Gentherapie geïnspireerd Polycation Coating voor bescherming van DNA Origami nanostructuren

1. voorbereiding Polycation Stock oplossing LPEI-stockoplossing Voeg 10 mg LPEI in een glas bekerglas met < 10 mL H2O. Toevoegen als u wilt volledig los LPEI, HCl (32%) tot het bereiken van de pH 2.0. Breng de pH op 7.0 door toevoeging van NaOH (10 M). Stel het volume aan de uiteindelijke concentratie van 1 mg/mL. Het filtraat van de stockoplossing van de LPEI door een 0,22 µm-membraan. Chitosan-stockoplossing Los 16.6 mg chitosan oligosaccharide lactaat (Mw ~ 5 kDa, 60% oligosaccharide compositie, deacetylated uit chitine met 90%) in 1 mL azijnzuur (10%) waterige media ter voorbereiding van een stamoplossing waarvan de concentratie van 10 mg/mL. 2. de zuivering van DNA Origami nanostructuren Mix 100 µL van het DNA origami monster (in 5 mM Tris, 1 mM EDTA, 5 mM NaCl buffer (aangeduid als TB) met inbegrip van 18 mM MgCl2) met de gelijkwaardige hoeveelheid 22 mM MgCl aangevuld2 TB (100 µL) in een 1,5 mL-buis. Voeg 200 µL van zuivering buffer (15% (m/v) PEG 8000, van 5 mM Tris, 1 mM EDTA en 505 mM NaCl). Meng zachtjes door inversie van de buis. Draai het monster bij 16.000 × g bij kamertemperatuur (Toby) gedurende 25 minuten. Verwijder voorzichtig het supernatant en resuspendeer de pellet in 16 mM MgCl2 aangevuld TB buffer. De bovendrijvende vloeistof en de pellet bevatten overtollige nietje strengen en geprecipiteerde DNA origami, respectievelijk. Incubeer het monster gedurende één dag op Toby op 650 rpm in een thermomixer. Deze stap is voor volledige resuspensie van DNA origami. 3. Agarose Gel elektroforese (leeftijd) Voeg 1,6 g agarose en 80 mL 0,5 x TAE buffer (20 mM Tris, 0.5 mM EDTA, 10 mM azijnzuur, pH 8) in een bekerglas van glas ter voorbereiding van een 2% agarose gel. Magnetron voor 5 min. Swirl de inhoud van het bekerglas voor 1 min in een waterbad. Voeg 352 µL van MgCl2 (2,5 M) ter voorbereiding van het gel met 11 mM MgCl2. Vooraf vlek de gel met 10 µL van DNA gel vlek. Giet de gel-oplossing in een droge gel-doos en invoegen van een kam van de Elektroforese van het gel. Laat de oplossing stollen bij Toby voor 15-30 min. Een aanvulling op de lopende buffer (0.5 x TAE-buffer) met 11 mM MgCl2. Meng 10-20 µL van het monster met 20% van 6 x laden buffer (0,25% (m/v) bromophenol blauw, 30% (v/v) glycerol, 0,25% (m/v) xyleen cyanol FF) en laadt u deze in de agarose gel putten. Stel de gel bij 70 V op Toby voor 2,5 – 3 h. Visualiseer de gel met een UV-scanner. 4. negatieve vlek transmissie-elektronenmicroscopie (nsTEM) Breng 5 µL van de verdunde nanostructuur of de polyplex op een gloed-geloosd koolstof beklede Cu400 TEM grid. Laat het adsorberen voor ca. 1 min. Afvoer overtollige vocht vanaf de rand van het raster door een stuk filtreerpapier. Breng 5 µL van een waterige oplossing van 2% uranyl acetaat en 1 min wachten. Hiermee kunt u dat de rand filtreerpapier volledig afvoer overtollige vocht vanaf de rand van het raster. Laat het volledig drogen voor het injecteren in de TEM raster. 5. Polyplex vorming Opmerking: Illustratieve voorbeeld voor het voorbereiden van een polyplex bestaande uit DNA origami en chitosan op 0,01-8 N/P ratio’s. Bereken het aantal aminen per polycation met behulp van de Formule-1 (tabel 1). Meten van de concentratie van gezuiverde DNA origami met behulp van een ultra violet spectrofotometer op 260 nm. Gebruik 2 µL van TB buffer als de blanco kalibreren van de machine. De “nmol van fosfaat” berekenen met behulp van Formule-2. Bereiden 15 µL van de DNA-structuur origami inclusief 1 nmol van fosfaat. Formule-3 gebruiken voor het berekenen van het volume van de chitosan, die nodig is voor de voorbereiding van de polyplex bij N/P 0.01-8. Bijvoorbeeld, ter voorbereiding van de polyplex op N/P 8, 1.8 µL van chitosan (0,8 mg/mL) nodig is (N/P is 8, nmol van fosfaat is 1, molecuulgewicht van chitosan is 5000 g/mol, concentratie van de stockoplossing van chitosan is 0,8 mg/mL en het aantal aminen per chitosan is 28). 13.2 µL van TB aan 1.8 µL van chitosan (0,8 mg/mL) toevoegen. 15 µL van chitosan oplossing (0,8 mg/mL) tot 15 µL van de DNA-origami uit stap 5.3 te krijgen een DNA origami-chitosan polyplex met NP 8 toevoegen. De polyplex wordt spontaan gevormd. Herhaal stap 5.4 ter voorbereiding van de polyplexes op verschillende N/P ratio’s. Voert een leeftijd, zoals beschreven in stap 3 (figuur 1A). Omvatten de naakte DNA origami als controle. Het imago van de polyplex zoals beschreven in stap 4 (Figuur 2).Formule-1) aantal amine groepen per polycationFormule-2) mol van fosfaat=Formule-3) Hoeveelheid (µL) polycations= 6. uitpakken met Dextran (II) sulfaat Bereken het aantal sulfaat groepen per dextran (II) sulfaat met behulp van formule-4 (tabel 2). Berekenen van het volume van dextran sulfaat die nodig zijn voor de decomplexation van de polyplex op een vooraf gedefinieerde A / P-verhouding met behulp van formule-5. De A / P charge ratio is de verhouding tussen het sulfaat-groepen van de polyanion (A) tot de groepen van de fosfaat (P) van de DNA-origami. Een overtollige hoeveelheid dextran (II) sulfaat is nodig voor een efficiënte decomplexation van de polyplexes (bijvoorbeeld 500-1000). Bijvoorbeeld, decomplex de polyplex bereid in sectie 5 (polyplex bevat 1 nmol van fosfaat) bij A / P 1000, 3.6 µL van dextran sulfaat 40 kDa (50 mg/mL) nodig is (A / P is 1.000 nmol van fosfaat is 1, het molecuulgewicht van dextran (II) sulfaat is 40.000 g/mol de concentratie van de stockoplossing van dextran (II) sulfaat 50 mg/mL en aantal sulfaat is 220). 3.6 µL dextran-sulfaat (50 mg/mL) toevoegen aan de polyplex uit stap 5.4 en meng goed. Als u werkt met een chitosan polyplex, toevoegen NaOH om het decomplexation-proces te vergemakkelijken. NaOH toevoegen voor een eindconcentratie van 10 mM. Sla deze stap voor LPEI polyplexes. Voert een leeftijd, zoals beschreven in stap 3 (figuur 1B). Omvatten een naakte DNA origami en polyplex als controle.Formule-4) aantal sulfaat groepen per polyanion =Formule-5) Hoeveelheid (µL) dextran (II) sulfaat= 7. stabiliteit naar Mg uitputting Wassen van 20 µL van een DNA-origami of de bijbehorende polyplex (inclusief 2 nmol fosfaat) met 4 x 600 µL van Mg-nul buffer (5 mM Tris, 1 mM EDTA en 30 mM NaCl) met behulp van de ultrafiltratie kolom (MWCO ~ 3 kDa). Draai elke wassen bij 14.000 × g bij Toby voor 3-5 min. Verzamelen van de resterende oplossing (80 µL) en Incubeer bij 37 ° C gedurende één dag op 650 rpm in een thermomixer. Als testen LPEI polyplex, 2.5 µL van MgCl2 (500 mM) voor een eindconcentratie van 16 mM MgCl2toevoegen. Voeg vervolgens 7 µL van dextran (II) sulfaat-40 kDa (50 mg/mL) (gelijk aan A / P 1000) te ontrafelen van de kern DNA nanostructuren (uitpakken, zie stap 6).Opmerking: Deze stap overslaan als werken met chitosan polyplex of naakte DNA origami. Volg nsTEM imaging zoals beschreven in stap 3 (Figuur 2). 8. DNase ik titratie Assay van naakte DNA Origami nanostructuren Mix 3 µL van naakte DNA origami inclusief 1 nmol fosfaat met 2 µL van 10 x DNase ik buffer (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl2, 5 mM CaCl2, pH 7,6), 1 µL van MgCl2 (250 mM), 12 µL van het water in 0,2 mL PCR buizen. Voeg 2 µL van DNase ik (10 x). Pas de voorraad van de DNase ik (10 x) om de laatste DNase ik concentraties van 0,25-2 U/mL. Incubeer bij 37 ° C gedurende 1-2 uur in een thermocycler monsters. Onderdompelen van de monsters in ijs en deactiveren van de nucleolytic-activiteit door toevoeging van 2 µL van 500 mM dithiothreitol (DTT) en 2,5 µL van EGTA (33 mM). Analyseer de monsters met een leeftijd, zoals beschreven in stap 3. 9. stabiliteit van Polyplexes naar DNase ik Mix 4 µL van een polyplex (inclusief 1 nmol van fosfaten, bereid op verschillende N/P ratio’s) met 1.5 µL van een DNase ik buffer (10 x), 8 µL van TB en 1,5 µL van DNase ik (100 U/mL) in een 0,2 mL PCR buis. Incubeer het monster gedurende 24 uur bij 37 ° C in een thermocycler. Voeg 2 µL van proteïnase K (20 mg/mL) te verteren de DNase I. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C in een thermocycler.Opmerking: in plaats van enzymatische spijsvertering, chemische deactivering van DNase ik door toe te voegen 1.5 µL van DTT (500 mM) en 2 µL van EGTA (33 mM) kunnen worden uitgevoerd. Voeg 3.6 µL van dextran (II) sulfaat-40 kDa (50 mg/mL) (gelijk aan A / P 1000) te ontrafelen van de kern DNA nanostructuren. Voert leeftijd, zoals beschreven in stap 3 (figuur 3A, Figuur 3 c). Verse DNA origami als controle voor het meten en vergelijken van de intensiteiten van de band op de gel bevatten. Accijnzen de band op de leeftijd en het uittreksel van de DNA-origami door een squeeze bevriezen extractie kolom op basis van het protocol door de leverancier verstrekt. Volg nsTEM imaging zoals beschreven in stap 4 (Figuur 2). 10. stabiliteit naar foetale runderserum (FBS) Mix 4 µL van naakte DNA origami of haar overeenkomstige polyplex (inclusief 1 nmol van fosfaat) met 17 µL van TB + 10% FBS in 0,2 mL PCR buizen. Gebruik vers ontdooid FBS. Incubeer het monster bij 37 ˚C in een thermische cycler gedurende 24 uur. Dompel het monster in een ijsbad. Als testen de polyplex, voert u het proces van het uitpakken van gegevenspakketten verstaan door 3.6 µL van dextran (II) sulfaat-40 kDa (50 mg/mL) toe te voegen. Bovendien, het toevoegen van NaOH als werken met polyplexes van de chitosan (zie stap 6.3) Voert een leeftijd, zoals beschreven in stap 3. Omvatten de nieuwe DNA-origami als controle voor het meten en vergelijken van de intensiteiten van de band op de gel. Accijnzen van de band op de leeftijd en de DNA-origami extract door een squeeze bevriezen extractie kolom. Voeg 2 µL van proteïnase K (20 mg/mL) toe aan de geëxtraheerde DNA origami oplossing (20 µL) in een tube van 0,2 mL PCR. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C in een thermocycler te verteren serum eiwitten gebonden aan de nanostructuren. Wassen van het monster met 5 x 500 µL van TB met inbegrip van 16 mM MgCl2 met behulp van de kolom ultracentrifugatie (MWCO ~ 100 kDa) te wassen proteïnase K (MW ~ 28.9 kDa) weg. Draai elke wassen bij 14.000 × g bij Toby voor 3-5 min. Uitvoeren van nsTEM imaging zoals beschreven in stap 4 (Figuur 3).Opmerking: De gel uitgepakte monster uit stap 10.6 kan direct gebruikt worden voor nsTEM imaging. De beeldvorming kan echter zeer uitdagend vanwege de gehechtheid van serum eiwitten aan het DNA origami nanostructuren. Proteïnase K behandeling (stappen 10,7-10.9) wordt daarom aanbevolen om de beeldvorming proces te vergemakkelijken. 11. het testen van de serverprocessor van Horseradish Peroxidase enzym (HRP)-matiemaatschappij DNA Origami op Coating met Polycations Zuiveren de zelf samengestelde biotinyleerd-NR (Biotine-NR) zoals beschreven in stap 2. Incubeer 200 µL van gezuiverde Biotine-NR (36 nM, in 16 mM aangevuld TB buffer) met 200 µL van HRP-geconjugeerde streptavidine (540 nM, in TB buffer). 4.8 µL van MgCl2 (500 mM) toevoegen om een eindconcentratie van 14 mM. Incubeer bij Toby voor 12u op 650 rpm in een thermomixer HRP-matiemaatschappij NR (HRP-NR) door een PEG zuivering methode zuiveren (zoals beschreven in stap 2) als u wilt verwijderen van de niet-afhankelijke HRP-enzymen. Resuspendeer de geprecipiteerde HRP-NR in TB met inbegrip van 16 mM MgCl2. Mix-6.5 µL van gezuiverde HRP-NR (36 nM) met 6.5 µL van polycations van variant concentraties te bereiden de polyplex op N/P ratio’s van 1, 2, 4, 10 en 20 (gebruik Formule 3). Herhaal stap 11.2-11,4 voor niet-biotinyleerd NR. Zoals het enzym HRP kan binden niet-specifiek aan de DNA-origami, de niet-biotinyleerd DNA origami, die wordt behandeld met HRP enzymen en PEG gezuiverd (vergelijkbaar met biotine-NR), zal dienen als het besturingselement in de test. Mix-6.5 µL van gedistilleerd-water met 6.5 µL van polycations van variant concentratie overeenstemt met de gedefinieerde N/P ratio’s van 1, 2, 4, 10 en 20. Scripties monsters dienen als de lege groep. De bereide oplossing in stappen 11.4-11,6 (12,5 µL) toevoegen aan een 96-wells-plaat met inbegrip van 72,5 µL van HEPES-buffer (25 mM HEPES, 20 mM 200 mM NaCl, KCl, 0.05% Triton X-100, 1% DMSO, pH 7.4) en meng goed. Voeg 10 µL van 2, 2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS) (15 mM). Voeg 5 µL van H2O2 (12 mM) en meng goed door pipetteren omhoog en omlaag. H2O2 initieert de reactie. Meet de extinctie op 421 nm meer dan 4 uur met een multimode-afleesapparaat (figuur 4A). 12. het testen van de serverprocessor van Hemine-bindende Aptamers (HBA)-matiemaatschappij DNA Origami op Coating met Polycations Zuiveren de HBA matiemaatschappij-NR (HBA-NR) zoals beschreven in stap 2. Resuspendeer de geprecipiteerde HBA-NR in TB aangevuld met 6 mM MgCl2 (hogere zoute concentratie leidt tot de samentelling van HBA-NR). Mix 10 µL van HBA-NR (40 nM) met 10 µL van polycations met verschillende concentratie te bereiden polyplex van gedefinieerde N/P ratio’s van 1, 2, 10 en 20. Mix 10 µL van naakte-NR (40 nM) of gedistilleerd water met 10 µL van polycations in uiteenlopendeconcentratiesverkrijgbaar overeenkomt met N/P ratio’s van 1, 2, 10 en 20. De oplossing van 20 µL bereid uit stappen 12.2 en 12.3 toevoegen aan de 96-wells-plaat met inbegrip van 60 µL van HEPES-buffer (25 mM HEPES, 20 mM 200 mM NaCl, KCl, 0.05% Triton X-100, 1% DMSO, pH 7.4) en meng goed. Omvatten ten minste één blancomonster ter vervanging van de 20 µL polyplex of polycation oplossing (van stappen 12.2 en 12.3) met water. Voeg 5 µL van Hemine (0,04 mM) gevolgd door 10 µL van ATBS (15 mM). Plaats de plaat op een roteerschudapparaat gedurende 5 minuten. Voeg 5 µL van H2O2 (12 mM) en meng goed door pipetteren omhoog en omlaag. Meet de extinctie op 421 nmover 30 min met de multimode-afleesapparaat (figuur 4B).