Gene-terapia inspirou Polycation revestimento para proteção de nanoestruturas de Origami de DNA

1. preparar a solução de estoque Polycation Solução LPEI Adicionar 10 mg de LPEI em um copo de vidro que contém < 10 mL de H2O. Para dissolver completamente LPEI, adicione HCl (32%) até atingir pH 2,0. Ajuste o pH a 7,0 pela adição de NaOH (10 M). Ajuste o volume para a concentração final de 1 mg/mL. Filtra a solução estoque de LPEI através de uma membrana de 0,22 µm. Solução-mãe de quitosana Dissolver 16,6 mg de lactato de chitosan oligosaccharide (Mw ~ 5 kDa, composição de oligossacarídeo de 60%, deacetiladas de quitina em 90%) em 1 mL de ácido acético (10%) meios aquosos para preparar uma solução com uma concentração de 10 mg/mL. 2. purificação de DNA Origami nanoestruturas Mix 100 µ l da amostra de origami do DNA (em 5 mM Tris, EDTA 1 mM, 5 mM NaCl buffer (denotado como TB) incluindo 18 mM MgCl2) com o volume equivalente de 22 mM MgCl2 suplementado TB (100 µ l) em um tubo de 1,5 mL. Adicione 200 µ l de tampão de purificação (15% (p/v) 8.000 PEG, 5 mM Tris, 1 mM EDTA e 505 mM NaCl). Misture suavemente por inversão do tubo. Gire a amostra a 16.000 × g, à temperatura ambiente (r.t.) por 25 min. Descartar o sobrenadante cuidadosamente e resuspenda o pellet em buffer de 16 mM MgCl2 suplementado TB. Sobrenadante e a pelota contêm fibras descontínuas em excesso e origami de DNA precipitado, respectivamente. Incube a amostra para um dia de cada r.t. a 650 rpm em um thermomixer. Esta etapa é para ressuspensão completa de origami de DNA. 3. eletroforese em Gel de Agarose (idade) Adicione 1,6 g de agarose e 80 mL de tampão de x TAE 0,5 (20 mM Tris, 0.5 mM EDTA, ácido acético de 10 mM, pH 8) num copo de vidro para preparar um gel de agarose 2%. Microondas por 5 min. Agite o conteúdo do copo para 1 min em um banho de água. Adicione 352 μL de MgCl2 (2,5 M), para preparar o gel com 11 mM MgCl2. Pre-manche o gel com 10 µ l de mancha de gel de DNA. Despeje a solução de gel em uma caixa de gel seco e inserir um pente da electroforese do gel. Deixe a solução solidificar no r.t. por 15-30 min. Complementar o execução buffer (0,5 x tampão TAE) com 11 mM MgCl2. Misturar 10 a 20 µ l da amostra com 20% de 6x do tampão de carregamento (30% (v/v) glicerol, 0,25% (p/v) de bromofenol, 0,25% (p/v) xileno cianol FF) e carregá-lo em poços de gel de agarose. Funcione o gel em 70 V no r.t. para 2,5 – 3 h. Visualize o gel com um detector de UV. 4. negativo mancha microscopia eletrônica de transmissão (nsTEM) Aplica 5 µ l do nanostructure diluído ou o polyplex em uma grade de Cu400 TEM carbono revestido brilho-alta. Deixe absorver por ca. 1 min. Escorra o excesso de líquido da borda da grade por um pedaço de papel de filtro. Aplicar 5 µ l de solução aquosa de acetato de uranilo um 2% e aguardar 1 min. Use a borda do papel de filtro para drenar completamente o excesso de líquido da borda da grade. Deixe a grade secar completamente antes de injetá-lo na temperatura. 5. Polyplex formação Nota: Exemplo ilustrativo para a preparação de um polyplex compreendendo origami de DNA e quitosana em rácios N/P 0,01-8. Calcule o número de aminas por polycation usando a fórmula-1 (tabela 1). Medir a concentração de origami de DNA purificado utilizando um espectrofotômetro ultra violeta em 260 nm. Use 2 µ l de tampão TB como o espaço em branco para calibrar o aparelho. Calcular o “nmol de fosfato” usando a fórmula-2. Prepare-se 15 µ l da estrutura ADN origami, incluindo 1 nmol de fosfato. Use a Fórmula-3 para calcular o volume de quitosana, que é necessário para preparar o polyplex no N/P 0,01-8. Por exemplo, para preparar o polyplex em 8 N/P, 1,8 µ l de quitosana (0,8 mg/mL) é necessária (N/P é 8, nmol de fosfato é 1, o peso molecular da quitosana é 5.000 g/mol, a concentração da solução-mãe de quitosana é 0,8 mg/mL e o número de aminas por quitosana é 28). Adicione 13,2 µ l de TB a 1,8 µ l de quitosana (0,8 mg/mL). Adicione 15 µ l de solução de quitosana (0,8 mg/mL) a 15 µ l do origami DNA da etapa 5.3 para obter um ADN origami-quitosana polyplex com 8 NP. O polyplex é formado espontaneamente. Repita o passo 5.4 para preparar os polyplexes em diferentes proporções de N/P. Execute uma idade conforme descrito no passo 3 (figura 1A). Inclua o origami de DNA nu como controle. Imagem o polyplex conforme descrito na etapa 4 (Figura 2).Fórmula-1) número de grupos amina por polycationFórmula-2) mol de fosfato=Fórmula-3) Volume (µ l) de polycations= 6. desencapsulamento com sulfato de dextrano Calcule o número de grupos sulfato por sulfato de dextrano, usando a fórmula-4 (tabela 2). Calcular o volume de sulfato de dextrano, necessário para a decomplexation do polyplex em um predefinidos A relação P usando fórmula-5. O A / P carga ratio é a proporção entre os grupos sulfato do polyanion (A) para os grupos fosfato (P) do origami DNA. Uma quantidade adicional de sulfato de dextrano é necessária para uma eficiente decomplexation dos polyplexes (por exemplo, 500-1.000). Por exemplo, para decomplex o polyplex preparado na secção 5 (polyplex contém 1 nmol de fosfato) na / P 1.000, 3,6 µ l de dextrano sulfato 40 kDa (50 mg/mL) é necessária (A / P é 1.000, nmol de fosfato é 1, o peso molecular do sulfato de dextrano é 40.000 g/mol a concentração da solução estoque de sulfato de dextrano é 50 mg/mL e número de sulfato 220). Adicionem o polyplex da etapa 5.4 3,6 µ l de sulfato de dextrano (50 mg/mL) e misture bem. Se trabalhar com uma quitosana polyplex, adicione NaOH para facilitar o processo de decomplexation. Adicione NaOH para uma concentração final de 10 mM. Ignore este passo para os polyplexes LPEI. Execute uma idade conforme descrito no passo 3 (figura 1B). Inclua um origami de DNA nu e polyplex como controle.Fórmula-4) número de grupos sulfato por polyanion =Fórmula-5) Volume (µ l) de sulfato de dextrano= 7. a estabilidade no sentido de depleção de Mg Lave 20 µ l de um origami de DNA ou o polyplex correspondente (incluindo 2 nmol fosfato) com 4 x 600 µ l de tampão de Mg-zero (5 mM Tris, EDTA de 1 mM e 30 mM de NaCl) usando a coluna de ultrafiltração (MWCO ~ 3 kDa). Gire a cada lavagem a 14.000 g × no r.t. para 3-5 min. Coletar o restante da solução (80 µ l) e incubar a 37 ° C por um dia a 650 rpm em um thermomixer. Se testes LPEI polyplex, adicione 2,5 μL de MgCl2 (500 mM) para uma concentração final de 16 mM MgCl2. Em seguida, adicione 7 µ l de dextrano sulfato-40 kDa (50 mg/mL) (equivalente a um / 1.000 P) para desvendar o núcleo DNA nanoestruturas (desencapsulamento, consulte a etapa 6).Nota: Ignore esta etapa se trabalhando com quitosana polyplex ou nu origami de DNA. Siga nsTEM imagem conforme descrito na etapa 3 (Figura 2). 8. DNase eu ensaio de titulação de nanoestruturas de Origami de DNA nua Tubos de DNase eu de buffer (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl2, 5mm CaCl2, pH 7,6), 1 µ l de MgCl2 (250 mM), 12 µ l de água em 0,2 mL PCR Mix 3 µ l de nu origami de DNA, incluindo 1 nmol fosfato com 2 µ l de 10x. Adicionar 2 µ l de DNase eu (10x). Ajustar a concentração das ações do DNase eu (10x) para chegar a final DNase concentrações de 0,25-2 U/mL. Incube as amostras a 37 ° C, durante 1-2 h em um thermocycler. Mergulhe as amostras no gelo e desativar a atividade de antípodas, adicionando 2 µ l de 500mm ditiotreitol (DTT) e 2,5 µ l de EGTA (33 milímetros). Analise as amostras usando uma idade conforme descrito na etapa 3. 9. estabilidade de Polyplexes para DNase eu Mix 4 µ l de uma polyplex (incluindo 1 nmol de fosfato, preparado em diferentes proporções de N/P) com 1,5 µ l de uma DNase eu tampão (10x), 8 µ l de TB e 1,5 µ l de DNase I (100 U/mL) em um 0,2 mL do PCR do tubo. Incube a amostra por 24 h a 37 ° C em um thermocycler. Adicione 2 µ l de proteinase K (20 mg/mL) para digerir o DNase I. incube durante 30 min a 37 ° C em um thermocycler.Nota: em vez de digestão enzimática, desativação química de DNase I por adicionando 1,5 μL de TDT (500 mM) e 2 µ l de EGTA (33 mM) podem ser executada. Adicione 3,6 µ l de dextrano sulfato-40 kDa (50 mg/mL) (equivalente a um / 1.000 P) para desvendar o núcleo nanoestruturas de DNA. Execute a idade conforme descrito na etapa 3 (Figura 3A, Figura 3). Inclua o origami de DNA fresco como controle para medir e comparar as intensidades de banda no gel. Impostos especiais de consumo da banda sobre a idade e o origami de DNA por um aperto congelar a coluna de extração baseada no protocolo fornecido pelo fornecedor de extrato. Siga nsTEM imagem conforme descrito na etapa 4 (Figura 2). 10. estabilidade no sentido de soro Fetal bovino (FBS) Tubos de FBS em 0,2 mL PCR Mix 4 µ l de origami de DNA nu ou seu correspondente polyplex (incluindo 1 nmol de fosfato) com 17 µ l de TB + 10%. Use FBS recém descongelado. Incube a amostra em 37 ˚ c em um termociclador por 24 h. Mergulhe a amostra em banho de gelo. Se testando o polyplex, execute o processo de desencapsulamento adicionando 3,6 µ l de dextrano sulfato-40 kDa (50 mg/mL). Além disso, adicionar NaOH se trabalhando com quitosana polyplexes (consulte a etapa 6.3) Execute uma idade conforme descrito na etapa 3. Inclua o origami de DNA fresco como controle para medir e comparar as intensidades de banda no gel. Impostos especiais de consumo da banda sobre a idade e extrair o origami de DNA por uma coluna de extração de congelamento de aperto. Adicione 2 µ l de proteinase K (20 mg/mL) para a extraído DNA origami solução (20 µ l) em um tubo PCR de 0,2 mL. Incube durante 30 min a 37 ° C em um thermocycler para digerir proteínas de soro ligadas para as nanoestruturas. Lavar a amostra com 5 x 500 µ l de TB, incluindo 16 mM MgCl2 usando a coluna de ultracentrifugação (MWCO ~ 100 kDa) para lavar proteinase K (MW ~ kDa 28,9) afastado. Gire a cada lavagem a 14.000 g × no r.t. para 3-5 min. Execute nsTEM imagem como descrito na etapa 4 (Figura 3).Nota: A amostra extraída de gel da etapa 10.6 pode ser usada diretamente para a imagem latente de nsTEM. No entanto, a imagem pode ser muito desafiador devido a ligação de proteínas de soro para as ADN origami nanoestruturas. Portanto, recomenda-se tratamento de proteinase K (etapas 10,7-10,9), para facilitar o processo de geração de imagens. 11. testando a capacidade de endereçamento da enzima Peroxidase de rábano (HRP)-acrescida de DNA Origami com revestimento com Polycations Purifica o Self montado biotinilado-NR (biotina-NR) conforme descrito na etapa 2. Incubar a 200 µ l de biotina-NR purificado (36 nM, em 16mm suplementado tampão TB) com 200 µ l de conjugado HRP streptavidin (540 nM, em buffer TB). Adicione 4,8 µ l de MgCl2 (500 mM) para uma concentração final de 14 mM. Incubar a r.t. para 12 h a 650 rpm em um thermomixer Purifica HRP-acrescida NR (HRP-NR) por um método de purificação de PEG (conforme descrito na etapa 2) para remover as enzimas HRP desacopladas. Ressuspender o precipitado HRP-NR em TB, incluindo 16 mM MgCl2. µ L 6.5 mix de HRP-NR purificado (36 nM) com 6,5 µ l de polycations das concentrações variantes para preparar o polyplex em rácios de N/P de 1, 2, 4, 10 e 20 (usando a Fórmula 3). Repita as etapas 11.2-11,4 para não-biotinilado NR. Como a enzima HRP pode bind não especìfica para o origami de DNA, o origami de DNA não-biotinilado, que é tratada com enzimas HRP e PEG purificado (semelhante a biotina-NR), servirá como o controle no ensaio. Mix de 6,5 µ l de água destilada com 6,5 µ l de polycations de variantes concentrações correspondentes para os rácios definidos de N/P de 1, 2, 4, 10 e 20. Amostras de teses servem como o grupo em branco. Adicionar a solução preparada em etapas 11.4-11,6 (12,5 µ l) de uma placa de 96 poços, incluindo 72.5 µ l de tampão HEPES (25mm HEPES, 20 mM KCl, NaCl, de 200 mM 0,05% pH de Triton X-100, 1% DMSO, 7,4) e misture bem. Adicione 10 µ l de 2, 2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS) (15 mM). Adicione 5 µ l de H2O2 (12 mM) e misture bem pipetando para cima e para baixo. H2O2 inicia a reação. Medir a absorvância a 421 nm mais 4 h com um leitor de placa multimodo (Figura 4A). 12. teste a capacidade de endereçamento de Aptamers de ligação de hemina (HBA)-acrescida de DNA Origami com revestimento com Polycations Purifica o HBA acrescida-NR (HBA-NR) conforme descrito na etapa 2. Ressuspender o precipitado HBA-NR em TB suplementado com 6 mM MgCl2 (maior concentração de sal leva para a agregação de HBA-NR). Mix 10 µ l de HBA-NR (40 nM) com 10 µ l de polycations, na concentração variando de preparar polyplex dos rácios definidos de N/P de 1, 2, 10 e 20. Mix 10 µ l de nu-NR (40 nM) ou água destilada com 10 µ l de polycations em diferentes concentrações correspondentes a rácios N/P de 1, 2, 10 e 20. Adicionar a solução de 20 µ l preparado de passos 12.2 e 12.3 à placa de 96 poços, incluindo 60 µ l de tampão HEPES (25mm HEPES, 20 mM KCl, NaCl, de 200 mM 0,05% pH de Triton X-100, 1% DMSO, 7,4) e misture bem. Incluem pelo menos uma amostra em branco, substituindo a solução de 20 µ l polyplex ou polycation (a partir de etapas 12.2 e 12.3) com água. Adicione 5 µ l de hemina (0,04 mM) seguido de 10 µ l de ATBS (15 mM). Coloque a placa em um agitador orbital por 5 min. Adicione 5 µ l de H2O2 (12 mM) e misture bem pipetando para cima e para baixo. Medir a absorvância a 421 nmover 30 min com o leitor multimodo (Figura 4B).