuluçkaya HRP-functionalized NR (HRP-NR) bir PEG arıtma yöntemi ile ilişkisiz HRP enzimler kaldırmak için (2. adımda açıklandığı gibi) arındırmak. Çöktürülmüş HRP-NR TB 16 mM MgCl2de dahil olmak üzere resuspend. Arıtılmış HRP-NR Mix 6.5 µL (36 nM) ile N/P oranları 1, 2, 4, 10 ve 20 ( Formül 3kullanarak), polyplex hazırlamak için varyant konsantrasyonları polycations 6.5 µL. 11.2-11,4 sigara biotinylated NR için yineleyin. HRP enzim özellikle DNA origami, Sigara biotinylated DNA origamisi bağlamak gibi hangi HRP enzimler ve PEG ile tedavi edilir (Biotin-NR için benzer) saf, tahlil denetiminde olarak görev yapacak. Mix 6.5 µL distile su ile 6,5 µL varyant konsantrasyonları, 1, 2, 4, 10 ve 20 tanımlanmış N/P oranları karşılık gelen polycations. Tez örnekleri boş Grup olarak hizmet vermektedir. Adımda 11,4-11,6 (12.5 µL) hazır çözüm HEPES tampon 72,5 µL dahil olmak üzere bir 96-şey plakasına eklemek (25 mM HEPES, 20 mM KCl, 200 mM NaCl, % 0.05 Triton X-100, % 1 DMSO, pH 7,4) ve iyice karıştırın. 2, 2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS) (15 mM) 10 µL ekleyin. H2O2 (12 mM) 5 µL ve de yukarı ve aşağı pipetting karıştırın. H2O2 reaksiyonu başlatır. 421 absorbans ölçmek nm 4 h multimod plaka okuyucu (Şekil 4A) ile üzerinden. 12. Hemin bağlama Aptamers (HBA) adreslenebilirliği test-DNA origamisi kaplama ile Polycations üzerine functionalized HBA functionalized-NR (HBA-NR) 2. adımda açıklandığı gibi arındırmak. Çöktürülmüş HBA-NR 6 mM MgCl2 (daha yüksek tuz konsantrasyonu yol açar HBA-NR toplama) ile takıma TB resuspend. HBA-NR Mix 10 µL (40 nM) ile tanımlanmış N/P oranları, 1, 2, 10 ve 20 polyplex hazırlamak için değişen konsantrasyon, polycations 10 µL. Çıplak-NR Mix 10 µL (40 nM) veya distile su ile polycations, 1, 2, 10 ve 20 N/P oranları karşılık gelen değişik konsantrasyonlarda 10 µL. 20 µL hazır çözüm adımları 12,2 ve 12,3 HEPES tampon 60 µL dahil olmak üzere 96-şey plaka ekleyin (25 mM HEPES, 20 mM KCl, 200 mM NaCl, % 0.05 Triton X-100, % 1 DMSO, pH 7,4) ve iyice karıştırın. (Kimden adım 12,2 ve 12,3) 20 µL polyplex veya polycation çözüm yerine su ile en az bir boş örnek içerir. 5 µL hemin (0.04 mM), ATBS (15 mM) 10 µL tarafından takip ekleyin. Plaka 5 min için bir orbital çalkalayıcı yerleştirin. H2O2 (12 mM) 5 µL ve de yukarı ve aşağı pipetting karıştırın. 421 nmover 30 dk absorbans multimod plaka okuyucu (Şekil 4B) ile ölçmek.
Representative Results
Bir nanorod (NR), nanobottle (NB) ve (nanoyapıların 3D modellerinin Şekil 2′ de gösterilmiştir) bir tel kafes nanostructure (aşağı) dahil olmak üzere üç DNA origami nanoyapıların farklı konfigürasyonları tasarlanmıştır. NR ve NB müstenit Meydanı ve petek kafes, anılan sıraya göre tasarlanmıştır, caDNAno17 ve WN kullanarak Daedalus yazılım18kullanılarak oluşturulmuş. Kapsamlı bir protokol tasarımı için kendinden montajlı ve DNA nanoyapıların oldu zaten19,20,21,22yayınlandı. Lifler sipariş, kendi kendine monte ve daha fazla saf şekli özel elyaf Stahl ve arktarafından açıklanan bir protokol temel. 23 (adım 2). Polyplexes jel retardasyon tahlil ve nsTEM görüntüleme ile karakterize. DNA origamisi polycations ile karıştırma üzerine, çıplak nanostructure grubun katot doğru bir kayma (Şekil 1A) gözlenmiştir. Bu fosfat grupları bağlama polycations ve toplam boyutunun üzerine karmaşık artırır negatif ücretten dengelemek için bağlanabilir. Polyanions dextran sülfat gibi ilave bir miktar ekleniyor polyplex oluşumu tersine çevirebilirsiniz. Bu konuda, daha yüksek molekül ağırlıklı dextran sülfat (MW ~ 40 kDa) kıyasla daha düşük moleküler ağırlıklı dextran sülfat decomplexation için daha verimli olmasını gösterdi (MW ~ 4 kDa) (resim 1B). LPEI polyplexes tarafından uranyl asetat negatif leke TEM görüntüleme sırasında herhangi bir parçacık görüntü zordu. Olan o LPEI bağlama uranyl asetat DNA origamisi sıkı koruma nedeniyle fosfat omurgasına engel. Bu nedenle, nsTEM görüntüleme önce dextran sülfat aşırı miktarda LEPI polyplexes için eklendi. Sökülmüş DNA origami nanoyapıların kusur ne de çürüme belirtisi gösterdi. Tersine, kitosan polyplexes başarıyla gerek polianyon tedavi (Şekil 2) ile görüntüsü. Tüm çıplak DNA taşınımı (ne olursa olsun onların farklı yapılandırmaları) nsTEM görüntüleme tarafından doğruladı, kuluçka Mg-sıfır tampon, 37 ° C’de bir gün sonra tamamen denatüre vardı. Buna ek olarak, LPEI veya kitosan, N/P≥1 ile kaplı nanoyapıların sağlam kaldı. Benzer şekilde, DNaz ben titrasyon deneyleri enzimatik sindirim karşı korumasız nanoyapıların duyarlılık gösterdi. Çıplak nanoyapıların tamamen ben 2 h, LEPI veya kitosan DNA origamisi kapsüllenmiş sonra içinde sağlam kaldı 1 U/mL DNaz huzurunda sindirmek iken Mg-sıfır arabellek takıma 10 U/mL DNaz ile ben bir gün (Şekil 2) en az için. Nucleolytic sindirim karşı daha yüksek kararlılık polyplexes N/P oranı artırarak sağlanır. Ayrıca, LPEI DNA nanoyapıların daha verimli bir şekilde chitosan (Şekil 3A, Şekil 3C) göre muhtemelen LEPI ve böylece, daha yüksek bağlama benzeşme DNA24 doğru daha yüksek ücret yoğunluk nedeniyle korur . Hiçbir fark farklı molekül ağırlığı LPEI kullanırken gözlendi (şekil3B). Fonksiyonel gruplar halinde DNA nanoyapıların adreslenebilirliği bir polimer kabuk katma sonra önemli bir özelliktir. Ayrıca, polycation kaplama uyumluluk horseradish peroksidaz enzim (HRP) ve hemin bağlama functionalized aptamers (HBA) DNA origami ile incelenmiştir. Üç biotinylated elyaf lifler NR yüzeyinden fırlamıştı ve Birleşik HRP streptavidin (DNA origamisi başına üç enzimler) ile functionalized. Catalytically son derece etkin (Kd: 439 nM) HBA aptamer PS2. M (5′-GTGGGTAGGGCGGGTGG-3′) bu deneyler25için seçildi. Kadar 24 elyaf iplikleri ile 5-nm uzunluğu bağlayıcı NR yüzeyinden fırlamıştı (5′-AAAAGAAAAGAAAAA-3′) tarafından PS2 izledi. M serisi (DNA origamisi başına 24 aptamers). Enzimatik olarak dikkat çekici hiçbir engel ya da aptamer etkinliği gözlenen HRP veya HBA functionalized DNA origamisi LPEI ve varyant N/P oranları (Şekil 4A-B)16kitosan kaplama üzerine. Ancak, kinetik HRP enzim dramatik DNA origamisi (Şekil 4C) bağlamayı sonra değiştirildi. Resim 1 : Polyplex oluşumu ve kapsülden çıkarma temsilcisi yaş görüntüleri. (A) elektroforetik hareketlilik üst karakter tahlil NB için 0,01-8 N/P oranları, kitosan ile karışık. Her lane 1 nmol NB içerir İlk lane NB başvurudur Polyplexes tarafından polyanionic dextran sülfat (DS), (B) kapsülden çıkarma. Bu rakam önceden yayınlanmış şekil16değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Resim 2 : Negatif leke TEM filmler DNA origamisi ve polyplexes. 3D modeli ve nsTEM Filmler çıplak DNA origami taşınımı (sütun 1 ve 2). nsTEM filmler LPEI polyplexes (sonra kapsülden çıkarma) ve kitosan polyplexes (sütun 3 ve 4). nsTEM resimleri çıplak ve korumalı DNA origami (polyplex) Mg tükenmesi (5, 6 ve 7 sütun) enzimatik bozulması (sütunlar 8 ve 9), serum sindirim (sütunlar 10 ve 11) 37 ° C’de bir gün için tabi. LPEI-5 kDa bu tahlil kullanıldı. Çıplak DNA nanoyapıların bozulmuş bir yaş 1 U/mL DNaz huzurunda algılamayı ötesinde ben veya TB + % 10 FBS, kuluçka 37 ° C’de 2 h sonra Ölçek çubukları: 100 nm. Bu rakam önceden yayınlanmış şekil16değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 3 : DNaz temsilcisi sonuçlarını ben koruma deneyleri. (A) DNaz ben koruma tahlil için aşağı polyplexes LPEI-5 kDa, LPEI-10 kDa ve LPEI-25 kDa N/P oranı 2, 4, 8 ve 10 hazır. Örnekleri 10 U/mL DNaz tabi tutuldu ben 37 ° C’de 24 h için Son lane WN denetimidir. Polyplexes decapsulated jel yükleme önce vardı. (B) normalleştirilmiş ortalama bant yoğunluğu ile farklı DNA origamis polyplexes için LPEI yaşından itibaren resim-A. çıkarılan Y ekseni normalleştirilmiş ortalama bant yoğunluk temsil eder. (C) DNaz ben koruma testin kitosan-WN polyplexes hazırlanan N/P oranları, 1, 2, 4, 10 ve 20. Örnekleri 10 U/mL DNaz tabi tutuldu ben 37 ° C’de 24 h için Lane 6 denetimi polyplex (N/P 20) olduğunu. Son lane WN denetimidir. Tüm chitosan polyplexes jel decapsulated önceden yükleme vardı. Bu rakam önceden yayınlanmış şekil16değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 4: DNA origami deneyleri Renkölçer enzim – ve aptamer-functionalized sonuçlarını temsilcisi. (A) enzim functionalized taşınımı (HRP-NR) kitosan 3.7 h ile reaksiyon başladıktan sonra kaplı Renkölçer tahlil. (B) aptamer functionalized taşınımı (HBA-NR) kitosan, reaksiyon başlanmasından sonra 6 dk ile kaplı Renkölçer testin. Y ekseni normalleştirilmiş absorbans temsil eder. (C) zaman içinde HRP ve HRP-NR Renkölçer tahlil izleme. Bu rakam önceden yayınlanmış şekil16değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Katyonik Polimerler Kitosan LPEI-5 kDa LPEI-10 kDa LPEI-25 kDa Polimer (kDa) molekül ağırlığı 5 5 10 25 Molecualr ağırlığı monomer (g/mol) 161 43 43 43 Amin monomer başına sayısı 1 1 1 1 Amin polimer başına sayısı 28 116 232 581 Tablo 1. Amin grupları polycation başı hesaplanıyor. Moleküler Ağırlık dextran sülfat (kDa) 4 40 Molekül ağırlığı monomer (g/mol) 366 366 Sülfat monomer başına sayısı 2 2 Sülfat polimer başına sayısı 22 220 Tablo 2. Sülfat grupları polianyon başı hesaplanıyor.
Discussion
İçinde kendinden montajlı DNA origamisi elyaf iplikleri genellikle 5-10 aşırı oranda iskele için eklenir. Bu aşırı zımba lifler de monometer aralığındaki polycation ve form polyplexes daha fazla DNA origami polyplexes ayrılması zor olan bağlayın. Bu nedenle, polyplex oluşumunda önemli bir adım fazla zımba ipliklerini kaldırmak ve iyi saf DNA origami nanoyapıların kullanmaktır.
DNA iplikçiklerin tıklayın tepki26üzerinden cyclization gibi DNA nanoyapıların sabitleme için diğer yöntemleri geliştirilmiştir. Zımba iplikçikleri alkin ve azid modifiye hatırlayan tek iplikçikli yüzük oluşumu için gerekli olduğundan, bu teknik küçük nanoyapıların böyle bir DNA catenane sabitleme için sınırlıdır ve daha büyük DNA origamisi için kolayca ölçeklenebilir değildir yapısı bu protokol için kullanılanlar gibi. Son zamanlarda, Gerling et birl.27 ultraviyole ışın kullanarak DNA nanoyapıların içinde komşu thymidines arasında kovalent cyclobutene pirimidin dimer (GBM) bağlar oluşturmak için bir yöntem bildirdi. Bu yöntem site seçici ve ölçeklenebilir olsa da, DNA origamisi koruma konusunda verimlilik polycation kaplama daha çok daha düşüktür. Örneğin, 0.4 U/mL DNaz ben 1 h, polyplexes iken kararlı sadece 10 U/mL DNaz varlığında ben en az bir gün CPD-sağlamlık DNA origami nesneleri katlanmak.
Kısacası, gen tedavisi chitosan ve ilham LPEI kaplama bir düşük maliyetli, tek adımlı ve DNA origami nanoyapıların Mg tükenmiş ve nükleaz-zengin medya uzun vadeli istikrar adrese verimli yöntem. Reversibility polyplex oluşumu nerede DNA origamisi nucleolytic bozulma ya da tuz-tükenmesi karşı korunması çok önemli bir adım ama diğer adımlar DNA gibi sorunlara neden olabilir çok adım tanı testleri kendi uygulamasında kolaylaştırır amplifikasyon. Ayrıca, polycation kaplama DNA origami taşınımı için ilaç dağıtım uygulamaları28hücresel alımını arttırmak için potansiyel bir yaklaşımdır.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu proje Avrupa Birliği’nin ufuk 2020 araştırma ve yenilik programı kapsamında hibe Sözleşmesi No 686647 fon aldı. TEM görüntüleri üzerinde 80 işletilen bir Morgagni kaydedildi kV Viyana Biocenter çekirdek imkanları GmbH (VBCF), EM tesisinde. Biz Tadija Kekic tel kafes nanostructure tasarlamak için grafik tasarım ve Elisa De LIano yardım için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| 10× DNase I reaction buffer | New England Biolab (NEB) | B0303 | |
| ABTS (2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt) | Alfa Aesar | J65535 | |
| Amicon ultracentrifugation columns | Merck Millipore | UCF500308, UCF510024 | |
| Chitosan oligosaccharide lactate (Mn ~ 4000-6000, > 90% deacetylated, 60%. composition oligosaccharide | Sigma-Aldrich | 523682 | |
| Design-specific staple strands | Integrate DNA Technologies (IDT) | ||
| Dextran sulfate sodium salt (Mr ~ 4 kDa) | Sigma-Aldrich | 75027 | |
| Dextran sulfate sodium salt (Mr ~ 40 kDa) | Sigma-Aldrich | 42867 | |
| DNA gel loading dye (6×) | ThermoFischer sceintific | R0611 | |
| DNase I (RNase free) | New England Biolab (NEB) | M0303 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) BioUltra, anhydrous, ≥99% (titration) | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Freeze'N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Columns | Biorad | 7326165 | |
| Hemin | Sigma-Aldrich | H9039 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrogen peroixde slution (32 wt%) | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| LPEI-25 kDa | Polysciences, Inc | 23966-1 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (500 mM dithiothreitol (DTT)) | ThermoFischer sceintific | NP0004 | |
| Polyethylene glycol (PEG, MW ~ 8000 Da) | Carl Roth | O263.1 | |
| Polyethylenimine, linear, average Mn 10,000, PDI ≤1.2 | Sigma-Aldrich | 765090 | |
| Polyethylenimine, linear, average Mn 5,000, PDI ≤1.3 | Sigma-Aldrich | 764582 | |
| Proteinase K solution (20 mg/ml) | ThermoFischer sceintific | AM2548 | |
| Streptavidin-conjugated HRP | ThermoFischer sceintific | N100 | |
| SYBER safe DNA gel stain | ThermoFischer sceintific | S33102 |
References
- Jones, M. R., Seeman, N. C., Mirkin, C. A. Nanomaterials. Programmable materials and the nature of the DNA bond. Science. 347 (6224), 1260901 (2015).
- Rothemund, P. W. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).
- Takabayashi, S., Klein, W. P., Onodera, C., Rapp, B., Flores-Estrada, J., Lindau, E., Snowball, L., Sam, J. T., Padilla, J. E., Lee, J., Knowlton, W. B., Graugnard, E., Yurke, B., Kuang, W., Hughes, W. L. High precision and high yield fabrication of dense nanoparticle arrays onto DNA origami at statistically independent binding sites. Nanoscale. 6 (22), 13928-13938 (2014).
- Kuzyk, A., Schreiber, R., Zhang, H., Govorov, A. O., Liedl, T., Liu, N. Reconfigurable 3D plasmonic metamolecules. Nature Material. 13 (9), 862-866 (2014).
- Douglas, S. M., Bachelet, I., Church, G. M. A logic-gated nanorobot for targeted transport of molecular payloads. Science. 335 (6070), 831-834 (2012).
- Choi, Y., Choi, H., Lee, A. C., Lee, H., Kwon, S. A Reconfigurable DNA Accordion Rack. Angewandte Chemie International Edition. 57 (11), 2811-2815 (2018).
- Kielar, C., Xin, Y., Shen, B., Kostiainen, M. A., Grundmeier, G., Linko, V., Keller, A. On the stability of DNA origami nanostructures in low-magnesium buffers. Angewandte Chemie International Edition. 57 (30), 9470-9474 (2018).
- Hahn, J., Wickham, S. F. J., Shih, W. M., Perrault, S. D. Addressing the instability of DNA nanostructures in tissue culture. ACS Nano. 8 (9), 8765-8775 (2014).
- Al-Dosari, M. S., Gao, X. Nonviral Gene Delivery: Principle, limitations, and recent progress. The AAPS Journal. 11 (4), 671 (2009).
- Ibraheem, D., Elaissari, A., Fessi, H. Gene therapy and DNA delivery systems. International Journal of Pharmaceutics. 459 (1-2), 70-83 (2014).
- Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. Design and development of polymers for gene delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (7), 581-593 (2005).
- Ponnuswamy, N., Bastings, M. M. C., Nathwani, B., Ryu, J. H., et al. Oligolysine-based coating protects DNA nanostructures from low-salt denaturation and nuclease degradation. Nature Communication. 8, 15654 (2017).
- Agarwal, N. P., Matthies, M., Gür, F. N., Osada, K., Schmidt, T. L. Block copolymer micellization as a protection strategy for DNA origami. Angewandte Chemie International Edition. 56 (20), 5460-5464 (2017).
- Kiviaho, J. K., Linko, V., Ora, A., Tiainen, T., Järvihaavisto, E., Mikkilä, J., Tenhu, H., Nonappac, M. A., Kostiainen, Cationic polymers for DNA origami coating – examining their binding efficiency and tuning the enzymatic reaction rates. Nanoscale. 8 (22), 11674-11680 (2016).
- Perrault, S. D., Shih, W. M. Virus-inspired membrane encapsulation of DNA nanostructures to achieve in vivo stability. ACS Nano. 8 (5), 5132-5140 (2014).
- Ahmadi, Y., De Llano, E., Barišić, I. (Poly)cation-induced protection of conventional and wireframe DNA origami nanostructures. Nanoscale. 10 (16), 7494-7504 (2018).
- Douglas, S. M., Marblestone, A. H., Teerapittayanon, S., Vazquez, A., Church, G. M., Shih, W. M. Rapid prototyping of 3D DNA-origami shapes with caDNAno. Nucleic Acids Research. 37 (15), 5001-5006 (2009).
- Veneziano, R., Ratanalert, S., Zhang, K., Zhang, F., Yan, H., Chiu, W., Bathe, M. Designer nanoscale DNA assemblies programmed from the top down. Science. 352 (6293), 1534 (2016).
- Castro, C. E., Kilchherr, F., Kim, D. N., Shiao, E. L., Wauer, T., Wortmann, P., Bathe, M., Dietz, H. A primer to scaffolded DNA origami. Nature Methods. 8 (3), 221-229 (2011).
- Amir, Y., Abu-Horowitz, A., Bachelet, I. Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami. Journal of Visualized Experiment. (106), 51272 (2015).
- Ben-Ishay, E., Abu-Horowitz, A., Bachelet, I. Designing a bio-responsive robot from DNA origami. Journal of Visualized Experiment. (77), 50268 (2013).
- Wei, B., Vhudzijena, M. K., Robaszewski, J., Yin, P. Self-assembly of complex two-dimensional shapes from single-stranded DNA tiles. Journal of Visualized Experiment. (99), 52486 (2015).
- Stahl, E., Martin, T. G., Praetorius, F., Dietz, H. Facile and scalable preparation of pure and dense DNA origami solutions. Angewandte Chemie International Edition. 53 (47), 12735-12740 (2014).
- Grigsby, C. L., Leong, K. W. Balancing protection and release of DNA: tools to address a bottleneck of non-viral gene delivery. Journal of the Royal Society Interface. 7 (1), 67-82 (2010).
- Li, T., Dong, S., Wang, E. G-quadruplex aptamers with peroxidase-like DNAzyme functions: which is the best and how does it work. Chemistry – An Asian Journal. 4 (6), 918-922 (2009).
- Cassinelli, V. 1., Oberleitner, B., Sobotta, J., Nickels, P., Grossi, G., Kempter, S., Frischmuth, T., Liedl, T., Manetto, A. One-Step Formation of “Chain-Armor”-Stabilized DNA Nanostructures. Angewandte Chemie International Edition. 54 (27), 7795-7798 (2015).
- Gerling, T., Kube, M., Kick, B., Dietz, H. Sequence-programmable covalent bonding of designed DNA assemblies. Science Advances. , 1157 (2018).
- Xia, T., Kovochich, M., Liong, M., Meng, H., Kabehie, S., George, S., Zink, J. I., Nel, A. E. Polyethyleneimine Coating Enhances the Cellular Uptake of Mesoporous Silica Nanoparticles and Allows Safe Delivery of siRNA and DNA Constructs. ACS Nano. 3 (10), 3273-3286 (2009).
Cite This Article
Ahmadi, Y., Barisic, I. Gene-therapy Inspired Polycation Coating for Protection of DNA Origami Nanostructures. J. Vis. Exp. (143), e58771, doi:10.3791/58771 (2019).