Gentherapie inspiriert Polykation Beschichtung zum Schutz der DNA Origami Nanostrukturen

1. Vorbereitung Polykation Lager-Lösung LPEI-Stammlösung Fügen Sie 10 mg von LPEI in einem Glas Becher mit < 10 mL H2O. LPEI vollständig zu lösen, fügen Sie HCl (32 %) bis pH 2.0 zu erreichen. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,0 durch Zugabe von NaOH (10 M). Stellen Sie die Lautstärke auf die Endkonzentration von 1 mg/mL. Filtrat LPEI Vorratslösung durch eine Membran 0,22 µm. Chitosan-Stammlösung Auflösen von 16,6 mg Chitosan Oligosaccharid Lactat (Mw ~ 5 kDa, 60 % Oligosaccharid Komposition, deacetylated aus Chitin um 90 %) in 1 mL Essigsäure (10 %) wässrigen Medien zur Vorbereitung einer Stammlösung mit einer Konzentration von 10 mg/mL. 2. Reinigung der DNA Origami Nanostrukturen Mix 100 µL der Probe DNA Origami (in 5 mM Tris, 1 mM EDTA, 5 mM NaCl Puffer (gekennzeichnet als TB) einschließlich 18 mM MgCl2) durch die gleiche Menge an 22 mM MgCl2 TB ergänzt (100 µL) in einer 1,5 mL Tube. Fügen Sie 200 µL Puffer Reinigung (15 % (w/V) PEG 8.000 5 mM Tris, 1 mM EDTA und 505 mM NaCl). Mischen Sie durch Umkehrung der Schlauch vorsichtig. Drehen Sie die Probe bei 16.000 × g bei Raumtemperatur (r.t.) für 25 min. Den Überstand sorgfältig verwerfen und das Pellet in 16 mM MgCl2 ergänzt TB Puffer Aufschwemmen. Überstand und das Pellet enthalten überschüssiges Grundnahrungsmittel Stränge und ausgefällte DNA Origami. Eines Tages zu r.t. 650 u/min in einem Thermomixer inkubieren Sie Probe. Dieser Schritt ist für komplette Wiederfreisetzung des DNA-Origami. (3) Agarose-Gelelektrophorese (Alter) Fügen Sie 1,6 g Agarose und 80 mL 0,5 X TAE Puffer (20 mM Tris, 0,5 mM EDTA, 10 mM Essigsäure, pH 8) in ein Glasgefäß, eine 2 % Agarose-Gel vorzubereiten. Mikrowelle für 5 min. Schwenken den Inhalt des Bechers für 1 min in einem Wasserbad. Fügen Sie 352 µL MgCl2 (2,5 M), das Gel mit 11 mM MgCl2vorzubereiten. Pre Gel mit 10 µL DNA-Gel Fleck Fleck. Gießen Sie die Gel-Lösung in eine trockene Gel-Box und fügen Sie einen Gel-Elektrophorese-Kamm. Lassen Sie die Lösung bei r.t. für 15-30 min zu festigen. Ergänzen Sie den laufenden Puffer (0,5 x TAE-Puffer) mit 11 mM MgCl2. Mischen Sie 10-20 µL der Probe mit 20 % von 6 x laden Puffer (30 % (V/V) Glycerin, 0,25 % (w/V) Bromophenol blue, 0,25 % (w/V) Xylol Cyanol FF) und laden Sie sie in die Agarose-Gel-Brunnen. Führen Sie das Gel bei 70 V bei r.t. für 2,5 – 3 h. Visualisieren Sie das Gel mit einem UV-Scanner. 4. negative Fleck Transmissions-Elektronenmikroskopie (NsTEM) 5 µL verdünnter Nanostruktur oder die Polyplex auf einem Schein entladen Kohlenstoff-beschichtete Cu400 TEM Raster anwenden. Lassen sie adsorbieren, für ca. 1 min. Lassen Sie überschüssige Flüssigkeit vom Rand des Rasters, indem ein Stück Filterpapier. 5 µL einer 2 % igen Uranyl Acetat wässrigen Lösung anwenden und 1 min warten. Verwenden Sie Filterpapier Rand, um überschüssige Flüssigkeit vom Rand des Rasters vollständig zu entleeren. Lassen Sie das Gitter vollständig trocknen, bevor die Injektion in die TEM. 5. Polyplex Bildung Hinweis: Anschauliches Beispiel für die Vorbereitung einer Polyplex bestehend aus DNA-Origami und Chitosan N/P 0.01-8-Verhältnisse. Berechnen Sie die Anzahl von Aminen pro Polykation mit dem Formel-1 (Tabelle 1). Messen die Konzentration des gereinigten DNA Origami mit einem ultra Violet Spektralphotometer bei 260 nm. Verwenden Sie 2 µL TB Puffer als Rohling, um die Maschine zu kalibrieren. Berechnen Sie die “Nmol Phosphat” mit Formel-2. Bereiten Sie 15 µL DNA-Origami-Struktur inklusive 1 Nmol von Phosphat. Verwenden Sie Formel-3 das Volumen von Chitosan, berechnen, die notwendig ist für die Vorbereitung der Polyplex bei N/P 0.01-8. Zum Beispiel zur Vorbereitung der Polyplex N/P 8 1,8 µL von Chitosan (0,8 mg/mL) benötigt (N/P ist 8, Nmol von Phosphat ist 1, Molekulargewicht von Chitosan ist 5.000 g/Mol, Konzentration von Chitosan-Stammlösung ist 0,8 mg/mL und die Anzahl der Amine pro Chitosan ist 28). Fügen Sie 13.2 µL TB 1.8 µL von Chitosan (0,8 mg/mL hinzu). Fügen Sie 15 µL Chitosan-Lösung (0,8 mg/mL) zu 15 µL DNA Origami aus Schritt 5.3 eine DNA Origami-Chitosan Polyplex mit NP 8 bekommen. Die Polyplex ist spontan gebildet. Wiederholen Sie Schritt 5.4 Polyplexes bei verschiedenen N/P-Verhältnis vorzubereiten. Führen Sie ein Alter, wie in Schritt 3 (Abbildung 1A) beschrieben. Schließen Sie das nackte DNA Origami als Kontrolle. Bild der Polyplex wie in Schritt 4 (Abbildung 2) beschrieben.Formel-1-) Anzahl von Amin Gruppen pro PolykationFormel 2) Maulwurf von Phosphat=Formel-3) Volumen (µL) von polycations= (6) Delamination mit Dextran Sulfat Berechnen Sie die Anzahl der Sulfat-Gruppen pro Dextran Sulfat mit Formel-4 (Tabelle 2). Berechnen Sie das Volumen von Dextran Sulfat benötigt für die Decomplexation der Polyplex an einen vordefinierten A / P-Verhältnis mit Formel-5. Die A / P charge Ratio ist das Verhältnis zwischen den Sulfat Polyanions (A) den Phosphat-Gruppen (P) der DNA Origami. Ein Übermaß an Dextran Sulfat ist für eine effiziente Decomplexation von Polyplexes (z.B. 500-1.000) erforderlich. Zum Beispiel die Polyplex decomplex bereit in Abschnitt 5 (Polyplex enthält 1 Nmol Phosphat) bei A / P 1.000, 3,6 µL Dextran Sulfat 40 kDa (50 mg/mL) ist erforderlich (A / P beträgt 1.000, Nmol von Phosphat ist 1, das Molekulargewicht von Dextran Sulfat 40.000 g/Mol die Konzentration von Dextran Sulfat-Stammlösung ist 50 mg/mL und Zahl von Sulfat ist 220). Die Polyplex aus Schritt 5.4 3,6 µL Dextran Sulfat (50 mg/mL) hinzufügen und gut verrühren. Arbeiten mit einem Chitosan Polyplex fügen Sie NaOH um den Decomplexation zu erleichtern hinzu. Fügen Sie NaOH für eine Endkonzentration von 10 mM. Überspringen Sie diesen Schritt für LPEI Polyplexes. Führen Sie ein Alter, wie in Schritt 3 (Abbildung 1 b) beschrieben. Gehören Sie ein nackter DNA Origami und Polyplex als Kontrolle.Formel-4) Anzahl der Sulfat-Gruppen pro Polyanions =Formel-5) Volumen (µL) von Dextran Sulfat= 7. Stabilität gegenüber Mg Erschöpfung Waschen Sie 20 µL einer DNA Origami oder die entsprechenden Polyplex (einschließlich 2 Nmol Phosphat) mit 4 x 600 µL des Mg-Null-Puffers (5 mM Tris, 1 mM EDTA und 30 mM NaCl) über die Ultrafiltration Spalte (MWCO ~ 3 kDa). Drehen Sie jede Wäsche bei 14.000 × g bei r.t. für 3-5 min. Sammeln Sie die restliche Lösung (80 µL) und eines Tages bei 650 u/min in einem Thermomixer bei 37 ° C inkubieren. Wenn LPEI Polyplex testen, fügen Sie 2,5 µL MgCl2 (500 mM hinzu) für eine Endkonzentration von 16 mM MgCl2. Fügen Sie dann 7 µL Dextran Sulfat-40 kDa (50 mg/mL) (Äquivalent zu A / P 1.000), den Kern DNA Nanostrukturen zu entwirren (Delamination, siehe Schritt 6).Hinweis: Überspringen Sie diesen Schritt, wenn mit Chitosan Polyplex oder nackte DNA Origami arbeiten. NsTEM Bildgebung zu folgen, wie in Schritt 3 (Abbildung 2) beschrieben. 8. DNase ich Titration Assay von nackter DNA Origami Nanostrukturen Mix 3 µL nackte DNA Origami einschließlich 1 Nmol Phosphat mit 2 µL 10 X Röhren DNase I (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl2, 5 mM CaCl2, pH 7.6) 1 µL MgCl2 (250 mM), 12 µL Wasser in 0,2 mL PCR-Puffer. Fügen Sie 2 µL der DNase I (10 X). Passen Sie die Lager Konzentration der DNase ich (10 X) endgültige DNase bekommen ich Konzentrationen von 0,25-2 U/mL. Inkubieren Sie die Proben bei 37 ° C für ca. 1-2 h in einem Thermocycler. Tauchen Sie die Proben im Eis und deaktivieren Sie die Nucleolytic-Aktivität durch Zugabe von 2 µL 500 mM Dithiothreitol (DTT) und 2,5 µL der EGTA (33 mM). Analysieren Sie die Proben unter Verwendung Alter, wie in Schritt 3 beschrieben. (9) die Stabilität des Polyplexes in Richtung DNase ich Mix 4 µL einer Polyplex (einschließlich 1 Nmol von Phosphat, zubereitet auf verschiedene N/P-Verhältnis) mit 1,5 µL einer DNase I-Puffer (10 X), 8 µL TB und 1,5 µL DNase tube ich (100 U/mL) in ein 0,2 mL PCR. Inkubieren Sie die Probe für 24 h bei 37 ° C in einem Thermocycler. Fügen Sie 2 µL Proteinase K (20 mg/mL), die DNase I. Inkubation für 30 min bei 37 ° C in einem Thermocycler zu verdauen.Hinweis: anstelle von enzymatischen Verdauung, chemische Deaktivierung der DNase I durch Hinzufügen von 1,5 µL von DVB-t (500 mM) und 2 µL der EGTA (33 mM) ausgeführt werden können. 3.6 µL Dextran Sulfat-40 kDa (50 mg/mL) hinzufügen (Äquivalent zu A / P 1.000), den Kern DNA Nanostrukturen zu entwirren. Führen Sie Alter, wie in Schritt 3 (Abb. 3A, Abbildung 3) beschrieben. Sind frische DNA Origami als Steuerung für Messen und vergleichen die Band Intensitäten auf das Gel. Verbrauchsteuern Sie die Band auf dem Alter und dem Extrakt der DNA Origami von einem Spritzer Extraktion Spalte basierend auf dem Protokoll vom Lieferer gelieferten fixieren. NsTEM Bildgebung zu folgen, wie in Schritt 4 (Abbildung 2) beschrieben. 10. Stabilität gegenüber fetalen Bovine Serum (FBS) Mix 4 µL nackte DNA Origami oder ihre entsprechenden Polyplex (einschließlich 1 Nmol Phosphat) mit 17 µL TB + 10 % Rohre FBS in 0,2 mL PCR. Verwenden Sie frisch aufgetauten FBS. Inkubation der Probe bei 37 ° c in einem Thermocycler für 24 h. Tauchen Sie die Probe in ein Eisbad. Wenn die Polyplex zu testen, führen Sie die Delamination Prozess durch Zugabe von 3,6 µL Dextran Sulfat-40 kDa (50 mg/mL). Darüber hinaus fügen Sie NaOH, wenn mit Chitosan Polyplexes arbeiten (siehe Punkt 6.3) Führen Sie ein Alter, wie in Schritt 3 beschrieben. Enthalten Sie das frische DNA Origami als Steuerung für Messen und vergleichen die Band Intensitäten auf dem Gel. Verbrauchsteuern Sie die Band nach dem Alter und extrahieren Sie der DNA Origami ein Squeeze Einfrieren Extraktion spaltenweise zu. Die extrahierte DNA Origami Lösung (20 µL) in einem 0,2 mL PCR-Röhrchen 2 µL Proteinase K (20 mg/mL) hinzufügen. Inkubieren Sie für 30 min bei 37 ° C in einem Thermocycler Serumproteine gebunden an die Nanostrukturen zu verdauen. Waschen Sie die Probe mit 5 x 500 µL TB einschließlich 16 mM MgCl2 unter Verwendung der Ultrazentrifugation Spalte (MWCO ~ 100 kDa), Proteinase K zu waschen (MW ~ 28,9 kDa) entfernt. Drehen Sie jede Wäsche bei 14.000 × g bei r.t. für 3-5 min. Führen Sie NsTEM Bildgebung wie in Schritt 4 (Abbildung 3) beschrieben.Hinweis: Die Gel extrahierten Probe aus Schritt 10.6 kann direkt für NsTEM Bildgebung verwendet werden. Die Bildgebung könnte jedoch sehr anspruchsvoll durch die Befestigung des Serum-Proteine an die DNA Origami Nanostrukturen. Proteinase K Behandlung (Schritte 10.7 10.9) wird daher empfohlen, den imaging-Prozess zu erleichtern. 11. Prüfung der Adressierbarkeit von Meerrettich-Peroxidase-Enzym (HRP)-funktionalisiert DNA Origami bei Beschichtung mit Polycations Reinigen Sie die selbstgebaute biotinylierte-NR (Biotin-NR), wie in Schritt2 beschrieben. Inkubieren Sie 200 µL des gereinigten Biotin-NR (36 nM, 16 mm ergänzt TB Puffer) mit 200 µL des HRP-konjugierten Streptavidin (540 nM im TB-Puffer). Hinzu kommt eine Endkonzentration von 14 mM 4,8 µL MgCl2 (500 mM). Bei r.t. 12 h bei 650 u/min in einem Thermomixer inkubieren Reinigen Sie HRP funktionalisiert NR (HRP-NR) durch eine PEG-Reinigungsverfahren (wie in Schritt2 beschrieben) um die ungebundenen HRP-Enzyme zu entfernen. Aufzuwirbeln Sie die ausgefällte HRP-NR in TB 16 mM MgCl2einschließlich. Mix-6.5 µL des gereinigten HRP-NR (36 nM) mit 6,5 µL Polycations variant Konzentrationen Polyplex auf N/P-Verhältnis von 1, 2, 4, 10 und 20 (mit Formel 3) vorzubereiten. Wiederholen Sie die Schritte 11.2-11.4 für nicht-biotinylierte NR. Da das Enzym HRP unspezifisch an das DNA-Origami, das nicht biotinylierte DNA Origami binden kann die HRP Enzyme mit PEG behandelt wird gereinigt (ähnlich wie Biotin-NR), wird wie das Steuerelement in der Probe dienen. Mix-6.5 µL destilliertes Wasser mit 6,5 µL Polycations variant Konzentrationen entsprechend der definierten N/P-Verhältnis von 1, 2, 4, 10 und 20. Thesen Beispiele dienen als die leere Gruppe. Die fertige Lösung in Schritten 11,4-11,6 (12,5 µL) hinzufügen einer 96-Well-Platte einschließlich 72,5 µL HEPES-Puffer (25 mM HEPES, 20 mM KCl, 200 mM NaCl, 0,05 % Triton x-100, 1 % DMSO, pH 7,4) und gut mischen. Fügen Sie 10 µL 2, 2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS) (15 mM). Fügen Sie 5 µL von H2O2 (12 mM) und mischen Sie gut durch Pipettieren rauf und runter. H2O2 initiiert die Reaktion. Messung der Extinktion bei 421 nm über 4 h mit einem multimode-Platte-Lesegerät (Abb. 4A). 12. Prüfung der Adressierbarkeit von Hämin-Bindung Aptamere (HBA)-funktionalisiert DNA Origami bei Beschichtung mit Polycations Reinigen Sie die HBA funktionalisiert-NR (HBA-NR), wie in Schritt2 beschrieben. Aufschwemmen der ausgefällten HBA-NR in TB mit 6 mM MgCl2 (höhere Salzkonzentration führt der Aggregation der HBA-NR) ergänzt. Mischung 10 µL der HBA-NR (40 nM) mit 10 µL des Polycations in unterschiedlicher Konzentration Polyplex definierten N/P-Verhältnis von 1, 2, 10 und 20 vorzubereiten. Mischung 10 µL nackt-NR (40 nM) oder destilliertem Wasser mit 10 µL des Polycations bei unterschiedlichen Konzentrationen N/P-Verhältnis von 1, 2, 10 und 20 entsprechend. Die 96-Well-Platte einschließlich 60 µL HEPES-Puffer die 20 µL vorbereitet-Lösung aus Schritte 12.2 und 12.3 hinzufügen (25 mM HEPES, 20 mM KCl, 200 mM NaCl, 0,05 % Triton x-100, 1 % DMSO, pH 7,4) und gut mischen. Enthalten Sie mindestens eine leere Probe 20 µL Polyplex oder Polykation Lösung (von Stufen, 12.2 und 12.3) durch Wasser ersetzen. Fügen Sie 5 µL Hämin (0,04 mM) gefolgt von 10 µL ATBS (15 mM). Legen Sie die Platte auf einem Orbitalschüttler für 5 min. Fügen Sie 5 µL von H2O2 (12 mM) und mischen Sie gut durch Pipettieren rauf und runter. Messung der Extinktion bei 421 Nmover 30 min mit dem multimode Platte Leser (Abbildung 4 b).