ריפוי גנטי בהשראת Polycation ציפוי הגנה על ה-DNA אוריגמי Nanostructures

1. הכנת פתרון Polycation מניות פתרון מניות LPEI להוסיף 10 מ ג של LPEI לתוך גביע זכוכית המכיל < 10 מ"ל של H2O. ימס לגמרי LPEI, להוסיף HCl (32%) עד הגיעו pH 2.0. להתאים את ה-pH אל 7.0 באמצעות הוספת NaOH (10 מ’). לכוון את עוצמת הקול כדי הריכוז הסופי של 1 מ”ג/מ”ל. Filtrate הפתרון מניות LPEI דרך קרום 0.22 מיקרומטר. פתרון מניות משקם להמיס 16.6 מ ג של לקטט פחמימה # מיון הפחמימות משקם (Mw ~ 5 kDa, הרכב פחמימה # מיון הפחמימות 60%, deacetylated מן כיטין על ידי 90%) ב 1 מ”ל של חומצה אצטית (10%) מדיה מימית כדי להכין פתרון מניות עם ריכוז של 10 מ”ג/מ”ל. 2. טיהור של ה-DNA אוריגמי Nanostructures מיקס 100 µL של אוריגמי לדנ (5 מ מ טריס, EDTA 1 מ”מ, 5 מ”מ NaCl מאגר (מסומן בתור טרה-בתים) כולל 18 מ מ MgCl2) עם נפח 22 מ”מ MgCl המקביל בתוספת2 טרה-בתים (100 µL) צינור 1.5 מ ל. להוסיף 200 µL טיהור מאגר (15% (w/v) פג 8,000, 5 מ מ טריס, 1 מ”מ EDTA ו 505 מ”מ NaCl). מערבבים בעדינות על ידי צינור היפוך. ספין המדגם ב g × 16,000 בטמפרטורת החדר (ר. ט) במשך 25 דקות. למחוק את תגובת שיקוע בזהירות, resuspend בגדר במאגר 16 מ מ TB2 בתוספת MgCl. את תגובת שיקוע, בגדר מכילות רצועות הידוק עודף זירז DNA אוריגמי, בהתאמה. תקופת דגירה המדגם של יום אחד בכל מכשיר הקשר-650 סל ד ב thermomixer. השלב זה עבור resuspension מלאה של ה-DNA אוריגמי. 3. Agarose בג’ל (גיל) להוסיף 1.6 גרם של agarose ו- 80 מ ל מאגר x TAE 0.5 (20 מ מ טריס, 0.5 מ מ EDTA, חומצה אצטית 10 מ מ, pH 8) לתוך גביע זכוכית להכנת ג’ל agarose 2%. מיקרוגל עבור 5 דק מערבולת בתוכן הספל עבור 1 דקות באמבט מים. הוסף µL 352 של MgCl2 (2.5 מטר) כדי להכין את הג’ל עם 11 מ”מ MgCl2. מראש מכתים את הג’ל עם µL 10 של ה-DNA ג’ל כתם. יוצקים את הפתרון ג’ל לתוך קופסת ג’ל יבשים ולהוסיף מסרק ג’ל אלקטרופורזה. תן את הפתרון לחזק את מכשיר הקשר למשך 15-30 דקות. תוספת למאגר פועל (0.5 x מאגר טה) עם 11 מ”מ MgCl2. לערבב 10-20 µL של המדגם עם 20% 6 x טעינת מאגר (30% (v/v) גליצרול, 0.25% (w/v) bromophenol כחול, 0.25% (w/v) קסילן cyanol FF), ירגישו כמו הבארות ג’ל agarose. להפעיל את הג’ל 70 V-מכשיר הקשר עבור 2.5 – 3 שעות. דמיינו את הג’ל עם סורק UV. 4. שלילי במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים הכתם (nsTEM) החל µL 5 של ננו-מבנה מדולל או את polyplex על זוהר-שוחרר מצופים פחמן Cu400 TEM רשת. תן לו לספוח עבור ca. 1 דקות. ניקוז עודפי נוזלים מן הקצה של הרשת ע י חתיכת נייר סינון. החל µL 5 של תמיסה מימית uranyl אצטט 2% ולחכות 1 דקות. משתמש הקצה נייר סינון כדי לרוקן לחלוטין את עודפי נוזלים מן הקצה של הרשת. תיתן הרשת להתייבש לגמרי לפני הזרקת זה לתוך TEM. 5. Polyplex צורה הערה: דוגמה להמחשה להכנת polyplex כגון ה-DNA אוריגמי, משקם ב- N/P 0.01-8 יחסי. לחשב את מספר אמינים לכל polycation באמצעות הנוסחה-1 (טבלה 1). למדוד את ריכוז מטוהרים אוריגמי הדנ א באמצעות ספקטרופוטומטרים אולטרה ויולט ב-260 ננומטר. להשתמש µL 2 טרה-בתים המאגר הריק כדי לכייל את המכונה. לחשב את “nmol של פוספט” באמצעות נוסחה-2. להכין µL 15 של מבנה ה-DNA אוריגמי כולל nmol 1 של פוספט. השתמש 3 נוסחה לחישוב הנפח של משקם, אשר נדרש עבור הכנת את polyplex ב- N/P 0.01-8. לדוגמה, כדי להכין את polyplex-N/P 8, µL 1.8 של משקם (0.8 מ”ג/מ”ל) יש צורך (N/P הוא 8 nmol של פוספט הוא 1, המשקל המולקולרי של משקם הוא 5000 g/mol, ריכוז של פתרון מניות משקם 0.8 מ”ג/מ”ל, המספר של אמינים לכל משקם הוא 28). להוסיף µL 13.2 משחפת µL 1.8 של משקם (0.8 מ”ג/מ”ל). להוסיף 15 µL של פתרון משקם (0.8 מ”ג/מ”ל) 15 µL של ה-DNA אוריגמי משלב 5.3 כדי לקבל polyplex אוריגמי-משקם של ה-DNA עם NP 8. Polyplex נוצר באופן ספונטני. חזור על שלב 5.4 להכין polyplexes-יחסים N/P שונים. מבצע עידן כמתואר בשלב 3 (איור 1 א’). לכלול את אוריגמי הדי ערומה כמו שליטה. תמונה של polyplex כפי שמתואר בשלב 4 (איור 2).נוסחה-1) מספר קבוצות אמין לכל polycationנוסחה-2) השומה של פוספט=נוסחה-3) נפח (µL) polycations= 6. decapsulation עם לתוספי סולפט לחשב את מספר קבוצות sulphate לכל לתוספי סולפט באמצעות נוסחה-4 (טבלה 2). חישוב הנפח של סולפט לתוספי צורך את decomplexation של polyplex-מראש A / P יחס באמצעות נוסחה-5. A / P לחייב יחס הוא היחס בין קבוצות סולפט polyanion (א) לקבוצות פוספט (P) של ה-DNA אוריגמי. כמות עודפת של סולפט לתוספי יש צורך של decomplexation יעיל של polyplexes (לדוגמה: 500-1, 000). לדוגמה, כדי decomplex את polyplex המוכנים בסעיף 5 (polyplex מכיל nmol 1 של פוספט)-A / P 1000, µL 3.6 של לתוספי סולפט 40 kDa (50 מ”ג/מ”ל) יש צורך (A / P הוא 1000, nmol של פוספט הוא 1, המשקל המולקולרי של לתוספי סולפט הוא 40,000 גר’/מול הריכוז של לתוספי סולפט פתרון מניות הוא 50 מ”ג/מ”ל והוא מספר סולפט 220). להוסיף µL 3.6 של לתוספי סולפט (50 מ”ג/מ”ל) polyplex מהשלב 5.4 ומערבבים היטב. אם עובד עם polyplex משקם, להוסיף NaOH כדי להקל על התהליך decomplexation. להוסיף NaOH של ריכוז סופי של 10 מ מ. לדלג על שלב זה עבור LPEI polyplexes. מבצע עידן כמתואר בשלב 3 (איור 1B). כוללים עירום DNA אוריגמי polyplex הפקד.נוסחה-4) מספר קבוצות sulphate לכל polyanion =נוסחה-5) ףקיהב לתוספי סולפט (µL)= 7. יציבות כלפי דלדול מ ג לשטוף µL 20 של אוריגמי דנ א או את polyplex המתאים (כולל 2 nmol פוספט) עם µL 4 x 600 מ ג-אפס מאגר (5 מ מ טריס, 1 מ”מ EDTA ו- 30 מ מ NaCl) באמצעות העמודה אולטראפילטרציה (MWCO ~ 3 kDa). ספין כל כביסה ב g × 14,000-מכשיר הקשר למשך 3-5 דקות. לאסוף את הפתרון הנותרים (80 µL), דגירה ב 37 ° C ליום אחד-650 סל ד ב thermomixer. אם בדיקות LPEI polyplex, להוסיף 2.5 µL MgCl2 (500 מ מ) עבור ריכוז סופי של 16 מ מ MgCl2. לאחר מכן, הוסף µL 7 של לתוספי סולפט-40 kDa (50 מ”ג/מ”ל) (שווה ערך ל A / P 1000) לפענח את ליבת ה-DNA nanostructures (decapsulation, ראו שלב 6).הערה: לדלג על שלב זה אם עובד עם polyplex משקם או עירום DNA אוריגמי. בצע הדמיה nsTEM כפי שמתואר בשלב 3 (איור 2). 8. DNase אני טיטור וזמינותו של עירום DNA אוריגמי Nanostructures לערבב 3 µL של אוריגמי DNA עירום כולל פוספט nmol 1 עם 2 µL של 10 x DNase אני מאגר (100 מ מ טריס-HCl, 25 מ מ MgCl2, 5 מ מ CaCl2, pH 7.6), µL 1 MgCl2 (250 מ מ), µL 12 מים 0.2 מ ל PCR צינורות. להוסיף 2 µL של DNase אני (10 x). התאם את ריכוז DNase מניות אני (10 x) כדי לקבל DNase הסופית אני ריכוזים של 0.25-2 U/mL. דגירה בדגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1-2 h ב- thermocycler. לטבול את דגימות קרח ולבטל את הפעילות חד-תאית על-ידי הוספת 2 µL של 500 מ מ dithiothreitol (DTT) ו- 2.5 µL של EGTA (33 מ מ). לנתח את הדגימות באמצעות עידן כמתואר בשלב 3. 9. יציבות של Polyplexes לקראת DNase אני לערבב 4 µL של polyplex (כולל nmol 1 של פוספט, מוכן במלון יחסים N/P שונים) עם µL 1.5 של DNase לי מאגר (10 x), µL 8 של טרה-בתים ו- 1.5 µL של DNase אני (100 U/mL) ב- 0.2 מ ל PCR צינור. דגירה המדגם במשך 24 שעות ביממה ב- 37 מעלות צלזיוס thermocycler. להוסיף 2 µL של proteinase K (20 מ”ג/מ”ל) לעכל את DNase א תקופת דגירה של 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס thermocycler.הערה: במקום עיכול אנזימטי, כימי שחרור משרות של DNase אני על-ידי הוספת µL 1.5 של DTT (500 מ מ) 2 µL של EGTA (33 מ מ) יכול להתבצע. להוסיף µL 3.6 של לתוספי סולפט-40 kDa (50 מ”ג/מ”ל) (שווה ערך ל A / P 1000) לפענח את ליבת ה-DNA nanostructures. לבצע גיל כמתואר בשלב 3 (3A איור, איור 3C). לכלול אוריגמי DNA טריים כמו שליטה על מדידה והשוואה בין עוצמות הלהקה על הג’ל. לסלק את הלהקה על גיל, תמצית אוריגמי DNA על-ידי לחיצה להקפיא עמודה החילוץ בהתבסס על פרוטוקול שסופקו על-ידי הספק. בצע הדמיה nsTEM כפי שמתואר בשלב 4 (איור 2). 10. יציבות כלפי העובר סרום שור (FBS) לערבב 4 µL של עירום DNA אוריגמי או שלה polyplex המקביל (כולל nmol 1 של פוספט) עם µL 17 של טרה-בתים + 10% FBS ב 0.2 מ ל PCR צינורות. השתמש FBS המופשרים טרי. דגירה המדגם-37 הלעפה תרוטרפמט ב הצנטרפוגה תרמי במשך 24 שעות ביממה. לטבול את הדגימה באמבט קרח. אם בודקים את polyplex, לבצע את התהליך decapsulation על-ידי הוספת µL 3.6 של לתוספי סולפט-40 kDa (50 מ”ג/מ”ל). בנוסף, להוסיף NaOH אם עובד עם polyplexes משקם (ראה שלב 6.3) מבצע עידן כמתואר בשלב 3. לכלול את אוריגמי DNA טריים כמו שליטה על מדידה והשוואה בין עוצמות הלהקה על הג’ל. לסלק את הלהקה על העידן ולחלץ את אוריגמי דנ א לפי עמודה החילוץ של ההקפאה לסחוט. להוסיף 2 µL של proteinase K (20 מ”ג/מ”ל) שחולצו DNA אוריגמי הפתרון (20 µL) צינור PCR 0.2 מ”ל. תקופת דגירה של 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס thermocycler כדי לעכל חלבונים בסרום חייב את nanostructures. לשטוף את הדגימה עם 5 x 500 µL של טרה-בתים כולל 16 מ מ MgCl2 באמצעות העמודה ultracentrifugation (MWCO ~ 100 kDa) לשטוף proteinase K (MW ~ 28.9 kDa) משם. ספין כל כביסה ב g × 14,000-מכשיר הקשר למשך 3-5 דקות. לבצע הדמיה nsTEM כפי שמתואר בשלב 4 (איור 3).הערה: המדגם שחולצו ג’ל מהשלב 10.6 עשויה ישירות לשמש עבור הדמיה nsTEM. אולם, ההדמיה יכולה להיות מאתגרת מאוד בשל הקובץ המצורף של חלבונים בסרום nanostructures אוריגמי הדנ א. לכן, טיפול proteinase K (שלבים 10.7-10.9) מומלץ להקל על תהליך ההדמיה. 11. בדיקה של מיעון של חזרת Peroxidase האנזים (HRP)-functionalized DNA אוריגמי עם ציפוי עם Polycations לטהר את עצמי שהורכב biotinylated-ע נ (ביוטין-NR) כפי שמתואר בשלב 2. דגירה µL 200 של ביוטין מטוהרים-NR (36 nM, ב- 16 מ”מ בתוספת מאגר טרה-בתים) עם 200 µL של streptavidin מצומדת HRP (540 nM, במאגר טרה-בתים). להוסיף 4.8 µL של MgCl2 (500 מ מ) ריכוז סופי של 14 מ מ. דגירה-ר. ט במשך 12 שעות ב- 650 סל ד ב thermomixer לטהר HRP-functionalized ע נ (HRP-NR) על ידי שיטת טיהור פג (כפי שמתואר בשלב 2) כדי להסיר את אנזימי HRP לא מאוגד. Resuspend את precipitated HRP-NR ב כולל 16 מ מ MgCl2טרה-בתים. µL 6.5 שילוב של מטוהרים HRP-ע נ (36 ננומטר) עם 6.5 µL של polycations של variant ריכוזים כדי להכין את polyplex ב- N/P יחס של 1, 2, 4, 10 ו- 20 (באמצעות נוסחה 3). חזור על הצעדים 11.2 11.4 NR הלא-biotinylated. כאשר האנזים HRP עלול להיקשר הלא ספציפית ל DNA אוריגמי, אוריגמי DNA שאינם biotinylated, אשר מטופלת עם אנזימי HRP ופג מטוהרים (בדומה ביוטין-NR), ישמש פקד וזמינותו. µL 6.5 תערובת של מים מזוקקים עם 6.5 µL של polycations של variant ריכוזים התואם יחס N/P מוגדר של 1, 2, 4, 10 ו- 20. תזות דגימות לשמש הקבוצה הריקה. להוסיף את הפתרון מוכן בשלבים 11.4-11.6 (12.5 µL) צלחת 96-ובכן כולל 72.5 µL HEPES מאגר (25 מ מ HEPES, 20 מ מ אשלגן כלורי, 200 מ”מ NaCl, 0.05% טריטון X-100, דימתיל סולפוקסיד 1%, pH 7.4) ומערבבים היטב. להוסיף 10 µL של 2, 2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS) (15 מ מ). מוסיפים 5 µL של2O H2 (12 מ”מ) ומערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה. H2O2 יוזם את התגובה. למדוד את ספיגת-421 nm מעל 4 שעות עם קורא כינוייהם צלחת (איור 4A). 12. בדיקה של מיעון של המין-איגוד Aptamers (HBA)-functionalized DNA אוריגמי עם ציפוי עם Polycations לטהר את HBA functionalized-ע נ (HBA-NR) כפי שמתואר בשלב 2. Resuspend HBA precipitated-ע נ ב TB בתוספת 6 מ מ MgCl2 (גבוה יותר ריכוז המלחים מוביל המצבור של HBA-NR). מיקס 10 µL של HBA-NR (40 ננומטר) עם 10 µL של polycations-ריכוז משתנות כדי להכין polyplex של מוגדר N/P יחס של 1, 2, 10 ו- 20. מיקס 10 µL של עירום-NR (40 ננומטר) או מים מזוקקים עם 10 µL של polycations בריכוזים שונים המתאימים N/P יחס של 1, 2, 10 ו- 20. הוסף את הפתרון µL 20 מוכן שלבים 12.2 ו- 12.3 לצלחת 96-ובכן כולל µL 60 HEPES מאגר (25 מ מ HEPES, 20 מ מ אשלגן כלורי, 200 מ”מ NaCl, 0.05% טריטון X-100, דימתיל סולפוקסיד 1%, pH 7.4) ומערבבים היטב. כוללים לדוגמה ריק אחד לפחות החלפת 20 µL polyplex או polycation הפתרון (מתוך שלבים 12.2 ו- 12.3) עם מים. להוסיף 5 µL של המין (0.04 מ מ) ואחריו 10 µL של ATBS (15 מ מ). מניחים את הצלחת על תפקודי לב / נשימה במשך 5 דקות. מוסיפים 5 µL של2O H2 (12 מ”מ) ומערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה. למדוד את ספיגת-421 nmover 30 דקות עם הקורא כינוייהם צלחת (איור 4B).