Terapia genica ispirato Polycation rivestimento per la protezione di nanostrutture di DNA Origami

1. preparazione di soluzione Stock Polycation Soluzione di riserva LPEI Aggiungere 10 mg di LPEI in un becher di vetro contenente < 10 mL di H2O. Per dissolvere completamente LPEI, aggiungere HCl (32%) fino a raggiungere pH 2.0. Regolare il pH a 7.0 con l’aggiunta di NaOH (10 M). Regolare il volume per la concentrazione finale di 1 mg/mL. Filtrare la soluzione di riserva di LPEI attraverso una membrana da 0,22 µm. Soluzione di riserva di chitosano Sciogliere 16,6 mg di lattato di chitosano oligosaccaride (Mw ~ 5 kDa, 60% oligosaccaride composizione, viene desacetilato agli acidi da chitina del 90%) in 1 mL di acido acetico (10%) mezzi acquosi per preparare una soluzione di riserva con una concentrazione di 10 mg/mL. 2. purificazione di nanostrutture di DNA Origami Mix 100 µ l del campione del DNA origami (in tampone di 5 mM Tris, 1 mM EDTA, 5 mM NaCl (indicata come TB) tra cui 18 mM MgCl2) con il volume equivalente di 22 mM MgCl2 completato TB (100 µ l) in una provetta da 1,5 mL. Aggiungere 200 µ l di tampone di purificazione (15% (p/v) 8.000 PEG, 5 mM Tris, 1 mM EDTA e 505 mM NaCl). Mescolare delicatamente dall’inversione del tubo. Girare il campione a 16.000 × g a temperatura ambiente (r.t.) per 25 min. Scartare il surnatante con attenzione e risospendere il pellet in buffer di 16 mM MgCl2 completato TB. Il surnatante e il pellet contengono fili graffette in eccesso e precipitato DNA origami, rispettivamente. Incubare il campione per un giorno a t.a. a 650 giri/min in un thermomixer. Questo passaggio è per completa risospensione di origami di DNA. 3. elettroforesi su Gel di agarosio al (età) Aggiungere 1,6 g di agarosio e 80 mL di buffer di x TAE 0,5 (20 mM Tris, 0,5 mM EDTA, acido acetico 10 mM, pH 8) in un becher di vetro per preparare un gel di agarosio al 2%. Forno a microonde per 5 min, agitare il contenuto del becher per 1 min in un bagno d’acqua. µ L 352 di MgCl2 (2,5 M) per preparare il gel con 11 mM MgCl2. Pre-macchia il gel con 10 µ l di macchia gel del DNA. Versare la soluzione di gel in una scatola di gel secco e inserire un pettine di elettroforesi del gel. Lasciare solidificare a t.a. per 15-30 min. Integrare il buffer in esecuzione (0,5 x tampone TAE) con 11 mM MgCl2. Miscelare 10-20 µ l del campione con 20% di 6 x tampone di caricamento (30% (v/v) glicerolo, blu di bromofenolo 0,25% (p/v), 0,25% (p/v) xilene cianolo FF) e caricarlo nei pozzetti del gel dell’agarosi. Esegua il gel a 70 V a t.a. per 2.5 – 3 h. Visualizzare il gel con uno scanner di UV. 4. negativo macchia microscopia elettronica di trasmissione (nsTEM) Applicare 5 µ l di nanostruttura diluita o il polyplex su una griglia di Scarica a bagliore di TEM Cu400 rivestita di carbonio. Lasciate assorbire per ca. 1 min. Scolare il liquido in eccesso dal bordo della griglia di un pezzo di carta da filtro. Applicare 5 µ l di soluzione acquosa dell’acetato di uranile 2% e attendere per 1 min. Utilizzare il bordo di carta da filtro per svuotare completamente il liquido in eccesso dal bordo della griglia. Lasciare asciugare completamente prima di iniettare il TEM la griglia. 5. Polyplex formazione Nota: Esempio illustrativo per la preparazione di un polyplex composto da DNA origami e chitosano a rapporti N/P 0.01-8. Calcolare il numero delle ammine a polycation utilizzando la formula-1 (tabella 1). Misurare la concentrazione di origami di DNA purificato utilizzando uno spettrofotometro ultra violetto a 260 nm. Utilizzare 2 µ l di tampone di TB come il vuoto per tarare la macchina. Calcolare il “nmol di fosfato” utilizzando la formula-2. Preparare 15 µ l della struttura di origami del DNA compreso 1 nmol di fosfato. Utilizzare formula-3 per calcolare il volume del chitosano, che è necessaria per preparare il polyplex presso N/P 0.01-8. Ad esempio, per preparare il polyplex a 8 N/P, è necessaria la 1,8 µ l del chitosano (0,8 mg/mL) (N/P è 8, nmol di fosfato è 1, peso molecolare di chitosano è 5.000 g/mol, concentrazione della soluzione di riserva di chitosano è 0,8 mg/mL e il numero delle ammine per chitosano è 28). Aggiungere 13,2 µ l di TB a 1,8 µ l di chitosano (0,8 mg/mL). Aggiungere 15 µ l di soluzione di chitosano (0,8 mg/mL) a 15 µ l di DNA origami dal punto 5.3 per ottenere un DNA origami-chitosano polyplex con NP 8. Il polyplex è formata spontaneamente. Ripetere il passaggio 5.4 per preparare polyplexes a diversi rapporti di N/P. Eseguire un’età come descritto nel passaggio 3 (Figura 1A). Includere l’origami di DNA nudo come controllo. Immagine il polyplex come descritto nel passaggio 4 (Figura 2).Formula-1) numero di gruppi amminici a polycationFormula-2) mole di fosfato=Formula-3) Volume (µ l) di policationi= 6. decapsulation con Destrano solfato Calcolare il numero di gruppi solfato al solfato di destrano utilizzando la formula-4 (tabella 2). Calcolare il volume di Destrano solfato necessario per il decomplexation di polyplex presso un predefiniti A / rapporto P utilizzando formula-5. L’A / P carica rapporto è il rapporto tra i gruppi di solfato di polyanion (A) per i gruppi fosfato (P) del origami del DNA. Una quantità eccedente di Destrano solfato è necessaria per un efficiente decomplexation della polyplexes (ad es. 500-1.000). Ad esempio, per decomplex il polyplex preparato nella sezione 5 (polyplex contiene 1 nmol di fosfato) presso A / P 1.000, 3,6 µ l di Destrano solfato 40 kDa (50 mg/mL) è necessario (A / P è 1.000, nmol di fosfato è 1, il peso molecolare del solfato di destrano è 40.000 g/mol la concentrazione della soluzione stock di Destrano solfato è 50 mg/mL e numero di solfato è 220). Aggiungere 3,6 µ l di solfato di destrano (50 mg/mL) per il polyplex dal punto 5.4 e mescolare bene. Se si lavora con un polyplex chitosano, aggiungere NaOH per facilitare il processo di decomplexation. Aggiungere NaOH per una concentrazione finale di 10 mM. Saltare questo passaggio per LPEI polyplexes. Eseguire un’età come descritto nel passaggio 3 (Figura 1B). Includere un origami di DNA nudo e polyplex come controllo.Formula-4) numero di gruppi solfato per polyanion =Formula-5) Volume (µ l) di solfato di destrano= 7. stabilità verso svuotamento di Mg Lavare 20 µ l di un origami di DNA o il corrispondente polyplex (tra cui 2 nmol fosfato) con 4 x 600 µ l di tampone di Mg da zero (5 mM Tris, 1 mM EDTA e 30 mM NaCl) utilizzando la colonna di ultrafiltrazione (MWCO ~ 3 kDa). Girare ogni lavaggio a 14.000 × g a r.t. per 3-5 min. Raccogliere la soluzione rimanente (80 µ l) e incubare a 37 ° C per un giorno a 650 giri/min in un thermomixer. Se il test LPEI polyplex, aggiungere 2,5 µ l di MgCl2 (500 mM) per una concentrazione finale di 16 mM MgCl2. Quindi, aggiungere 7 µ l di Destrano solfato-40 kDa (50 mg/mL) (equivalente alla A / P 1.000) per svelare il nucleo nanostrutture di DNA (decapsulamento, vedere passaggio 6).Nota: Ignorare questo passaggio se lavora con chitosano polyplex o origami di DNA nudo. Seguire nsTEM imaging come descritto nel passaggio 3 (Figura 2). 8. dnasi I test di titolazione di nanostrutture di DNA nudo Origami Mix 3 µ l di origami di DNA nudo compresa 1 nmol fosfato con 2 µ l di 10x dnasi buffer (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl2, 5mm CaCl2, pH 7.6), 1 µ l di MgCl2 (250 mM), 12 µ l di acqua a 0,2 mL PCR provette. Aggiungere 2 µ l di dnasi I (x 10). Regolare la concentrazione d’archivio La dnasi ho (x 10) per ottenere il finale dnasi concentrazioni di 0.25-2 U/mL. Incubare i campioni a 37 ° C per 1-2 h in un termociclatore. Immergere i campioni in ghiaccio e disattivare l’attività nucleolitico aggiungendo 2 µ l di 500 mM dithiothreitol (DTT) e 2,5 µ l di EGTA (33 mM). Analizzare i campioni utilizzando un’età come descritto nel passaggio 3. 9. stabilità di Polyplexes verso dnasi I Mix 4 µ l di una polyplex (tra cui 1 nmol di fosfato, preparato a diversi rapporti di N/P) con 1,5 µ l di una dnasi buffer (10x), 8 µ l di TB e 1,5 µ l di dnasi I (100 U/mL) a un 0,2 mL PCR tube. Incubare il campione per 24 h a 37 ° C in un termociclatore. Aggiungere 2 µ l di proteinasi K (20 mg/mL) per digerire la dnasi I. Incubare per 30 min a 37 ° C in un termociclatore.Nota: invece di digestione enzimatica, disattivazione chimica della dnasi I da aggiungendo 1,5 µ l di DTT (500 mM) e 2 µ l di EGTA (33 mM) posso essere eseguito. 3,6 µ l di Destrano solfato-40 kDa (50 mg/mL) (equivalente alla A / P 1.000) per svelare il nucleo nanostrutture di DNA. Eseguire età come descritto nel passaggio 3 (Figura 3A, Figura 3). Includono gli origami di DNA fresco come controllo per misurare e comparare le intensità di banda sul gel. Asportare la band l’età e l’Estratto di congelare l’origami di DNA da una compressione colonna di estrazione basata sul protocollo fornito dal fornitore. Seguire nsTEM imaging come descritto nel passaggio 4 (Figura 2). 10. stabilità verso siero bovino fetale (FBS) Mix 4 µ l di origami di DNA nudo o sua polyplex corrispondente (tra cui 1 nmol di fosfato) con 17 µ l di TB + 10% FBS in 0,2 mL PCR provette. Utilizzare FBS appena scongelati. Incubare il campione a 37 ˚ c in un termociclatore per 24 h. Immergere il campione in un bagno di ghiaccio. Se il test il polyplex, eseguire il processo di decapsulamento aggiungendo 3,6 µ l di Destrano solfato-40 kDa (50 mg/mL). Inoltre, è possibile aggiungere NaOH se lavora con chitosano polyplexes (Vedi punto 6.3) Eseguire un’età come descritto nel passaggio 3. Includere l’origami del DNA fresco come controllo per misurare e comparare le intensità di banda sul gel. Asportare la band sull’età e per estrarre l’origami di DNA da una colonna di estrazione del freeze di squeeze. Aggiungere 2 µ l di proteinasi K (20 mg/mL) per la soluzione di origami del DNA estratta (20 µ l) in una provetta PCR da 0,2 mL. Incubare per 30 min a 37 ° C in un termociclatore per digerire le proteine del siero associati a nanostrutture. Lavare il campione con 5 x 500 µ l di TB tra cui 16 mM MgCl2 utilizzando la colonna di ultracentrifugazione (MWCO ~ 100 kDa) per lavare proteinasi K (MW ~ 28,9 kDa) distanza. Girare ogni lavaggio a 14.000 × g a r.t. per 3-5 min. Eseguire nsTEM imaging come descritto nel passaggio 4 (Figura 3).Nota: Il campione di gel estratto dal passaggio 10.6 potrebbe essere direttamente usato per formazione immagine di nsTEM. Tuttavia, l’imaging potrebbe essere molto impegnativo per l’attaccamento delle proteine del siero per le nanostrutture di DNA origami. Pertanto, trattamento di proteinasi K (passaggi 10,7-10.9) è consigliato per facilitare il processo di imaging. 11. test l’indirizzabilità della perossidasi di rafano (HRP)-funzionalizzati DNA Origami su rivestimento con policationi Purificare l’auto-assemblato biotinylated-NR (biotina-NR) come descritto nel passaggio 2. Incubare 200 µ l di biotina-NR purificato (36 nM, in 16 mM integrato buffer di TB) con 200 µ l di coniugato HRP streptavidina (540 nM, nel buffer di TB). Aggiungere 4,8 µ l di MgCl2 (500 mM) ad una concentrazione finale di 14 mM. Incubare a r.t. per 12 h a 650 giri/min in un thermomixer Purificare il HRP-funzionalizzate NR (HRP-NR) di un metodo di purificazione di PEG (come descritto nel passaggio 2) per rimuovere gli enzimi HRP non associati. Risospendere il precipitato HRP-NR in TB tra cui 16 mM MgCl2. µ L di mix 6.5 di purificato HRP-NR (36 nM) con 6,5 µ l di policationi delle concentrazioni varianti per preparare la polyplex rapporti N/P 1, 2, 4, 10 e 20 (utilizzando la formula 3). Ripetere i passaggi da 11,2-11,4 per non-biotinylated NR. Poiché l’enzima HRP può legarsi non specifico per il DNA origami, l’origami di DNA di non-biotinylated, che viene trattato con enzimi HRP e PEG purificato (simile a biotina-NR), servirà come il controllo con il test. Mix 6.5 µ l di acqua distillata con 6,5 µ l di policationi della variante concentrazioni corrispondenti ai rapporti definiti N/P 1, 2, 4, 10 e 20. Esempi di tesi servono come il gruppo vuoto. Aggiungere la soluzione preparata nei passaggi 11.4-11,6 (12,5 µ l) di una piastra a 96 pozzetti inclusi 72,5 µ l di tampone HEPES (25mm HEPES, 20 mM KCl, 200 mM NaCl, pH di 0.05% Triton X-100, 1% DMSO, 7.4) e mescolare bene. Aggiungere 10 µ l di 2, 2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS) (15 mM). Aggiungere 5 µ l di H2O2 (12 mM) e miscelare bene pipettando su e giù. H2O2 avvia la reazione. Misurare l’assorbanza a 421 nm oltre 4 h con un lettore multimodale (Figura 4A). 12. prova l’indirizzabilità di Emina-associazione aptameri (HBA)-funzionalizzati DNA Origami su rivestimento con policationi Purificare l’HBA funzionalizzati-NR (HBA-NR) come descritto nel passaggio 2. Risospendere il precipitato HBA-NR in TB completati con 6 mM MgCl2 (maggiore concentrazione di sale conduce all’aggregazione di HBA-NR). Miscelare 10 µ l di HBA-NR (40 nM) con 10 µ l di policationi a varia concentrazione per preparare polyplex definiti rapporti N/P 1, 2, 10 e 20. Miscelare 10 µ l di nudo-NR (40 nM) o acqua distillata con 10 µ l di policationi alle concentrazioni variabili corrispondenti ai rapporti N/P 1, 2, 10 e 20. Aggiungere la soluzione di 20 µ l preparati da passaggi 12.2 e 12.3 alla piastra 96 pozzetti compreso 60 µ l di tampone HEPES (25mm HEPES, 20 mM KCl, 200 mM NaCl, pH di 0.05% Triton X-100, 1% DMSO, 7.4) e mescolare bene. Includere almeno un campione in bianco sostituendo i 20 µ l di soluzione di polyplex o polycation (da passaggi 12.2 e 12.3) con acqua. Aggiungere 5 µ l di Emina (0,04 mM) seguita da 10 µ l di Mirkotorre (15 mM). Collocare la piastra su un agitatore orbitale per 5 min. Aggiungere 5 µ l di H2O2 (12 mM) e miscelare bene pipettando su e giù. Misurare l’assorbanza a 421 nmover 30 min con il lettore di piastra multimodale (Figura 4B).