遺伝子療法ポリカチオン コーティングに影響を与えた DNA 折り紙ナノ構造体の保護

1. ポリカチオン在庫ソリューションを準備します。 LPEI 原液 LPEI に含まれるガラス ビーカー 10 mg を追加 < H2o ・ 10 mL LPEI を完全に溶解するには、まで達する pH 2.0 HCl (32%) を追加します。 7.0 に pH を調整するには、水酸化ナトリウム (10 M) を追加します。 最終濃度 1 mg/mL にボリュームを調整します。 0.22 μ m 膜を介して LPEI 原液をろ過します。 キトサン原液 キトサン ・ オリゴ糖・乳酸の 16.6 mg を溶解 (Mw ~ 5 kDa、60% オリゴ糖組成、90% のキチンからされたきちん) 1 mL の酢酸 (10%) 水溶液 10 Mg/ml の濃度のストック溶液を調製するのに。 2. DNA 折り紙ナノ構造体の浄化 ミックス 100 μ L の DNA 折り紙サンプル (5 mM、1 mM EDTA 5 mM NaCl トリスバッファー (TB として表されます) の 18 mM MgCl2を含む) 22 mM MgCl 換算した容積で2 TB を補完 (100 μ L) 1.5 mL チューブに。 浄化バッファー (15% (w/v) ペグ 8,000 5 mM トリス、1 mM EDTA と 505 mM NaCl) 200 μ L を追加します。管反転で優しく混ぜます。 室温 (r. t.) 25 分で 16,000 × g でサンプルをスピンします。 慎重に上澄みを廃棄し、16 mM MgCl2補足 TB バッファーでペレットを再懸濁します。上澄みとペレットは、それぞれ余分な短繊維と沈殿した DNA 折り紙を含まれています。 R. t.、thermomixer で 650 rpm で、1 日のサンプルをインキュベートします。この手順は、DNA 折り紙の完全な再懸濁のためです。 3. Agarose のゲルの電気泳動 (歳) 2% の agarose のゲルの準備にガラス ビーカーに 1.6 g アガロース、0.5 x TAE バッファー (20 mM トリス、0.5 mM 10 mM 酢酸 EDTA、pH 8) 80 mL を追加します。5 分間電子レンジは、水のお風呂で 1 分のビーカーの内容を旋回します。352 μ MgCl2 11 mm MgCl2ゲルを準備する (2.5 M) を追加します。DNA ゲル染色の 10 μ L をゲルを染色済み。 乾燥ゲル ボックスにゲル溶液を注ぐ、ゲルの電気泳動の櫛を挿入します。15-30 分の常温固化ソリューションをしましょう。 11 mm MgCl2実行バッファー (0.5 x TAE バッファー) を補足します。 読み込みバッファー (30% (v/v) グリセロール、0.25% (w/v) ブロモフェノールの青、0.25% (w/v) キシレンシアノール FF) x 6 の 20% で 10-20 μ L のサンプルをミックス、agarose のゲルの井戸に読み込みます。 70 V の 2.5 – 常温でゲルを実行 3 h。 UV スキャナーを持つゲルを視覚化します。 4 否定的な汚れの透過型電子顕微鏡 (nsTEM) グロー放電炭素コーティング Cu400 TEM グリッドに希薄化後のナノ構造や、polyplex の 5 μ L を適用します。Ca の吸着せて 1 分。 フィルター紙によるグリッドの端から余分な液体を排出します。 2% ウラニル酢酸水溶液の 5 μ L を適用し、1 分待ちます。 完全にグリッドの端から余分な液体を排出するのにフィルター ペーパー エッジを使用します。 グリッド、TEM に注入する前に完全に乾燥しなさい 5. Polyplex 形成 注: 例示例 DNA 折り紙・ N ・ P 0.01 8 比でキトサンを含む polyplex を準備するため。 フォーミュラ 1 (表 1) を使用してポリカチオンあたりアミンの数を計算します。 260 超紫外線分光光度計を使用して精製 DNA 折り紙の濃度測定 nm。空白として TB バッファーの 2 μ L を使用すると、マシンを調整します。「リン酸の nmol」を計算式 2 を使用しています。 リン酸の 1 nmol を含む DNA 折り紙構造の 15 μ L を準備します。 キトサンは、N ・ P 0.01 8 で polyplex を準備するために必要な量を計算するのに式 3 を使用します。たとえば、N ・ P 8 polyplex を準備、キトサン (0.8 mg/mL) の 1.8 μ L は必要です (N ・ P は 8、リン酸の nmol は 1、キトサンの分子量は 5,000 g/mol、キトサン原液の濃度は 0.8 mg/mL、キトサンあたりアミンの数は 28)。キトサン (0.8 mg/mL) の 1.8 μ L に TB の 13.2 μ L を追加します。5.3 NP 8 DNA 折り紙キトサン polyplex を得るためのステップから 15 μ L の DNA 折り紙にキトサン液 (0.8 mg/mL) の 15 μ L を追加します。Polyplex が自発的に形成されます。 5.4 別 N 比で polyplexes を準備する手順を繰り返します。 ステップ 3 (図 1 a) で説明したように、時代を実行します。コントロールとして裸の DNA 折り紙があります。 ステップ 4 (図 2) で説明したように、polyplex をイメージします。式 1)ポリカチオンあたりアミン グループの数式 2)リン酸のほくろ=式 3)ポリカチオン量 (μ L)= 6. デキストラン硫酸をカプセル化解除 式 4 (表 2) を使用してデキストラン硫酸あたりの硫酸塩のグループの数を計算します。 デキストラン硫酸を定義済みの polyplex の decomplexation に必要な量を計算する A/P 比式 5 を使用して。A/P 充電率と DNA 折り紙のリン酸基 (P) に polyanion (A) の硫酸塩のグループの間の比率です。デキストラン硫酸の過剰量 (例えば500 1,000) polyplexes の効率的な decomplexation が必要です。たとえば、decomplex、polyplex セクション 5 で用意 (polyplex を含むリン酸の 1 nmol) で P 1,000、デキストラン硫酸 40 kda (50 mg/mL) 3.6 μ L が必要です/(A/P は 1,000、リン酸の nmol が 1、デキストラン硫酸の分子量は 40,000 g/mol、デキストラン硫酸原液の濃度は 50 mg/mL と硫酸の数は 220)。ステップ 5.4 から、polyplex にデキストラン硫酸塩 (50 mg/mL) の 3.6 μ L を加え、よく混ぜます。 キトサン polyplex で作業する場合は、decomplexation プロセスを容易にする水酸化ナトリウムを追加します。10 mM の最終濃度の水酸化ナトリウムを追加します。LPEI polyplexes に対してこの手順をスキップします。 ステップ 3 (図 1 b) で説明されているように、時代を実行します。コントロールとして裸の DNA 折り紙と polyplex が含まれます。式 4)polyanion あたりの硫酸塩のグループの番号 =式 5)デキストラン硫酸の量 (μ L)= 7 Mg 枯渇に向かって安定性 4 x 600 μ L Mg 0 バッファー (5 mM トリス、1 mM EDTA と 30 mM NaCl) の DNA 折り紙または対応する polyplex (2 nmol のリン酸を含む) の 20 μ L を洗う限外濾過カラムを用いた (MWCO ~ 3 kDa)。3-5 分の r. t. で 14,000 × g で各洗浄をスピンします。 残りの溶液 (80 μ L) を収集し、thermomixer で 650 rpm で 1 日, 37 ° C で。 LPEI polyplex をテストする場合は、16 mM MgCl2の最終的な集中の MgCl2 (500 mM) の 2.5 μ L を追加します。デキストラン硫酸 40 kDa (50 mg/mL) の 7 μ L を追加し、(A と同等/P 1,000) コア DNA ナノ構造を解明する (カプセル化解除、ステップ 6 を参照してください)。キトサン polyplex または裸の DNA 折り紙を使用注: この手順を省略します。 ステップ 3 (図 2) で説明した nsTEM イメージングに従ってください。 8. DNase 私裸の DNA 折り紙ナノ構造の滴定分析 ミックス 3 μ L の 10 倍の 2 μ L で 1 nmol のリン酸塩を含む裸の DNA 折り紙 DNase 私バッファー (100 mM トリス-HCl、25 mM MgCl2, 5 mM の CaCl2、pH 7.6)、1 μ L MgCl2 (250 mM)、0.2 mL PCR の水の 12 μ L のチューブします。DNase の 2 μ L を追加私 (10 倍)。DNase のストック濃度を調整 (10 x) 最終 DNase を取得する私私濃度 0.25 2 U/mL。 37 ° C、たちで 1-2 時間でサンプルをインキュベートします。 氷のサンプルを浸すし、500 mM ジチオトレイトール (DTT) の 2 μ L の追加によって修飾アミノ酸アクティビティを非アクティブ化、グリコールエーテルジアミン四酢酸 (33 mM) の 2.5 μ L。 手順 3 で説明されているように年齢を使用してサンプルを分析します。 9. DNase に向かって Polyplexes の安定性私 (異なる N 比で合成したリン酸の 1 nmol を含む) polyplex のミックス 4 μ L (10 倍) をバッファー私、DNase の 1.5 μ L で、TB の 8 μ L と DNase の 1.5 μ I (100 U/mL) 0.2 mL PCR チューブします。 たちの 37 ° C で 24 時間のサンプルをインキュベートします。 プロティナーゼ K (20 mg/mL)、たちの 37 ° C で 30 分間インキュベートする DNase I. を消化するための 2 μ L を追加します。注: 代わりに酵素消化、DTT (500 mM) の 1.5 μ L 追加して 2 μ L グリコールエーテルジアミン四酢酸 (33 mM) の私が行うことが DNase の停止等化学。 デキストラン硫酸 40 kda (50 mg/mL) 3.6 μ L を追加 (A に相当/P 1,000) コア DNA ナノ構造を解明します。 ステップ 3 (図 3 a図 3) で説明した年齢を実行します。新鮮な DNA 折り紙を測定およびゲルのバンド強度を比較するためのコントロールとして含まれます。 年齢や抽出圧搾による DNA 折り紙のサプライヤーによって提供されるプロトコルに基づいて抽出列を固定バンドを切除します。 ステップ 4 (図 2) で説明されているように nsTEM イメージングを従ってください。 10. 安定性ウシ胎児血清 (FBS) の方 TB + 10 μ L で裸の DNA 折り紙や (リン酸の 1 nmol を含む)、対応する polyplex のミックス 4 μ L FB 0.2 mL PCR の管します。新鮮な解凍 FBS を使用します。 37 ° C 24 時間サーマルサイクラーにサンプルをインキュベートします。 氷浴でサンプルを浸します。 Polyplex をテストした場合、カプセル化解除プロセスを実行するには、デキストラン硫酸 40 kda (50 mg/mL) 3.6 μ L を追加します。さらに、キトサン polyplexes (ステップ 6.3 を参照) を使用して場合水酸化ナトリウムを追加します。 手順 3 で説明されているように、時代を実行します。新鮮な DNA 折り紙を測定およびゲルのバンド強度を比較するためのコントロールとして含まれます。 年齢にバンドを消費税し、スクイズ凍結抽出列によって DNA 折り紙を抽出します。 0.2 mL PCR チューブで抽出された DNA 折り紙ソリューション (20 μ L) にプロティナーゼ K の 2 μ L (20 mg/mL) を追加します。ナノ構造にバインドされている血清タンパク質を消化するたちで 37 ° C で 30 分間インキュベートします。 16 mM MgCl2遠心列の使用を含む TB の 5 x 500 μ L のサンプルを洗う (MWCO 〜 100 kDa), プロテイナーゼ K を洗う (MW ~ 28.9 kDa) 離れて。3-5 分の r. t. で 14,000 × g で各洗浄をスピンします。 NsTEM イメージング手順 4 (図 3) に記載されているを実行します。注: ステップ 10.6 からのゲルの抽出されたサンプルは、直接 nsTEM イメージングのため使用する可能性があります。しかし、イメージングは血清蛋白の DNA 折り紙ナノ構造への愛着のため非常に困難かもしれない。したがって、イメージング プロセスを容易にするためには、プロテイナーゼ K 処理 (手順 10.7 10.9) の使用をお勧めします。 11. 西洋わさびの過酸化酵素酵素 (HRP) のアドレスの指定可能性をテスト-ポリカチオンとコーティング時に DNA 折り紙を官能基化 ステップ 2 で説明したように自己組織化ビオチン化-NR (ビオチン NR) を浄化します。 精製ビオチン NR の 200 μ L を孵化させなさい (36 nM、16 mM で補った TB バッファー) HRP 標識ストレプトアビジンの 200 μ L で (540 TB バッファー内の nM)。14 mM の最終的な集中に MgCl2 (500 mM) の 4.8 μ L を追加します。R. t.、thermomixer で 650 rpm で 12 時間インキュベートします。 HRP 修飾 NR (HRP NR) 非連結の HRP 酵素を削除する (前述の手順 2) に、ペグの精製法による浄化します。16 mM MgCl2を含む TB で沈殿した HRP NR を再懸濁します。 精製された HRP NR のミックス 6.5 μ L (36 nM) 1、2、4、10、20 (式 3を使用して) の N 比で polyplex を準備するバリアント濃度ポリカチオンの 6.5 μ L で。 非ビオチン化 NR に 11.2 11.4 手順を繰り返します。HRP の酵素が DNA 折り紙, 非ビオチン化 DNA 折り紙に非具体的バインド HRP 酵素とペグと扱われますが精製 (ビオチン NR に類似)、試金の制御となります。 1、2、4、10、20 の N ・ P 比率に対応するバリアントの濃度のポリカチオンの 6.5 μ L で蒸留水のミックス 6.5 μ。論文サンプルは、空のグループとして機能します。 11.4 11.6 (12.5 μ L) の手順で調製した溶液を HEPES 緩衝液の 72.5 μ L を含む 96 ウェル プレートに追加 (25 mM 20 mM 200 mM の NaCl、KCl HEPES 0.05% トリトン X-100, 1 %dmso、pH 7.4) とよく混ぜます。 2, 2′-児島-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS) (15 mM) の 10 μ L を追加します。 H2O2 (12 mM) の 5 μ L を追加し、上下にピペッティングでよく混ぜます。H2O2は反応を開始します。 421 で吸光度を測定 nm マルチモード プレート リーダー (図 4 a) で 4 h 以上。 12. ヘミン結合アプタマー (HBA) のアドレスの指定可能性をテスト-ポリカチオンとコーティング時に DNA 折り紙を官能基化 ステップ 2 で説明したように HBA 官能基化-NR (HBA NR) を浄化します。6 mM MgCl2 (HBA NR の集約に高い鉛塩濃度) を添加した TB で沈殿した HBA NR を再懸濁します。 HBA NR のミックス 10 μ L (40 nM) 1、2、10 および 20 の N ・ P 比率の polyplex を準備するさまざまな濃度でポリカチオンの 10 μ L で。 裸 NR のミックス 10 μ L (40 nM) または 1、2、10 および 20 の N ・ P 比に対応するさまざまな濃度でポリカチオンの 10 μ L の蒸留水。 HEPES 緩衝液 60 μ L を含む 96 ウェル プレートに 12.2、12.3 の手順から 20 μ L を準備ソリューションの追加 (25 mM 20 mM 200 mM の NaCl、KCl HEPES 0.05% トリトン X-100, 1 %dmso、pH 7.4) とよく混ぜます。水 (12.2、12.3 の手順) から 20 μ L の polyplex またはポリカチオンのソリューションに置き換えるを少なくとも 1 つの空白のサンプルがあります。 ATBS (15 mM) を 10 μ l 添加に続いてヘミン (0.04 mM) の 5 μ L を追加します。5 分間軌道シェーカーにプレートを配置します。 H2O2 (12 mM) の 5 μ L を追加し、上下にピペッティングでよく混ぜます。 マルチモード プレート リーダー (図 4 b) と 421 nmover 30 分で吸光度を測定します。