Aqui nós apresentamos um romance método para a determinação de afinidades de ligação em equilíbrio e em solução com alta sensibilidade em larga escala. Isto melhora a análise quantitativa de ligação de DNA-fator de transcrição. O método baseia-se em medições de anisotropia de fluorescência automatizada em um sistema de liberação controlada.
Quantificação precisa do fator da transcrição (TF)-interações DNA é essencial para a compreensão da regulação da expressão génica. Uma vez que as abordagens existentes sofrem limitações significativas, temos desenvolvido um novo método para a determinação de afinidades de ligação TF-DNA com alta sensibilidade em larga escala. O ensaio baseia-se no princípio de anisotropia (FA) da fluorescência estabelecida mas introduz melhorias técnicas importantes. Primeiro, podemos medir uma curva de titulação do competidor FA completa em um único poço incorporando TF e uma referência fluorescente etiquetada DNA em uma matriz do gel do agarose porosa. Sem rótulo oligómero de DNA é carregado em cima como um concorrente e, através da difusão, forma um gradiente espácio-temporais. O gradiente de FA resultante é então leia usando uma configuração de microscópio de epifluorescência personalizado. Esta configuração melhorada aumenta a sensibilidade de detecção de sinal de FA, permitindo uma ligação fraca e forte para confiantemente ser quantificadas, mesmo para moléculas com peso moleculares similares. Desta forma, podemos medir uma curva de titulação por alvéolo de uma placa multi bem, e através de um procedimento de montagem, podemos extrair a constante de dissociação absoluta (KD) e a concentração da proteína ativa. Testando todas as variantes do único ponto de mutação de um determinado consenso sequência de vinculação, nós pode pesquisa a paisagem de especificidade de associação inteira de um TF, normalmente em um único prato. As matrizes de peso posição resultante (PWMs) superam os derivados de outros métodos na previsão na vivo ocupação TF. Aqui, apresentamos um guia detalhado para a implementação de quadril-FA em um microscópio fluorescente automatizado convencional e o pipeline de análise de dados.
Dado o papel central dos fatores de transcrição (TFs) na regulação gênica, determinar suas preferências de ligação de forma quantitativa é de suma importância. Estudos seminais por von Hippel introduziram a noção de que regulamentar TFs rapidamente reconhecem o DNA, tal que sua ligação é bem descrita pelo equilíbrio termodinâmico, enquanto os eventos a jusante da RNA polimerase ao promotor de recrutamento são controlados por mais lenta cinética1. Na vivo vinculação estudos recentes sugerem que esta imagem é provavelmente mais complexa2,3; no entanto, estes pressupostos gerais servem como boas aproximações e apoiaram muitas abordagens computacionais para encontrar elementos cis-regulatórios e prever a expressão de sequências4,5,6. Enquanto vinculação de equilíbrio, portanto, tem sido empregada com sucesso como um conceito, métodos atuais para determinar interações TF-DNA centrar-se na vinculação de especificidade e normalmente não diretamente medida afinidades de ligação em equilíbrio. A medição sistemática de vinculação TF-DNA representa um considerável desafio técnico, e os métodos existentes têm várias limitações diferentes.
Imunoprecipitação da cromatina, seguida por sequenciamento (ChIP-seq)7, a mais prevalente na vivo técnica, de profundidade não permite a medição de afinidades de ligação ou a localização exacta de binding sites dentro de fragmentos genômicos. Vários em vitro métodos, incluindo footprinting8DNase, mobilidade electrophoretic turno (EMSA)9, superfície plasmon ressonância (SPR)10e microescala thermophoresis11 são capazes de medir as afinidades de ligação, Mas eles são relativamente baixa taxa de transferência. Por outro lado, técnicas de alta taxa de transferência, incluindo proteína ligação microarrays12, HT-SELEX13,14e bacterianas um híbrido (B1H)15 não são capazes de medir as afinidades de ligação e normalmente produzir excessivamente específica vinculação sequências, que é principalmente devido a seleção rigorosa ou lavar as etapas necessárias. Os desenvolvimentos mais recentes incluem o sequenciamento profundo baseado HiTS-FLIP16, SELEX-seq17, baseada em microfluídica MITOMI18 e o sorriso-Seq19, que permitem a extração de afinidades de ligação absoluta; no entanto, eles dependem de medir intensidades de fluorescência de rotulado TF e DNA. Fluorescência sinais, portanto, tornar-se limitar às concentrações de baixa proteína e na determinação de valores baixos de KD (< ~ 10 nM). Além disso, a ligação de TF-DNA em um desses métodos ocorre em superfícies finas, levantando questões com vinculação inespecíficas e/ou fundo de autofluorescência, o que torna difícil quantificar com precisão a ligação fraca.
Para lidar com essas limitações, nós desenvolvemos um novo método para determinar as paisagens de afinidade do TF-DNA em equilíbrio e em solução, que chamamos de alto desempenho da fluorescência anisotropia (HiP-FA)20. A técnica é baseada na fluorescência estabelecida anisotropia (FA) ensaio21 mas modificada para medir constantes de ligação com alta sensibilidade e em grande escala usando um microscópio automatizado personalizado e configuração de análise.
O ensaio de FA monitora a interação da espécie fluorescente etiquetada (como um oligómero de DNA) para um parceiro de ligação, neste caso, um TF, medindo-se a rotação molecular da molécula rotulada. A ligação para o TF, sua velocidade de rotação diminui devido à maior raio hidrodinâmico e o peso molecular do complexo acoplado, que resulta em maior FA. A medida exata de ligação muito forte (KD < ~ 1 nM) requer o uso de baixas concentrações de referência rotulada, DNA (c < ~ 1 nM). Isto é difícil de alcançar com um instrumento comercial tais como um leitor de microplacas padrão. Além disso, uma diferença de tamanho grande (10-100 vezes) entre os complexos acoplados e desacoplados é geralmente necessária, proibindo a medição das interações entre domínios de ligação de TF e curtos oligómeros de DNA, que são tipicamente de peso moleculares similares mais ou menos . Finalmente, uma curva de titulação completa normalmente requer a preparação e a medição de vários poços que contém uma série de concentração para a espécie titulada.
Para solucionar esses problemas, nós usamos uma armadilha de microscopia widefield, modificada para alcançar a sensibilidade elevada da deteção e permitir medições de FA em z-posições diferentes de um único poço. Isso nos permite monitorar as interações de ligação entre as espécies de semelhante peso molecular e com alta afinidade. Uma taxa de transferência é conseguida medindo FA de formatos de placa multi bem e realizar uma série de titulação inteira em um único bem, usando um sistema de entrega de controlada (Figura 1um). Além disso, empregando um ensaio competitivo, extraímos as constantes de ligação, não só mas também a concentração de proteína ativa. Esta é uma característica importante do ensaio, uma vez que apenas uma parte das moléculas expressas TF são ativo devido ao enrolamento de proteínas ou degradação. A instalação experimental baseia-se em um microscópio de epifluorescência comercial equipado com estágios de XY – e Z-piezo. Nós atualizado o sistema com a excitação do laser externo e, em seguida, detectado que os dois emitida componentes de polarização linear sobre o chip de uma câmera EM-CCD com eficiência quântica alta para detecção de luz (Figura 1b e 1C). O sistema usa um objectivo de alta abertura numérica (NA) acoplado a um sensor ultra sensível e, portanto, proporciona medições altamente sensíveis de FA. Gravando-se z-pilhas de fluorescência, vinculação interações pode ser medido ao longo do eixo z óptico quando usando uma matriz heterogêneo para os reagentes. Todas essas modificações podem ser facilmente implementadas em um sistema existente e são cost-effective.
Nós empregamos um ensaio competitivo em que a afinidade de ligação de um oligómero de DNA sem rótulo é medida em comparação com o DNA fluorescente etiquetado, que serve como uma referência. TF e referência DNA são incorporados em concentrações fixas em uma matriz de gel de agarose porosa (poros tamanho ~ 1 µm) que constitui um ambiente não-interagindo para a ligação. A referência de DNA é rotulado com Cy5. Este corante provou para ser well-suited para medições de FA devido ao seu tempo de vida de fluorescência relativamente longo (~ 1ns) e emissão de fluorescência no far-red do espectro visível (fundo de baixa autofluorescência). A concentração de TF é em excesso molar sobre DNA Cy5-referência, garantindo que todo DNA de referência está ligado à proteína. Uma solução do concorrente sem rótulo DNA é então depositada na superfície do gel e difunde-se no interior da matriz porosa, estabelecendo um gradiente de concentração c (z, t) muda ao longo do z-posição do plano focal e tempo t (Figura 1, Figura 2a-2C). O TF vinculado ao DNA Cy5-referência, portanto, é localmente exposto a diferentes concentrações do concorrente DNA que concorre para vinculação, levando a uma FA dinamicamente mudando de Cy5-referência DNA FAREF(z, t) (Figura 2b e 2C).
Para determinar a c(z,t) de concentração de concorrente, medimos em separado wells (poços de calibração) a FA dinamicamente a mudança do sinal do Nilo Azul (NB) FANB(z, t) (Figura 2um e 3). Esta tintura intercala no ADN e desse modo atua como um sensor de ADN para o concorrente de DNA. Com este sistema de entrega controlado, dezenas a centenas de diferentes afinidades de ligação de DNA-proteína podem ser medidas dentro de um prato bem multi (formato de placa de 96 ou 384 poços). Medição é então realizada sequencialmente até completo deslocamento da referência rotulado DNA do TF. Determinamos a especificidade de ligação para um dado fator medindo as afinidades de todas as mutações de base única de 3 N da sequência consenso de comprimento N. Quadril-FA requer pequenas quantidades de proteínas (~ pmoles por curva de titulação) e mostra baixa variabilidade na determinação de KDs [coeficiente de variação (CV) < 20%], permitindo que as medidas em uma escala relativamente grande. O método pode ser realizado manualmente ou totalmente automatizado usando um sistema robótico, resultando em CVs ainda menores (Figura 4, painel superior). Constantes de dissociação são medidos com exatidão elevada até 0,5 nM. Por afinidades extremamente altas (KD < 500 pM), nós usamos uma padrão competitiva titulação (Figura 5) devido as imprecisões na medição de concentrações de DNA concorrente em níveis baixos (< 100 nM).
Quadril-FA pode ser implementado em quase qualquer padrão, invertido, epifluorescência microscópio fluorescente, desde que a disponibilidade de um automatizado XY-estágio e um estágio de eixo z de piezo. Componentes ópticos foram construídos em torno de uma instalação automatizada widefield equipada com um objetivo de longa distância. Na prática, o ensaio pode ser adaptado aos objectivos com outras características (em trabalho específico, a distância e abertura numérica). No entanto, isto requer a otimização dos parâmetros (distâncias entre a z-fatias, a porosidade e a altura do gel do agarose, etc.). O uso de outros tipos de lasers ou câmera também é possível. Uma descrição detalhada de todo o procedimento experimental e análise de dados é dada abaixo, na seção de protocolo.
Quadril-FA é um abrangente novo método para a determinação das paisagens de preferência de vinculação de interações TF-DNA. Ele mede afinidades de ligação de mutacional DNA motivo variantes diretamente, evitando qualquer pressuposto subjacente que preferências de ligação são refletidas na frequência de ocorrência de nucleotídeo em um conjunto de ligantes acima-limite. Medição ocorre na solução sem imobilização e interferência mecânica ou química, com a reação de ligação, aproximar as condições de equilíbrio tão perto quanto possível. O sistema de entrega controlado permite a medição de uma curva de titulação completa dentro de um único bem e aumenta a produtividade e a confiabilidade, poupando a proteína. Usar um objectivo com uma abertura numérica elevada e EM-CCD câmera com uma eficiência de coleta de luz alta permite a detecção de luz fluorescente altamente sensível. Daí, com esta configuração, o pequeno FA muda tão baixo como 10-15 mP pode ser detectado com precisão; na prática, isto significa que qualquer reação de ligação para que o aumento da massa depois de vinculação é mínima (tão baixo quanto uma relação massa 2) é facilmente detectado. Isto não é geralmente o caso com sistemas comerciais como leitores de microplacas. Devido a sua alta sensibilidade, quadril-FA amplia o alcance das constantes de dissociação que possa ser fiavelmente mensurada na escala picomolar. Energias de ligação são determinadas com precisão ao longo de várias ordens de magnitude.
Para avaliar a qualidade das revista PWMs, realizamos dois tipos de análise20. Nós testamos, por cinco fatores da rede do gene de segmentação, bem como diferentes PWMs podem prever perfis de ChIP-seq experimentais nas regiões genômicas de 21 genes de segmentação. Como um segundo teste, usamos uma sequência-para-expressão modelo4 que prevê padrões de expressão de potenciadores de segmentação em função da concentração de preferência e proteína de ligação do TFs participante. Em ambos os exercícios, verificou-se que o menos específico HiP-FA PWMs executar significativamente melhor do que o mais específico do footprinting e B1H PWMs20.
Ao contrário dos métodos de novo , quadril-FA requer algum conhecimento prévio de preferência de um determinado TF ligação. No entanto, sequências de consenso são conhecidas por muitos TFs, e muitos métodos existentes podem fornecê-los de14,13,15. Se necessário, a sequência de ligação ideal verdade encontram-se iterativamente.
Nós usamos oligómeros de referência de DNA marcados fluorescentemente com Cy5 e Bodipy-650. Estes corantes provaram desempenho para medições de FA desde a anisotropia da acoplados e desacoplado rotulados-referência DNA eram o maior entre os diferentes corantes testados. Isso garante um alcance dinâmico máximo para os valores de FA. Geralmente, qualquer tintura fluorescente com um tempo de vida de fluorescência ≥ 1 ns é susceptível de ser apropriado, mas precisa ser testado primeiro. Se possível, é aconselhável usar corantes fluoresce na faixa de infravermelho próximo para minimizar a proteína autofluorescência.
O passo mais crítico do processo experimental é a pipetagem do gel para as placas bem. Boa reprodutibilidade requer os gel de volumes a ser mais uniforme possível. Mudanças na altura do gel são traduzidas em alterações de difusividade para o competitivo oligómero de DNA e assim, em mudanças aparentes de afinidade ao avaliar os dados. Esta é a principal fonte de variação em um técnico replicar. A utilização de uma técnicas eletrônicas de pipeta ou automação melhora a reprodutibilidade. Bolhas de ar dentro do gel podem ser evitadas pipetando lento e cuidadoso. Também é importante adicionar as todas as soluções de concorrente em cima dos poços de titulação com como pouco atraso possível. Para melhor reprodutibilidade, todo o processo pode ser automatizado usando um robô pipetagem com incubadoras de calor. Uma parte crítica de transferência o protocolo para automação é a otimização necessária da temperatura da incubadora e os tempos de incubação. Certifique-se de encontrar um equilíbrio ideal entre a viscosidade do gel (i. e., nem muito frio) e a estabilidade das proteínas (ou seja, não muito quente). Isso depende tanto da velocidade distribuidora dos géis em poços e estabilidade da proteína usada.
Quadril-FA faz uso de um sistema de liberação controlado para os oligómeros de DNA do concorrente. Para construir as curvas de titulações, é necessário determinar a concentração DNA concorrente c(z,t) para cada dado z-posição dentro da matriz do gel e tempo ponto t. Este é outro passo crítico, uma vez que a determinação do KDs depende diretamente c(z,t). Poços de calibração contendo o corante NB como um sensor para a concentração de DNA são usados para este propósito (Figura 1d, Figura 2um). Normalmente, o 3-5 poços de calibração contendo NB por placa são suficientes. Antes de avaliar qualquer HiP-FA experimento, uma curva de calibração de NB deve ser construída para o set-up, realizando uma série de titulação convencional de NB dissolvido no gel do agarose com um concorrente, o DNA de qualquer sequência em diferentes concentrações (Figura 3 um), conforme explicado em detalhes na etapa 8. No caso de ligação muito forte (KD < 500 pM), a extrapolação utilizada para a determinação de baixas concentrações de concorrente DNA torna-se limitar, já que é menos precisa do que uma medida direta. No entanto, para TFs com tão baixa KDs, configuração do quadril-FA pode ser usada para executar uma titulação convencional do competidor em tampão de ligação sem o uso de uma matriz de gel de agarose (Figura 5). Por exemplo, uma titulação completa com 12 diferentes concentrações de DNA concorrente pode ser executada em uma única linha de uma placa de 96 poços.
O sistema de entrega controlado também requer rápida cinética de ligação TF-DNA e proteínas estáveis, desde a difusão embora o gel de agarose é dinâmico (embora lento). Ambas as propriedades podem ser testadas diretamente com a configuração do quadril-FA por seguinte, ao longo do tempo, a FA do TFs de interesse quando vinculado a seus respectivos fluorescente etiquetado referência DNA. Nós medida KON e KOFF taxas para os fatores investigados e encontrou-os a estar na ordem de milissegundos a segundos20, em conformidade com outros estudos30. Isto é suficientemente rápido para garantir que as medições ocorrem no estado de equilíbrio. No caso de outras reações de ligação com cinética mais lenta, a difusividade do concorrente pode ser ajustada, reduzindo a sua concentração ou reduzindo o tamanho dos poros de gel. No caso do TFs testado, que todos têm rápido TOFF (~ segundos), um tempo de medição total de cerca de 1-2 h é suficiente para garantir o equilíbrio termodinâmico em cada medição.
Outro possível problema relacionado com a proteína é a formação de agregados de proteínas que podem alterar as medições de FA. O uso de outras condições de reserva contendo aditivos diferentes (como tensioactivos) pode evitar a formação de agregados, se necessário.
Temos trabalhado sob a hipótese de linearidade do PWM; no entanto, quadril-FA pode ser escalado para incluir todas as mutações possíveis di-nucleotídeo da sequência de consenso. Finalmente, quadril-FA pode ser adaptado para outros tipos de interações de ligação de medir. O pré-requisito é ter disponível uma molécula de referência adequada vinculado pela proteína que pode ser fluorescente etiquetada. Com o sistema de entrega controlado, um gradiente de concentração pode ser gerado por qualquer tipo de ligante; Portanto, interações proteína-proteína e droga-proteína podem ser medidas com throughput e da mesma forma de alta fidelidade.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos J. Müller de clones de cDNA e membros do laboratório de Gália, em particular S. Bergelt, para conselhos valiosos e discussão espirituosa. Este trabalho foi apoiado pelo SFB 646, redes de regulação na expressão de genoma e manutenção (C.J., P.B.), do centro para ciência de proteína integrado (U.G.) e a escola de pós-graduação para Munique de Biociências quantitativa (M.S.). U.G. reconhece a apoiar, a Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 646, 1064 SFB, CIPSM, QBM), o Bundesministerium für Bildung und pesquisa (BMBF: Elias – Innovationswettbewerb Systembiologie) e a Fundação Humboldt (Alexander von Humboldt, Cargo de professor).
Cy5-labled 16- / 18-bp DNA-oligomers | Eurofins | Custom synthesis | |
16- / 18-bp DNA-oligomers | Eurofins | Custom synthesis | |
Nile Blue A | Sigma | N5632-25G | |
Sensoplate plus microplate 96- or 384-well, PS | Greiner | 655891 | 175 µm thick glass bottom |
384 Well Sensoplate, black | Greiner | 788896 | |
Agarose, low gelling temperature | Sigma | A9414-50G | |
Sodium Chloride | Merck | 1.06404.1000 | |
Tween-20 | Sigma | P1379-1L | |
Di-Potassium hydrogen phosphate trihydrate | Merck | 1.05099.1000 | |
Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1.04873.1000 | |
Q-POD Element | Merck Millipore | ZMQSP0DE1 | |
Millipak 40 Gamma Gold Filter | Merck Millipore | MPGL04GK2 | |
Milli-Q Integral 3 Water Purification System | Merck Millipore | ZRXQ003WW | |
Quantum TIX | Merck Millipore | QTUMOTIX1 | |
DL-Dithiothreitol | Sigma | 43815-1G | |
Mastercycler gradient | Eppendorf | Z316083 | |
SafeSeal tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.706.200 | |
Tube 15 mL | Sarstedt | 62.554.502 | |
Multiply-Pro cup 0.2 mL PP | Sarstedt | 72.737.002 | |
MICROSCOPY SETUP: | |||
Automated widefield microscope | LEICA | DMI6000 | |
Long distance objective | LEICA | HCX PL FLUOAR L 60x/0.60 N.A. Dry | |
638 nm line continuous diode laser | Omicron | PHOxX 638-40, 40mW | |
Back-illuminated EM-CCD Camera | Andor | iXon DV897 | |
Dichroic mirror | AHF | 640nm cut-off | |
Bandpass filter | AHF | ET bandpass 700/75 | |
Linear polarizer | Thorlabs | LPVISC050-MP2 | |
Polarizing beam splitter | Thorlabs | BS010 | |
Achromatic lens | Thorlabs | 200 mm focal length | |
Multimode optical fiber | Optronis | FVP600660710 | |
ROBOTIC SYSTEM: | |||
Our robotic system includes a Biomek NXP workstations with a 96-channel head and with Span-8 pipettors, connected with a servo-shuttle, are used for all liquid transfer steps. In addition, the system is equipped with orbital shakers and a microplate reader (Paradigm, Molecular device) served by the Span-8 gripper | Beckman Coulter | Biomek NXP | |
SOFTWARE: | |||
Programming language | National Instruments | Labview 9.0 | |
Script for the HiP-FA software available at | https://github.com/GeneCenterMunich/HiP-FA |