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Biochemistry

Medición de alta sensibilidad de transcripción DNA Factor obligatorio afinidades por valoración competitiva utilizando microscopía de fluorescencia

Published: February 07, 2019
doi:
10.3791/58763
, , , ,
1Gene Center and Department of Biochemistry, Center for Protein Science Munich (CIPSM),Ludwig-Maximilians-Universität München

Summary

Aquí presentamos un nuevo método para la determinación de las afinidades de Unión en equilibrio y en la solución con alta sensibilidad a gran escala. Esto mejora el análisis cuantitativo de enlace de la DNA factor de transcripción. El método se basa en las medidas de anisotropía de fluorescencia automatizada en un sistema de control.

Abstract

Cuantificación precisa del factor de transcripción (TF)-interacciones ADN es esencial para la comprensión de la regulación de la expresión génica. Puesto que los enfoques existentes padecen de limitaciones significativas, hemos desarrollado un nuevo método para la determinación de las afinidades de enlace TF-DNA con alta sensibilidad a gran escala. El ensayo se basa en el principio de anisotropía (FA) de fluorescencia establecido pero introduce importantes mejoras técnicas. En primer lugar, medimos una curva de valoración competitiva FA completa en un solo pozo TF y una referencia marcada fluorescencia ADN en un gel de agarosa poroso matriz. Oligómero de DNA sin etiqueta se carga en la parte superior como un competidor y, a través de la difusión, forma un gradiente espacio-temporal. El gradiente resultante de FA es entonces leer usando una configuración de microscopio de epifluorescencia modificado para requisitos particulares. Esta configuración mejorada aumenta considerablemente la sensibilidad de detección de la señal de FA, permitiendo unión débil y fuerte a cuantificarse confiablemente, incluso para las moléculas de pesos moleculares similares. De esta manera, podemos medir una curva de titulación por pozo de una placa de varios pocillos, y a través de un procedimiento de ajuste, podemos extraer la constante de disociación absoluta (KD) y la concentración de la proteína activa. Probando todas las variantes de mutación puntual de un determinado consenso vinculante secuencia, podemos examinar el paisaje de la especificidad de toda unión de un TF, normalmente en una sola placa. Las matrices de peso posición resultante (Sinuosidal) superan a los derivados de otros métodos de predicción en vivo el uso TF. Aquí, presentamos a una guía detallada para la implementación de cadera-FA en un microscopio de fluorescencia automatizado convencional y la tubería de análisis de datos.

Introduction

Dado el papel central de los factores de transcripción (TFs) en Regulación génica, determinar sus preferencias de enlace en términos cuantitativos es de suma importancia. Estudios seminales por von Hippel introdujo la noción que TFs reglamentarias reconocen rápidamente DNA, tales que su unión está bien descrito por el equilibrio termodinámico, mientras que los acontecimientos posteriores de la ARN polimerasa al promotor de reclutamiento están controlados por de cinética más lenta1. En vivo enlace estudios recientes sugieren que esta imagen es probablemente más compleja2,3; sin embargo, estos supuestos generales sirven como buenas aproximaciones y han apoyado muchos enfoques computacionales para encontrar elementos cis-reguladores y predecir la expresión de secuencias4,5,6. Mientras que Unión de equilibrio así ha sido empleado con éxito como un concepto, los métodos actuales para la determinación de las interacciones de la TF-ADN en vinculante especificidad y típicamente no directamente medida afinidades de Unión en equilibrio. La medición sistemática de la TF-DNA obligatorio representa un desafío técnico considerable, y los métodos existentes tienen varias limitaciones diferentes.

Inmunoprecipitación de cromatina seguida de secuenciación (ChIP-seq)7, la más prevalente en vivo la técnica, de profundidad no permite la medición de las afinidades de enlace o la localización exacta de sitios dentro de fragmentos genómicos de Unión. Varios en vitro métodos, incluyendo DNase footprinting8movilidad electroforética (EMSA) de cambio9, plasmón superficial (SPR) de resonancia10y microescala thermophoresis11 son capaces de medir las afinidades de Unión, pero son relativamente bajo rendimiento. Por el contrario, no son capaces de medir las afinidades de Unión y suelen ceder demasiado técnicas de alto rendimiento incluyendo proteína vinculante microarrays12, HT-SELEX13,14y bacteriana uno híbrido (B1H)15 vinculante de las secuencias, que es principalmente debido a la rigurosa selección o lavado pasos necesarios. Desarrollos más recientes incluyen la secuenciación profunda base HiTS-FLIP16, SELEX-seq17y la basada en microfluídica MITOMI18 o Seq sonrisa19, que permiten la extracción de las afinidades de unión absoluta; sin embargo, cuentan con medición de intensidades de fluorescencia de etiquetado TF y el ADN. Fluorescencia señales, por lo tanto, se convierten en limitantes en concentraciones bajas en proteína y en la determinación de los valores bajos de KD (< ~ 10 nM). Por otra parte, la Unión de la TF-ADN en estos métodos ocurre en superficies finas, denuncian problemas con atascamiento no específico o fondo auto-fluorescencia, lo que hace difícil cuantificar con precisión el enlace débil.

Para hacer frente a estas limitaciones, hemos desarrollado un nuevo método para determinar ADN TF afinidad paisajes en equilibrio en solución, que hemos denominado alto rendimiento fluorescencia anisotropía (cadera-FA)20. La técnica está basada en la fluorescencia establecido anisotropía (FA) ensayo21 pero modificada para medir las constantes de unión con alta sensibilidad y a gran escala utilizando un microscopio automatizado modificado para requisitos particulares y la configuración del análisis.

El análisis de FA controla la interacción de la especie fluorescente etiquetado (como un oligómero de ADN) a un socio de la Unión, en este caso un TF, midiendo la rotación molecular de la molécula marcada. En enlace de la TF, su velocidad disminuye debido al mayor radio hidrodinámico y el peso molecular del complejo encuadernado, que se traduce en FA mayor. La medida exacta de unión muy fuerte (KD < ~ 1 nM) requiere el uso de bajas concentraciones de referencia etiquetado, ADN (c < ~ 1 nM). Esto es difícil de conseguir con un instrumento comercial, como un lector de microplacas estándar. Además, una diferencia de gran tamaño (10-100 veces) entre los complejos enlazados y es generalmente necesaria, prohibir la medición de las interacciones entre los dominios de unión a TF y oligómeros de ADN cortos, que suelen ser de pesos moleculares más o menos similares . Finalmente, una curva de titulación completa normalmente requiere la preparación y medición de pozos múltiples que contienen una serie de concentración de la especie valorada.

Para enfrentar estos problemas, utilizamos una configuración de microscopia widefield, modificada para alcanzar la sensibilidad de detección alta y permite mediciones de FA en diferentes posiciones de z de un solo pozo. Esto nos permite supervisar las interacciones de unión entre las especies de peso molecular similar y con alta afinidad. Un mayor rendimiento se logra mediante la medición de FA en formatos varios pocillos de la placa y llevar a cabo una serie de valoración todo en un solo bien con un entrega sistema controlado (figura 1a). Además, mediante el empleo de un análisis de Unión competitiva, extraemos las constantes de Unión, sino también la concentración de proteína activa. Esto es una característica importante del ensayo, puesto que solamente una porción de las moléculas TF expresadas son activos debido al mal plegamiento de proteínas o la degradación. El montaje experimental se basa en un microscopio de epifluorescencia comerciales equipado con etapas XY y Z piezo. Actualizado el sistema de excitación láser externo, entonces detecta que los dos emiten componentes de polarización lineal en el chip de una EM-CCD cámara con eficiencia cuántica alta para la detección de luz (figura 1b y 1 c). El sistema utiliza un objetivo de alta apertura numérica (NA) acoplado a un sensor ultra sensible y así ofrece mediciones de FA muy sensibles. Mediante el registro de fluorescencia z-pilas, vinculantes las interacciones se pueden medir sobre el eje óptico z cuando se utiliza una matriz heterogénea de los reactantes. Todas estas modificaciones pueden implementarse fácilmente en un sistema existente y son rentables.

Empleamos un análisis de Unión competitiva en la que se mide la afinidad de un oligómero de DNA sin etiqueta en comparación con el ADN marcado fluorescente, que sirve de referencia. TF y la referencia de ADN se incorporan a concentraciones fijas en una matriz de gel de agarosa poroso (poro tamaño ~ 1 μm) que constituye un ambiente no-que obran recíprocamente para el enlace. La referencia de ADN está etiquetado con Cy5. Este colorante resultó para ser muy adecuado para mediciones de FA debido a su duración relativamente larga de la fluorescencia (~ 1ns) y emisión de fluorescencia en el far-red del espectro visible (fondo de baja auto-fluorescencia). La concentración de TF es en exceso molar sobre Cy5-referencia ADN, asegurando que todos los ADN de referencia está limitado a la proteína. Una solución de competidor ADN luego se deposita en la superficie del gel y difunde dentro de la matriz porosa, estableciendo un gradiente de concentración c (z, t) que cambia a lo largo del z-posición del plano focal y el tiempo t (figura 1a, figura 2-2 c). La TF a la DNA de Cy5-referencia localmente así está expuesta a diferentes concentraciones del competidor ADN que compite para el enlace, conduce a una FA dinámicamente cambiante de la DNA de Cy5-referencia FAREF(z, t) (figura 2b y 2 c).

Para determinar la c(z,t) de concentración del competidor, se mide en diferentes pozos (pozos de calibración) el FA dinámicamente cambiante señal de azul de Nilo (NB) FANB(z, t) (figura 2una y 3). Este colorante se intercala en el ADN y así actúa como un sensor de DNA para el competidor ADN. Con este sistema de entrega controlada, decenas a cientos de diferentes afinidades de unión de ADN-proteína pueden medirse dentro de una placa bien múltiples (formato de la placa de 96 o 384 pocillos). Medición se realiza secuencialmente hasta la dislocación completa de la referencia etiquetada ADN de la TF. Se determinó la especificidad de enlace para un factor determinado por la medición de las afinidades de las mutaciones de base solo 3 N de la secuencia consenso de longitud N. Cadera-FA requiere bajas cantidades de proteínas (~ pmols por la curva de titulación) y espectáculos de baja variabilidad en la determinación de KDs [coeficiente de variación (CV) < 20%], mientras que permite mediciones en una escala relativamente grande. El método puede llevarse a cabo manualmente o totalmente automatizada utilizando un sistema robótico, dando por resultado aún más CVs (figura 4, panel superior). Constantes de disociación se miden con alta precisión hasta 0.5 nM. De muy alta afinidad (KD < 500 pM), utilizamos una valoración competitiva estándar (figura 5) debido a las inexactitudes en la medición de las concentraciones de ADN competidor en niveles bajos (< 100 nM).

Cadera-FA puede ser había implementado en prácticamente cualquier estándar, invertido, microscopio de fluorescencia epifluorescencia, proporciona la disponibilidad de una XY-fase automatizada y una etapa de eje z piezo. Componentes ópticos fueron construidos alrededor de una configuración automatizada widefield equipada con un objetivo de larga distancia. En la práctica, el ensayo puede ser adaptado a los objetivos con otras características (en particular trabajo, distancia y abertura numérica). Sin embargo, esto requiere la optimización de los parámetros (distancias entre el z-rodajas, porosidad y altura del gel de agarosa, etcetera.). También es posible el uso de otros tipos de láseres o cámara. Una descripción detallada del proceso experimental y análisis de datos se da a continuación en la sección de protocolo.

Protocol

1. polarización microscopia Para la iluminación de láser widefield, centran una 638 línea nm de un láser de diodo continuo (40 mW) en la apertura de fibra óptica multimodo para limpieza de viga. Monte un polarizador lineal en la salida de la fibra para ajustar la polarización de la luz laser. Bloquear el componente de excitación de la luz emitida con un espejo dicroico (corte de 640 nm) y un filtro paso de banda (bandpass 700/75). Pase la señal de fluorescencia a través de un divisor de viga polarizantes, que divide la luz emitida en sus componentes paralela y perpendiculares polarizados. Entonces, enfocar el haz no refleja (componente paralelo) y el rayo reflejado (componente perpendicular) con una lente acromática de distancia focal de 200 mm en el chip de una cámara EM-CCD retroiluminado (figura 1b y 1 c). Use un espejo para ajustar la dirección del rayo perpendicular hacia la lente. 2. diseño y pruebas de referencia etiquetados fluorescentes ADN oligómero Determinar la secuencia de la base de la referencia de ADN: el método se basa en un análisis competitivo que mide la constante de disociación (KD2) entre un factor de transcripción y un oligómero de DNA sin etiqueta competidor que compite para el enlace con un etiqueta fluorescente DNA cuya afinidad con el TF actúa como una referencia (KD1). La secuencia de consenso obtenida de otras fuentes como huella de DNasa o bacteriana 1-híbrido puede servir como punto de partida5,15.Nota: como regla general, una referencia conveniente ADN tiene un 3 a 7-fold disminución de la afinidad de unión a la TF en comparación con la secuencia consenso. Medir cadera-FA KD1s de 2-3 tentativas solas mutaciones de la secuencia consenso derivado en el paso anterior. Tratar de mutar posiciones en la secuencia de consenso que no son demasiado específicas para evitar la pérdida total del enlace.Nota: Es importante que la secuencia de referencia está limitada por el factor de transcripción de interés (hemos utilizado en este protocolo Gt gigante), pero no demasiado fuertemente, para que los competidores más débiles lo pueden desbancar a altas concentraciones. Ampliar el motivo base (8-12 pares de la base general) a una longitud de 16 pares de bases o más simétricamente flanqueando la secuencia en ambos lados (agregar cadenas laterales para atar correctamente). Si es necesario (para más de largo esperando los dominios, por ejemplo), uso de secuencias más largas (hasta ~ 50 pares de base de longitud fueron probados en el ensayo de cadera-FA).PRECAUCIÓN: Tenga cuidado de no añadir bases que se esperan para crear sitios de Unión ectópico. Uso de herramientas computacionales que predicen sitios de unión de Sinuosidal disponible para facilitar este proceso (p. ej., PySite22). Como referencia etiquetada ADN, oligómeros de orden fluorescencia etiquetadas en adelante o reversa filamento en el extremo 3′ o 5′. Uso, por ejemplo Cy5, Bodipy-650 o cualquier otro tinte adecuado a una concentración de 10 μm (100 acciones de x 10 μm) en agua y diluir paso a paso como se describe en el paso 3.1. Preparar 500 mL de 1 x de tampón de Unión mediante la adición de tampón de fosfato de potasio 33 mM (pH = 7.0), 90 mM NaCl, 0.01% detergente no-iónico en agua destilada. También preparar 3 x tampón de Unión, que contiene los mismos componentes, excepto en tres concentraciones. Si utiliza 3 x buffer de Unión como solución para el 1 x de tampón de Unión, preparar volúmenes > 500 mL; de lo contrario, preparar 250 mL.Nota: Esta composición se ha optimizado para la estabilidad del factor de transcripción y para prevenir la dimerización de glutatión S-transferasa (GST). Medida con la instalación de microscopía describe en el paso 1 el FA de 200 μL de tampón de Unión que contiene 0,8 nM rotulado referencia ADN en presencia de diferente cantidad de TF en una placa de 96 pocillos de vidrio fondo microscopia (wells 5-6 con diferentes concentraciones de TF) al determinar la concentración de TF a utilizar. Realizar una serie de titulación con cantidades crecientes de TF y escoge para el análisis de la concentración para la cual la curva alcanza una meseta, que indica la Unión completa del oligómero de referencia de ADN.Nota: La concentración óptima de TF depende de los valores de las constantes de disociación de la TF-DNA. Generalmente, inferior KDs requieren concentraciones más bajas. 3. oligómero recocido Para templar los oligómeros de ADN de la referencia marcada de DNA (secuencia determinada en el paso anterior), mezcla 7 μl de 10 mM marcado tinte adelante monocatenario DNA solución y 7 μl de una concentración de 10 mM de su complemento reverso sin etiqueta en 186 μl de agua. Para las secuencias de ADN competidor, mezcle 20 μl de las soluciones de 100 mM (en el agua, proporcionado por el fabricante) de ADN adelante con 20 μl de 100 mM de la correspondiente inversa monocatenario DNA para cada secuencia individual del competidor a ser medido. Realizar el recocido por separado en un ciclador PCR estándar calentando las soluciones a 70 ° C por 3 min y disminuyendo la temperatura a una velocidad de 0,1 K/s RT. Si la máquina PCR utilizada no soporta gradientes de temperatura a ese ritmo, simplemente hacer paso a paso incubaciones con la disminución de las temperaturas (probado fueron 99 ciclos de 3 s con K-0,40 por ciclo). 4. gel preparación Nota: La siguiente sección explica la preparación de dos diferentes tipos de geles: 1) los pozos de valoración contienen geles con proteína y se utilizan para determinar el KDs para las secuencias de ADN competidor respectivos, y 2) en los pocillos de calibración hacen uso de NB a determinar la concentración de ADN en cada momento dado punto y adquisición de altura. El foco está en la preparación del experimento en una placa de 96 pocillos, pero también se indican los volúmenes correspondientes para un formato de placa de 384 pozos. Disolver 0.5% agarosa de bajo punto de fusión de w/v en el tampón de Unión hirviendo en el horno de microondas de laboratorio. Después de la completa disolución, ajustar el volumen nuevo con ddH2O para compensar la posible evaporación.Nota: Para mayor comodidad, preparar un balance de 10-20 alícuotas de 10 mL de los geles y los fundir a 75° C cuando son necesarios. Las poblaciones de gel pueden almacenarse a TA.PRECAUCIÓN: Tenga cuidado para evitar el sobrecalentamiento de la solución del gel en el horno de microondas. Corto tiempo de calentamiento entre intervalos con agitación son preferibles. Para preparar la titulación y calibración de los pozos, primero derretir dos alícuotas stock de gel de 10 mL a 75 ° C bajo agitación. Utilizar 240 μl (incluyendo 20% arriba) para cada participante (n = número de secuencias de competidor). Usar el mismo volumen de gel para el pozo de calibración Nota para garantizar una temperatura igual y una viscosidad de ambos geles. Luego ajuste la temperatura a 35 ° C y esperar a que la temperatura se equilibre. Para los pozos de la valoración, añadir 1,4 nM (concentración final) cruzado por hibridación referencia ADN (obtenido en paso 3), proteína TF (concentración final CTF = 20-60 nM, según lo determinado en el paso 2.6), TDT (0,2 mM) y enlace de tampón en un volumen total de μl de n x 200 o n x 13 μL en un 96 – o bien 384 placa formato, respectivamente (más arriba). Mezclar bien agitando invirtiendo / (no agitar con vortex). Lentamente, añada 200 μL por pozo en formato placa de 96 pocillos (13 μL/pocillo de 386 pozos) de la solución gel preparado en el paso anterior en los pozos de la valoración la placa de la pozo. Para los pocillos de calibración, primero agregue 5 nM NB el gel derretido fuera de los pozos (totales volumen dependiendo del formato de placa bien utilizado y en el número de calibración pozos; 5-6 por placa de la pozo suele ser suficiente). Pipetee 200 μl (13 μL para el formato de la placa de 384 pocillos) de NB que contiene gel en los pozos de la valoración de la placa de la pozo y asegurarse de evitar burbujas de aire.Nota: El uso de pipetas de electrónicas o robótica aumenta significativamente la reproducibilidad. Deje que el gel solidifique por 10 min a temperatura ambiente y otro 10 min a 4 ° C (saque condensación el vidrio luego si es necesario). Asegúrese de que para llevar a cabo todos estos pasos sobre una superficie perfectamente horizontal para evitar superficies de gel no homogénea.Nota: Los geles que contienen proteína son generalmente estables durante al menos varias horas a 4 ° C. 5. agregar la solución de ADN competidor Nota: Las siguientes soluciones deben estar preparadas antes de comenzar la valoración y se añaden sobre los pocillos de calibración y valoración al mismo tiempo. Añadir que el recocido etiquetado referencia DNA y proteínas en 3 x de tampón de Unión en 3 veces mayores concentraciones que las alícuotas stock de gel. Mezcla 20 μl de la solución obtenida con 40 μl de cada recocido solución de ADN competidor obtenida en el paso 3. Para cada pocillo de la calibración, mezcla 20 μl de 3 x de tampón de Unión que contiene solución 15 mM NB con 40 μl de recocido competidor ADN (cualquier secuencia de la misma longitud es conveniente).Nota: Para las placas de 384 pozos, utilizar 21 μL en lugar de 60 μL en total. Opcionalmente, comprobar la homogeneidad de los niveles de altura de gel en los diferentes pozos de la placa de espectroscópico midiendo la absorbancia a 380 nm, utilizando un lector de placas de varios pocillos (los valores de absorbancia son proporcionales a las alturas de gel). Añadir 50 μl (μL 7 para el formato de la placa de 384 pocillos) de las soluciones de DNA de competencia mixta (recocido en el paso 3) en la cima de los geles. Trate de añadir todas las soluciones de la competencia al mismo tiempo como sea posible mediante pipeta multicanal electrónica o una cabeza de pipeteo de 96 canales, si está disponible. Después de la adición de las soluciones de la competencia, coloque la placa en la platina del microscopio y comenzar las mediciones inmediatamente (paso 7). 6. adquisición de la imagen Adquirir secuencialmente veces serie de z-pilas (p. ej., uso de 12 planos y 100-300 ms de tiempo de la iluminación). Evitar hacer fotos muy cerca a la superficie bien (< ~1.4 μm con las placas en este documento) para excluir cualquier tendencia de polarización. Realizar ciclos de 10-25 de medidas hasta la completa desvinculación de la DNA de marcada referencia de la TF. El punto final se alcanza normalmente después de 1-2 h, dependiendo de la cinética de Unión y la difusividad del ADN competidor. 7. extracción de FA(z,t) de datos Una vez que se desliza una placa bien computar desde las imágenes de fluorescencia crudo los valores de píxel promedio de componentes de la intensidad de las regiones de interés para el paralelo (I=) y perpendicular (I+) polarizadas (figura 1c). Esto puede hacerse automáticamente utilizando el software de cadera-FA23.Nota: El software de la cadera-FA, un manual de instrucciones y un conjunto de datos de prueba pueden ser descargado23. Alternativamente, utilizar cualquier otro software de medida para extraer= y+ y realizar el análisis aguas abajo de las curvas de titulación, como se describe en detalle más adelante. Calcular FA para cada pozo. Para cada bien, el script calcula FA(z,t) en cada posición de z y punto de tiempo t según:Ecuación 1:Donde G es el instrumento G-factor que corrige cualquier sesgo hacia el canal de la perpendicular. Determinar el factor de G de la configuración del microscopio mediante la medición de la FA de soluciones que contienen un tinte fluorescente de anisotropía conocido. Extraer los componentes dos polarización de la señal y luego utilizar ecuación 1 para obtener G, saber el FA de la solución (G = 1.15 en esta configuración). 8. calibración curva para la determinación de la concentración de ADN competidor de FANB Recueza 120 μl de cada oligómero de referencia hacia adelante y hacia atrás (concentración stock de 100 mM; cualquier secuencia aleatoria con la misma longitud que el competidor secuencia puede utilizarse) y mezclar con 120 μl de 3 x de tampón de Unión que contiene NB (15 nM). Preparar una serie de diluciones con diluciones de 1:2 en 1 x de tampón de unión con las 6 diluciones en total. Mezcle 50 μl de las diluciones con 200 μL de gel de agarosa (T > 35 ° C) de bajo punto de fusión de 0,5% en el 1 x de tampón de Unión que contiene 5 nM de NB en triplicado. Añadir 200 μL de cada una de las 6 soluciones preparadas en el paso anterior en una placa de 96 pocillos y guardar la placa durante 1 h a 4 ° C para asegurar la completa gelificación, luego de 1 h a RT. medida FANota de las soluciones utilizando la configuración de la cadera-FA. Extracto de FANB (z, t) según el paso anterior y ajustar los datos utilizando una ecuación de Hill:Ecuación 2:Donde CADN es la concentración del oligómero de ADN; k la concentración de los oligómeros de ADN en el cual la mitad de los sitios de Unión están ocupados; De FAmax es una constante de normalización; y n es el coeficiente de Hill. k, FAmáxima y n se definen como parámetros libres durante el procedimiento de instalación. Introduzca los tres parámetros obtenidos por el procedimiento de ajuste en el software de la cadera-FA (en el panel inferior izquierdo). Repetir la determinación de la curva de calibración cada pocos meses o después de hacer cambios en la configuración de la microscopia. 9. determinación de las concentraciones de ADN competidor Utilice el software de la cadera-FA para extraer c (z, t) de las mediciones de FANB(z, t) (figura 3). En primer lugar obtener la curva de calibración como se describe en la sección anterior y entrar en los parámetros de conexión al software (ver manual por detalles). Utilice el programa para extrapolar automáticamente c(z,t) para c < 100 nM (véase el manual para más detalles) usando ecuación 3 (figura 3b), que describe la difusión unidimensional del competidor ADN dentro de la matriz de gel de agarosa, asumiendo difusión libre.Ecuación 3:Donde C0 es la concentración inicial del competidor de ADN; ERF es la función de error; z es la posición; D es el coeficiente de difusión del competidor de ADN; y t0 es la hora de inicio de las mediciones. Los parámetros libres utilizados son C0 y z /. 10. convencional valoración competitiva con cadera-FA para el atascamiento de la DNA muy fuerte Diluir en serie los oligómeros de ADN de diferentes competidores en las filas de una placa de 96 pocillos (o placa de 384 pocillos) en las concentraciones de: 0, 1.25, 3,5, 9, 19, 45, 90, 190, 425, 900, 1900 y 4000 nM. Agregar la referencia de marcado con Cy5 ADN (1 nM) y TF (20-50 nM) en una concentración constante, con un volumen total de 200 μL por pozo en tampón de unión (figura 5a). Esperar 40 minutos hasta que se alcance el equilibrio termodinámico y adquirir (con la configuración de la cadera-FA) z-pilas para cada pozo (adquisición de varias imágenes por pozo reduce variabilidad promediando los valores calculados de FA). Construir las curvas de titulación de enlace de equilibrio y ajuste con la ecuación 4 (figura 5b). El s de KDdeterminado por titulación competitivo convencional son idénticos a los obtenidos por HIP-FA usando un gel de agarosa matriz20. 11. montaje de procedimiento de las curvas de titulación de FA Mostrar en el software de la cadera-FA las curvas de titulación reconstruido para las secuencias de cada competidor FA(z,t) = f[c(z,t)] y comprobar visualmente la calidad de los datos (ver manual por detalles). Si es necesario, afinar los parámetros utilizados para la determinación de las concentraciones de ADN competidor en el paso 10. Ajustar cada curva de titulación individual automáticamente utilizando la ecuación 4, que da una solución analítica para la valoración competitiva ensayos24.Ecuación 4:Con:Donde RT es la concentración de proteína; LT es la etiqueta y LST es la marcada concentración de ADN; KD2 es la constante de disociación que se determinen; RT es la concentración de proteína activa; y A y B son parámetros de normalización.En primer lugar determinar KD1, que sirve de referencia para la determinación de los distintos valores de KD2 . Es KD1 puede ser fácilmente determinado con el ensayo escogiendo la secuencia de ADN de referencia de colorante como la secuencia del ADN competidor sin etiqueta (ver manual). Introduzca el valor obtenido de KD1 en el software y calcular los valores de KD2 para todos el competidor ADN en la placa.Nota: Los parámetros libres del procedimiento apropiado son KD2, RT, A y B. Exportación de la constante de disociación KD2 y la concentración de proteína activa RT para todos los pozos de la valoración individual de la placa haciendo clic en el botón “Exportar” en el software. 12. PWM construcción, especificidad de la interacción de la proteína ADN y Pseudo cuentas Crear los logos de secuencia para la Sinuosidal diferentes utilizando la herramienta online WebLogo 3.0 (http://weblogo.threeplusone.com/create.cgi) como se describe anteriormente20.

Representative Results

Se aplicaron las cadera-FA a TFs de la segmentación gene red25,26, que genera el patrón antero-posterior cuerpo de embriones de Drosophila, en gran parte a través de la regulación transcripcional. De esta red, elegimos el bZIP dominio TF gigante (Gt) para un análisis detallado (figura 4). Como factores de transcripción integral son difíciles de expresar y sobre todo las mismas preferencias de enlace como su ADN de dominios (DBD) encuadernación13de rendimiento, se utilizó el DBD fusionados con el GST y expresa el constructo en e. coli GST proteínas de fusión a entregar los mismos resultados que DBD solo20. La secuencia de consenso de Gt (unTTACGTAAC) representa la secuencia de enlace más fuerte que determinamos como se describió anteriormente. Entonces investigamos la influencia de la energía de enlace de todas las posibles mutaciones de un solo punto dentro de la secuencia de consenso de la Gt de 10-mer (un total de 30), flanqueado por bases adicionales en los extremos 5′ y 3′. Medimos dos réplicas cuyas muestras de gel fueron producidos utilizando la automatización y una repetición adicional producido manualmente para la comparación. KDs oscilaron entre 0.6 y > 2000 nM para secuencias mutadas por separado, y también confirmamos la falta total de unión a una secuencia de “no vinculante” (datos no mostrados). Especificidades de Unión TF-ADN normalmente se modelan utilizando una matriz de peso de posición (PWM), en que se asigna una puntuación a cada posible nucleótido en cada posición en el adorno de la Unión. El PWM se supone que cada posición contribuye al enlace fuerza independientemente y en la mayoría de los casos constituye un modelo suficiente para TF enlace Preferencias27. Hemos generado Sinuosidal revisado basado en nuestras mediciones de afinidad siguiente establecido procedimientos28,29 y los compararon con dos Sinuosidal divulgado previamente en la literatura. El primero se basa en conteos de frecuencia de nucleótidos de sitios identificados por ADN huella4,5de Unión, y el segundo PWM se obtuvo seleccionando bacteriana uno híbrido (B1H). 15 La alta semejanza de la Sinuosidal de las tres réplicas (figura 4, panel superior), incluyendo la muestra preparada manualmente (repetición 3), demuestra la alta reproducibilidad del método de cadera-FA. Mientras la Sinuosidal obtenidos por FA de cadera es general similar a la Sinuosidal obtenidos con otros métodos (figura 4, panel inferior), hay desviaciones significativas: en la posición 2 (flecha negra), el comienzo del motivo base bZIP, mutaciones T > (G, C, A) llevar a completa pérdida del atascamiento en el adorno obtenido por HiP-FA, que es coherente con el motivo de B1H pero no con que se obtiene con la huella de la DNasa, en el que la Unión sigue siendo relativamente fuerte de bases (G, A). Por el contrario, en la posición 7 (flecha gris), la mutación T > C conduce a mucho atascamiento más fuerte que lo esperado basado en la Sinuosidal previamente medido. Otras desviaciones son más sutiles pero no menos importante. En general, el PWM de cadera-FA es menos específico que los otros dos, reflejando el hecho de que muchas mutaciones del consenso todavía como resultado vinculante moderadamente fuerte. Esto se puede cuantificar utilizando el contenido de información (IC). El IC es 11,5 pedacitos para la matriz de la cadera-FA (promedio de tres repeticiones), en comparación con el IC = 13,4 bits y bits 16,8 de la huella de DNasa y matrices B1H, respectivamente. Generalmente (aunque no universalmente), la Sinuosidal obtenidos por FA de cadera es menos específicos que los obtenidos por otros métodos, basados en 26 TFs investigaron20. Figura 1:representaciones esquemáticas de la cadera-FA ensayo y montaje experimental. (a) gel sistema para valorar competidor ADN en pozos individuales. (b) configuración de la microscopia cadera-FA. Modificado para requisitos particulares microscopio widefield automatizado con detección de luz de fluorescencia polarizada en un EM-CCD de la cámara. imagen de fluorescencia (c) primas con las dos regiones de interés para determinar el paralelo (rojo) y la perpendicular (verde) polarizado componentes. (d) el típico diseño de una placa de 96 pocillos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2 : FA crudos datos y curvas de titulación reconstruido. (a) trayectoria de FA(z,t) típica para una calibración bien con NB. (b, c) FA(z,t) trayectorias de tiempo para los dos pozos de valoración medición de unión a un fuerte (b) y más moderados (c) ADN vinculante competidor. (d, e) Reconstruir las medidas de valoración de FA y dispone de curvas de fuerte (d) y moderada (e) Unión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3 : Determinar la concentración del competidor ADN c (z, t) con azul de Nilo (NB). (a) curva de calibración FA-concentración de oligómeros de ADN de 16 pares de bases. En una serie de valoración convencionales, NB está incrustado en gel de agarosa con diferentes concentraciones de competidor ADN. La afinidad de NB al ADN es independiente de la secuencia de20; por lo tanto, pueden utilizarse las mismas curvas de calibración para la determinación de c (z, t) para diferentes secuencias de ADN de la misma longitud. (b) competidor ADN perfil tiempo de difusión a una altura arbitraria z determinada cinco pozos de calibración. Para cada ciclo de medición, las FAs promedio de los cuatro pozos que contiene la nota aparecen como puntos blancos. Equipan las curvas usando la ecuación 3 (línea blanca, pozos individuales en color) y la c (z, t) a bajas concentraciones (C < ~ 100 nM) se determina por la curva extrapolada de la guarnición. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4 : Atar las especificidades de la familia de dominio del bZIP TF gigante (Gt). CADERA-FA Sinuosidal de tres repeticiones: dos preparado utilizando la automatización y uno preparado manualmente (panel superior) se comparan con Sinuosidal generado por huella de DNasa y por el método de selección de (B1H) un híbrido bacteriano (panel inferior). En general, los motivos de unión de cadera-FA de acuerdo con los datos anteriores pero también muestran diferencias significativas, como se destacó con flechas negras y grises. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5 : Valoración competitiva convencional con cadera FA. (a) diseño de la placa muestra 8 ADN competidor diferentes en serie diluido en tampón de Unión en una sola fila de una placa de 96 pocillos. Se muestra un mapa de calor FA fortalezas diferentes enlace arbitrario. (b) competitiva titulación de tres competidor DNAs vinculante a la TF Bcd con afinidades diferentes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Cadera-FA es un nuevo método integral para la determinación de los paisajes de preferencia enlace de interacciones TF-DNA. Mide las afinidades de enlace mutacional ADN motivo variantes directamente, evitando cualquier suposición subyacente que preferencias de Unión se reflejan en la frecuencia de ocurrencia de nucleótido en un conjunto de carpetas por encima del umbral. Medición lleva a cabo en la solución sin inmovilización y la interferencia mecánica o química de la reacción de enlace, aproximándose lo más posible las condiciones de equilibrio. El sistema de control permite la medición de una curva de titulación completa en un solo bien y aumenta la fiabilidad y rendimiento mientras se ahorran proteína. Usando un objetivo con una alta apertura numérica y EM-CCD de la cámara con una eficacia alta colección light permite la detección de luz fluorescente muy sensible. Por lo tanto, con esta configuración, FA pequeños cambios tan bajas como 10-15 mP puede detectarse con precisión; en la práctica, esto significa que cualquier reacción de enlace para que fácilmente se detecta el aumento de la masa después de que enlace es mínimo (tan bajo como una relación entre la masa de 2). Esto no suele ser el caso de sistemas comerciales como los lectores de microplacas. Debido a su alta sensibilidad, cadera-FA amplía el rango de constantes de disociación que se puede medir confiablemente en el rango picomolar. Energías de enlace son determinadas con precisión en varios órdenes de magnitud.

Para evaluar la calidad de la Sinuosidal revisada, realizamos dos tipos de análisis20. Para los cinco factores de la red de genes de segmentación, probamos cómo Sinuosidal diferentes puede predecir perfiles de ChIP-seq experimentales en las regiones genómicas de 21 genes de segmentación. Como una segunda prueba, se utilizan un modelo de expresión de secuencia4 que predice patrones de expresión de potenciadores de la segmentación sobre la base de la concentración de preferencia y de la proteína de enlace de TFs participantes. En ambos ejercicios, encontramos que la Sinuosidal de cadera-FA menor realizar significativamente mejor que la huella más específica y B1H Sinuosidal20.

A diferencia de los métodos de novo , cadera-FA requiere algún conocimiento previo de la preferencia de unión de un TF dado. Sin embargo, secuencias de consenso son conocidas por muchos de TFs, y muchos métodos existentes les pueden suministrar13,14,15. Si es necesario, la secuencia de verdadera unión óptima puede encontrarse iterativamente.

Utilizamos oligómeros de referencia de ADN marcado con fluorescencia con Cy5 y Bodipy-650. Estos colorantes han demostrado para realizar bien para mediciones de FA desde la anisotropía de la DNA de referencia etiquetados consolidado y no consolidado fueron el más grande entre los diferentes tintes probados. Esto garantiza un rango dinámico máximo para los valores de FA. En general, cualquier tinte fluorescente con un curso de la vida de la fluorescencia del ≥ 1 ns es probable que sea conveniente pero necesita ser probado primero. Si es posible, se recomienda utilizar colorantes fluorescentes en la gama del cercano-IR para minimizar la autofluorescencia de la proteína.

El paso más crítico del procedimiento experimental es el uso del gel en las placas bien. Buena reproducibilidad requiere los volúmenes de gel tan uniforme como sea posible. Cambios en la altura de gel se traducen en cambios de difusividad para el oligómero competitivo de la ADN y así en evidentes cambios de afinidad al evaluar los datos. Esta es la principal fuente de variación en una repetición de la técnica. El uso de una pipeta o automatización técnicas de electrónica mejora la reproducibilidad. Burbujas de aire en el gel pueden evitarse mediante pipeteo lenta y cuidadosa. También es importante agregar a las soluciones de competidor todos encima de los pozos de la valoración con como poco retraso posible. Para la reproducibilidad mejor, todo el proceso puede ser automatizado usando un robot de pipeteo con incubadoras de calor. Una parte crítica para el protocolo de transferencia a la automatización es la necesaria optimización de la temperatura de la incubadora y los tiempos de incubación. Asegúrese de encontrar un equilibrio óptimo entre la viscosidad del gel (es decir., no demasiado frío) y la estabilidad de las proteínas (es decir, no demasiado caliente). Esto depende tanto de la velocidad de dispensación de los geles en los pozos y la estabilidad de la proteína utilizada.

Cadera-FA hace uso de un sistema de control para los oligómeros de ADN competidor. Para construir las curvas de titulaciones, es necesario determinar el competidor DNA concentración c(z,t) para cada dado z-posición dentro de la matriz de gel y tiempo de punto t. Este es otro paso crítico, puesto que la determinación del KDs depende directamente de c(z,t). Pozos de calibración que contienen el tinte NB como sensor para la concentración de ADN se utilizan para este propósito (figura 1d, figura 2a). Por lo general, son suficientes 3-5 pocillos de calibración que contengan NB por placa. Antes de evaluar cualquier cadera-FA experimento, una curva de calibración de NB debe construirse para la puesta en marcha mediante la realización de una serie de valoración convencional de NB disuelto en el gel de agarosa con un competidor ADN de cualquier secuencia a diferentes concentraciones (figura 3 una), como se explica en detalle en el paso 8. En el caso de unión muy fuerte (KD < 500 pM), la extrapolación utilizada para la determinación de bajas concentraciones de competidor ADN se convierte en limitación, ya que es menos precisa que una medida directa. Sin embargo, para TFs con tan baja KDs, la configuración de la cadera-FA puede utilizarse para realizar una valoración competitiva convencional en tampón de Unión sin el uso de una matriz de gel de agarosa (figura 5). Por ejemplo, una valoración completa con 12 diferentes concentraciones de ADN competidor puede realizarse en una sola fila de una placa de 96 pocillos.

El sistema de control también requiere rápida cinética de unión de TF-DNA y proteínas estables, puesto que la difusión aunque el gel de agarosa es dinámico (aunque lento). Ambas propiedades se pueden probar directamente con la configuración de la cadera-FA siguiendo, con el tiempo, el FA del TFs de interés cuando enlazado a su respectivo etiquetado fluorescente referencia ADN. Medir las tasas de KON yOFF de K de los factores investigados y les a ser del orden de milisegundos a segundos20, según otros estudios30encontrado. Esto es lo suficientemente rápido para asegurar que las medidas tienen lugar en el equilibrio. En el caso de otras reacciones de unión con cinética más lenta, la difusividad del competidor puede ajustarse bajando su concentración o reducir el tamaño del poro del gel. En el caso del prueba TFs, que todos tienen T rápidoapagado (~ segundos), un tiempo de medición total de aproximadamente 1-2 h es suficiente para asegurar el equilibrio termodinámico en cada medición.

Otro posible problema relacionado con la proteína es la formación de agregados proteicos que pueden alterar las mediciones de la FA. El uso de otras condiciones de buffer que contiene diferentes aditivos (como tensioides) puede prevenir la formación de agregados, si es necesario.

Hemos trabajado bajo el supuesto de linealidad del PWM; sin embargo, cadera-FA puede ampliarse para incluir todas las mutaciones posibles di-nucleótido de la secuencia de consenso. Finalmente, cadera-FA puede ser adaptado para medir otros tipos de interacciones de enlace. El requisito es tener disponible una molécula de referencia adecuados vinculados por la proteína que puede etiquetarse con fluorescencia. Con el sistema de control, puede generarse un gradiente de concentración para cualquier tipo de ligando; por lo tanto, las interacciones proteína-proteína y proteína de la droga pueden medirse con semejantemente alta fidelidad y rendimiento.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a J. Müller para clones de cDNA y miembros del laboratorio galo, en particular S. Bergelt, valiosos consejos y animada discusión. Este trabajo fue apoyado por SFB 646, redes de regulación en la expresión del genoma y mantenimiento (C.J., P.B.), el centro para la ciencia de proteínas integrado (U.G.) y la escuela de postgrado de Munich de biociencias cuantitativa (M.S.). U.G. reconoce apoyo de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 646, SFB 1064, CIPSM, QBM), el Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF: ebio – Innovationswettbewerb Systembiologie) y la Fundación Humboldt (Alexander von Humboldt, Cátedra).

Materials

Cy5-labled 16- / 18-bp DNA-oligomers Eurofins Custom synthesis
16- / 18-bp DNA-oligomers Eurofins Custom synthesis
Nile Blue A Sigma N5632-25G
Sensoplate plus microplate 96- or 384-well, PS Greiner 655891 175 µm thick glass bottom
384 Well Sensoplate, black Greiner 788896
Agarose, low gelling temperature Sigma A9414-50G
Sodium Chloride Merck 1.06404.1000
Tween-20 Sigma P1379-1L
Di-Potassium hydrogen phosphate trihydrate Merck 1.05099.1000
Potassium dihydrogen phosphate Merck 1.04873.1000
Q-POD Element Merck Millipore ZMQSP0DE1
Millipak 40 Gamma Gold Filter Merck Millipore MPGL04GK2
Milli-Q Integral 3 Water Purification System Merck Millipore ZRXQ003WW
Quantum TIX Merck Millipore QTUMOTIX1
DL-Dithiothreitol Sigma 43815-1G
Mastercycler gradient Eppendorf Z316083
SafeSeal tube 1.5 mL Sarstedt 72.706.200
Tube 15 mL Sarstedt 62.554.502
Multiply-Pro cup 0.2 mL PP Sarstedt 72.737.002
MICROSCOPY SETUP:
Automated widefield microscope LEICA DMI6000
Long distance objective LEICA HCX PL FLUOAR L 60x/0.60 N.A. Dry
638 nm line continuous diode laser Omicron PHOxX 638-40, 40mW
Back-illuminated EM-CCD Camera Andor iXon DV897
Dichroic mirror AHF 640nm cut-off
Bandpass filter AHF ET bandpass 700/75
Linear polarizer Thorlabs LPVISC050-MP2
Polarizing beam splitter Thorlabs BS010
Achromatic lens Thorlabs 200 mm focal length
Multimode optical fiber Optronis FVP600660710
ROBOTIC SYSTEM:
Our robotic system includes a Biomek NXP workstations with a 96-channel head and with Span-8 pipettors, connected with a servo-shuttle, are used for all liquid transfer steps. In addition, the system is equipped with orbital shakers and a microplate reader (Paradigm, Molecular device) served by the Span-8 gripper Beckman Coulter Biomek NXP
SOFTWARE:
Programming language National Instruments Labview 9.0
Script for the HiP-FA software available at https://github.com/GeneCenterMunich/HiP-FA
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References

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Jung, C., Schnepf, M., Bandilla, P., Unnerstall, U., Gaul, U. High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (144), e58763, doi:10.3791/58763 (2019).
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