Qui vi presentiamo un nuovo metodo per la determinazione dell’affinità di legame all’equilibrio e in soluzione con alta sensibilità su larga scala. Questo migliora l’analisi quantitativa di associazione del DNA di fattore di trascrizione. Il metodo si basa su misure di anisotropia di fluorescenza automatizzato in un sistema controllato di consegna.
Quantificazione accurata del fattore di trascrizione (TF)-interazioni DNA è essenziale per la comprensione della regolazione dell’espressione genica. Poiché gli attuali approcci soffrono di limitazioni significative, abbiamo sviluppato un nuovo metodo per determinare l’affinità di legame di TF-DNA con alta sensibilità su larga scala. Il test si basa sul principio di anisotropia (FA) stabilito fluorescenza ma introduce importanti miglioramenti tecnici. In primo luogo, si misura una curva di titolazione competitivo FA completa in un singolo pozzo incorporando un riferimento fluorescente contrassegnato del DNA in una matrice di gel di agarosio poroso e TF. Senza etichetta oligomero di DNA viene caricato sulla cima di un concorrente e, attraverso diffusione, forma un gradiente spazio-temporali. La pendenza risultante FA viene poi letto utilizzando una configurazione di microscopio epifluorescenza su misura. Questa installazione migliorata notevolmente aumenta la sensibilità di rilevamento del segnale FA, consentendo l’associazione sia debole e forte, da quantificare in modo affidabile, anche per le molecole di simili pesi molecolari. In questo modo, possiamo misurare una curva di titolazione per pozzetto di una piastra multi-pozzetto e attraverso una procedura di montaggio, possiamo estrarre sia la costante di dissociazione assoluta (KD) e la concentrazione di proteina attiva. Testando tutte le varianti di mutazione di punto singolo di un dato consenso vincolante sequenza, noi possiamo indagine il paesaggio di specificità di intera associazione di un TF, in genere su un singolo piatto. Le matrici di peso posizione risultante (PWM) sovraperformare quelli derivati da altri metodi nella predizione in vivo occupazione TF. Qui, presentiamo una guida dettagliata per l’implementazione dell’anca-FA su un microscopio fluorescente automatizzato convenzionale e la pipeline di analisi di dati.
Dato il ruolo centrale di fattori di trascrizione (TFs) nella regolazione genica, determinare le preferenze di associazione in maniera quantitativa è di fondamentale importanza. Seminali studi di von Hippel ha introdotto il concetto che la regolamentazione TFs riconoscere rapidamente DNA, tale che la loro associazione è ben descritto dall’equilibrio termodinamico, mentre gli eventi a valle della RNA polimerasi al promotore di reclutamento sono controllati da più lenta cinetica1. Recenti studi di binding in vivo suggeriscono che questa immagine è probabilmente più complesso2,3; Tuttavia, questi presupposti generali servono come buone approssimazioni e hanno sostenuto molti approcci computazionali per trovare elementi cis-regolatori e predire espressione da sequenze4,5,6. Mentre l’associazione equilibrio così è stato impiegato con successo come un concetto, metodi attuali per determinare interazioni TF-DNA concentrano sull’associazione di specificità e in genere non direttamente misura affinità di legame all’equilibrio. La misurazione sistematica di TF-DNA binding rappresenta una notevole sfida tecnica e i metodi esistenti hanno diverse limitazioni diverse.
Immunoprecipitazione della cromatina seguita da deep sequencing (ChIP-seq)7, la tecnica più diffusa in vivo , non consente la misura dell’affinità di legame o la precisa localizzazione dei siti all’interno di frammenti genomic di legame. Sono in grado di misurare l’affinità di legame, diversi in vitro metodi, tra cui footprinting8DNasi, mobilità elettroforetica (EMSA) Maiusc9, surface plasmon resonance (SPR)10e Microscala submicronica11 ma essi sono relativamente bassa velocità effettiva. Viceversa, non sono in grado di misurare l’affinità di legame e in genere resa eccessivamente tecniche di throughput elevato compreso proteina associazione microarrays12, HT-SELEX13,14e batteriche monoibrido (B1H)15 specifiche sequenze, che è principalmente dovuto alla rigorosa selezione di associazione o fasi di lavaggio necessari. Gli sviluppi più recenti includono il sequenziamento profondo basato HiTS-FLIP16, SELEX-seq17e la base di microfluidica MITOMI18 o sorriso-Seq19, che permettono per l’estrazione di affinità di legame assoluto; Tuttavia, si basano sulla misurazione di intensità di fluorescenza di etichettati TF e DNA. Segnali di fluorescenza, di conseguenza, diventati limitando alle concentrazioni di proteina bassa e nella determinazione di bassi valori di KD (< ~ 10 nM). Inoltre, l'associazione di TF-DNA in questi metodi si svolge su superfici sottili, sollevare questioni con associazione aspecifici e/o auto-fluorescenza background, che lo rende difficile quantificare con precisione l'associazione debole.
Per risolvere queste limitazioni, abbiamo sviluppato un nuovo metodo per determinare i paesaggi di affinità TF-DNA all’equilibrio e in soluzione, che abbiamo chiamato ad alte prestazioni fluorescenza anisotropia (HiP-FA)20. La tecnica è basata sulla fluorescenza stabilito anisotropia (FA) dosaggio21 ma modificata per misurare le costanti obbligatorie con l’alta sensibilità e su larga scala utilizzando un microscopio automatizzato su misura e installazione di analysis.
Il saggio FA monitora l’interazione di specie fluorescente contrassegnati (come un oligomero di DNA) a un partner di associazione, in questo caso un TF, misurando la rotazione molecolare della molecola con etichetta. Legandosi a TF, sua velocità di rotazione diminuisce a causa della maggiore raggio idrodinamico e peso molecolare del complesso associato, che si traduce in FA maggiore. La misura esatta del legame molto forte (KD < ~ 1 nM) richiede l'utilizzo di basse concentrazioni di riferimento etichettato, DNA (c < ~ 1 nM). Questo è difficile da ottenere con uno strumento commerciale come un lettore di micropiastre standard. Inoltre, una differenza di grandi dimensioni (10-100 volte superiore) tra i complessi associati ed è di solito necessaria, che vieta di misurazione delle interazioni tra domini di legame di TF e brevi oligomeri del DNA, che sono in genere di più o meno simili pesi molecolari . Infine, una curva di titolazione completa normalmente richiede la preparazione e misurazione dei pozzi multipli contenenti una serie di concentrazione per le specie di titolazione.
Per risolvere questi problemi, usiamo un setup di microscopia widefield, modificato per ottenere alta sensibilità di rilevazione e consentono misurazioni FA alle z-posizioni diverse di un singolo pozzo. Questo permette di monitorare l’interazione di legame tra specie di simile peso molecolare e con alta affinità. Throughput più elevato si ottiene misurando FA in piastra Multi-ben formati e lo svolgimento di una serie di titolazione intero in un unico bene utilizzando un sistema di erogazione controllato (Figura 1a). Inoltre, impiegando un’analisi di legame competitivo, estraiamo non solo le costanti di associazione, ma anche la concentrazione di proteina attiva. Si tratta di una caratteristica importante del test, poiché solo una parte delle molecole espresse TF sono attivi a causa di degrado o di misfolding proteico. La messa a punto sperimentale si basa su un microscopio a epifluorescenza commerciale dotato di x-y – e Z-piezo stadi. Abbiamo aggiornato il sistema di eccitazione laser esterno, poi rilevato che i due emessi componenti di polarizzazione lineare sul chip di una telecamera EM-CCD con efficienza quantica alta per rilevamento della luce (Figura 1b e c 1). Il sistema utilizza un obiettivo di alta apertura numerica (NA) accoppiato ad un sensore ultra-sensibile e consente in tal modo misure FA altamente sensibili. Tramite la registrazione fluorescenza z-stack, associazione interazioni può essere misurata lungo l’asse ottico z quando si utilizza una matrice eterogenea per i reagenti. Tutte queste modifiche possono essere facilmente implementate su un sistema esistente e sono convenienti.
Ci avvaliamo di un saggio di legame competitivo in cui l’affinità di legame di un oligomero di DNA adenoida è misurato rispetto al DNA fluorescente contrassegnato, che funge da riferimento. TF e riferimento del DNA sono integrate alle concentrazioni fisse in una matrice di gel di agarosio poroso (poro dimensioni ~ 1 µm) che costituisce un ambiente non interagenti per l’associazione. Il riferimento DNA è etichettato con Cy5. Questo colorante ha dimostrato di essere particolarmente adatto per misurazioni FA a causa della sua durata di fluorescenza relativamente lungo (~ 1ns) e l’emissione di fluorescenza nella da’ dello spettro visibile (priorità bassa bassa auto-fluorescenza). La concentrazione di TF è in eccesso molare sopra DNA Cy5-riferimento, assicurando che tutti i riferimento DNA è legato alle proteine. Una soluzione di adenoide concorrente del DNA viene quindi depositata sulla superficie del gel e si diffonde all’interno della matrice porosa, che istituisce un gradiente di concentrazione c (z, t) che cambia sopra il z-posizione del piano focale e tempo t (Figura 1una, Figura 2a-2 c). Il TF associato al DNA di Cy5-riferimento localmente è pertanto esposto a diverse concentrazioni del concorrente del DNA che compete per l’associazione, che conduce a una FA dinamicamente mutevole la Cy5-riferimento DNA FAREF(z, t) (Figura 2b e 2 c).
Per determinare il c(z,t) di concentrazione del concorrente, misuriamo in pozzetti separati (pozzi di calibrazione) la FA dinamicamente mutevole del segnale del Nilo blu (NB) FANB(z, t) (Figura 2una e 3). Questa tintura intercala nel DNA e quindi agisce come un sensore di DNA per il concorrente del DNA. Con questo sistema di erogazione controllato, decine o centinaia di differenti affinità di legame del DNA-proteina possono essere misurate all’interno di una piastra multi-pozzetto (formato piastra 96 o 384 pozzetti). Misurazione viene quindi eseguita in modo sequenziale fino a spostamento completo del riferimento con etichettato DNA da TF. Abbiamo determinato la specificità di legame per un dato fattore misurando le affinità di tutte le mutazioni del singolo-base di 3 N della sequenza consenso di lunghezza N. Anca-FA richiede basse quantità di proteina (~ pmols a curva di titolazione) e spettacoli bassa variabilità nella determinazione di KDs [coefficiente di variazione (CV) < 20%], consentendo misure su scala relativamente ampia. Il metodo può essere effettuato manualmente o completamente automatizzato usando un sistema robotizzato, con conseguente CVs ancora più basso (Figura 4, pannello superiore). Costanti di dissociazione sono misurate con alta precisione fino a 0,5 nM. Per affinità estremamente alta (KD < 500 pM), usiamo una titolazione standard competitiva (Figura 5) a causa di imprecisioni nella misurazione delle concentrazioni di DNA competitore a livelli bassi (< 100 nM).
Anca-FA può essere implementato su quasi qualsiasi standard, invertito, fluorescenti microscopio a epifluorescenza, fornito la disponibilità di un automatizzati XY-palcoscenico e una fase di z-axis di piezo. Componenti ottici sono stati costruiti intorno a un’installazione automatizzata widefield equipaggiata con un obiettivo a lunga distanza. In pratica, il dosaggio può essere adattato agli obiettivi con altre caratteristiche (in particolare lavoro, distanza e apertura numerica). Tuttavia, questo richiede l’ottimizzazione dei parametri (Distanze tra la z-fette, porosità e altezza del gel dell’agarosi, ecc.). È anche possibile l’uso di altri tipi di laser o macchina fotografica. Una descrizione dettagliata della intera procedura sperimentale e analisi dei dati è dato qui sotto nella sezione protocollo.
Anca-FA è un completo nuovo metodo per determinare i paesaggi di preferenza di associazione delle interazioni TF-DNA. Misura affinità di legame di mutational varianti del DNA motivo direttamente, evitando qualsiasi ipotesi che preferenze di associazione vengono riflesse nella frequenza di occorrenza del nucleotide in un set di raccoglitori di sopra-soglia. Misura avviene nella soluzione senza immobilizzazione e interferenza meccanica o chimica con la reazione di associazione, ravvicinamento delle condizioni di equilibrio più fedelmente possibile. Il sistema di erogazione controllato consente la misurazione di una curva di titolazione completa all’interno di un singolo bene e aumenta l’affidabilità e velocità effettiva durante il salvataggio della proteina. Utilizzando un obiettivo con un’apertura numerica elevata ed EM-CCD fotocamera con un’efficienza alta collezione light permette per rivelazione di luce fluorescente altamente sensibile. Quindi, con questa configurazione, piccolo FA cambia in basso come 10-15 mP possono essere rilevate con precisione; in pratica, ciò significa che qualsiasi reazione di associazione per la quale è facilmente rilevato l’aumento di massa dopo l’associazione è minimo (basso quanto un rapporto massa 2). Questo non è solitamente il caso con sistemi commerciali come lettori di micropiastre. Dovuto la relativa alta sensibilità, anca-FA amplia la gamma di costanti di dissociazione può essere attendibilmente nella gamma picomolare. Energie di legame sono determinate con precisione su più ordini di grandezza.
Per valutare la qualità del PWM riveduta, abbiamo effettuato due tipi di analisi20. Abbiamo testato, per cinque fattori della rete genica segmentazione, come ben diversi PWM può prevedere sperimentale ChIP-seq profili nelle regioni genomiche di 21 geni di segmentazione. Come una seconda prova, abbiamo utilizzato un modello di espressione di sequenza4 che predice il pattern di espressione di esaltatori di segmentazione sulla base della concentrazione di preferenza e proteina di associazione di TFs partecipanti. In entrambi gli esercizi, abbiamo trovato che il PWM HiP-FA meno specifici eseguire significativamente migliore rispetto al più specifico dell’impronta e B1H PWM20.
A differenza dei metodi de novo , anca-FA richiede una certa conoscenza preventiva di preferenza di un determinato TF associazione. Tuttavia, sequenze consenso sono noti per molti TFs, e molti metodi esistenti è in grado di fornirli13,14,15. Se necessario, la sequenza di true associazione ottimale si trovano in modo iterativo.
Abbiamo usato gli oligomeri di riferimento DNA fluorescente etichettati con Cy5 e Bodipy-650. Questi coloranti hanno dimostrato di svolgere bene per misurazioni FA poiché l’anisotropia di DNA di riferimento etichettato associato ed erano il più grande tra i diversi coloranti testati. Questo assicura una massima gamma dinamica per i valori di FA. In generale, qualsiasi colorante fluorescente con fluorescenza durata ≥ 1 ns rischia di essere adatto ma ha bisogno di essere testati prima. Se possibile, si consiglia di utilizzare coloranti fluorescenti nella gamma vicino-IR per minimizzare la proteina autofluorescenza.
La fase più critica delle procedure sperimentali è il pipettaggio del gel nei piatti ben. Buona riproducibilità richiede i volumi di gel per essere il più uniforme possibile. Cambiamenti in altezza di gel sono tradotte in modifiche di diffusività per il competitivo oligomero di DNA e quindi in cambiamenti apparenti di affinità quando si valutano i dati. Questa è la fonte principale della varianza in una tecnica replica. L’uso di un tecniche di dispensare o automazione elettronica migliora la riproducibilità. Bolle d’aria all’interno del gel può essere evitata pipettando lento ed accurato. È anche importante aggiungere tutte le soluzioni di concorrente in cima i pozzetti di titolazione con come piccolo ritardo possibile. Per la migliore riproducibilità, l’intero processo può essere automatizzato utilizzando un robot pipettaggio con incubatori di calore. Una parte critica per il trasferimento il protocollo di automazione è necessario ottimizzare temperatura incubatrice e i tempi di incubazione. Assicurati di trovare un equilibrio ottimale tra la viscosità del gel (i. e., non troppo freddo) e la stabilità delle proteine (cioè, non troppo caldo). Questo dipende sia dalla velocità erogazione dei gel in pozzi e stabilità della proteina utilizzata.
Anca-FA fa uso di un sistema di erogazione controllato per gli oligomeri del DNA di concorrente. Per costruire le curve di titolazione, è necessario determinare la concentrazione del DNA a concorrente c(z,t) per ogni dato z-posizione nella matrice del gel e tempo punto t. Questo è un altro passo fondamentale, poiché la determinazione del KDs dipende direttamente da c(z,t). Pozzi di calibrazione contenente il colorante NB come un sensore per la concentrazione di DNA sono utilizzati per questo scopo (Figura 1d, Figura 2a). In genere, 3-5 pozzi di calibrazione contenente NB per ciascuna piastra sono sufficienti. Prima di valutare qualsiasi HiP-FA sperimentare, una curva di calibrazione NB deve essere costruita per il set-up eseguendo una serie di titolazione convenzionale di NB dissolto nel gel dell’agarosi con un concorrente del DNA di qualsiasi sequenza a diverse concentrazioni (Figura 3 un), come spiegato in dettaglio nel passaggio 8. In caso di associazione molto forte (KD < 500 pM), l'estrapolazione utilizzato per la determinazione delle concentrazioni basse di concorrente del DNA diventa limitando, dal momento che è meno accurata rispetto una misura diretta. Tuttavia, per TFs con tale basso KDs, l’installazione di anca-FA utilizzabile per eseguire una titolazione competitiva convenzionale nel buffer di associazione senza l’utilizzo di una matrice di gel di agarosio (Figura 5). Ad esempio, una titolazione completa con 12 differenti concentrazioni di DNA competitore può essere eseguita in una singola riga di una piastra a 96 pozzetti.
Il sistema di erogazione controllato richiede anche veloce cinetica di legame di TF-DNA e proteine stabili, poiché la diffusione anche se il gel dell’agarosi è dinamico (anche se lento). Entrambe le proprietà possono essere testate direttamente con il programma di installazione di anca-FA da seguito, nel corso del tempo, la FA di TFs di interesse quando è associato ai rispettivi fluorescente etichettati riferimento DNA. Abbiamo misurato KON e KOFF tariffe per i fattori indagati e li ho trovati ad essere dell’ordine di millisecondi a secondi20, secondo altri studi30. Questo è sufficientemente veloce per garantire che le misure avvengono all’equilibrio. Nel caso di altre reazioni di associazione con la cinetica più lenta, la diffusività del concorrente può essere sintonizzata abbassando la sua concentrazione o riducendo la dimensione dei pori gel. Nel caso il testata TFs, che tutti hanno veloce TOFF (~ secondi), un tempo di misura totale di circa 1-2 h è sufficiente a garantire l’equilibrio termodinamico a ogni misurazione.
Un altro potenziale problema correlato alla proteina è la formazione di aggregati proteici che possono alterare le misurazioni FA. L’uso di altre condizioni di buffer contenente diversi additivi (come tensioattivi) può impedire la formazione di aggregati, se necessario.
Abbiamo lavorato sotto l’ipotesi di linearità del PWM; Tuttavia, anca-FA può essere scalata per includere tutte le mutazioni possibili di nucleotide della sequenza consenso. Infine, anca-FA può essere adattato per misurare altri tipi di interazione di legame. Il presupposto è quello di avere disponibile una molecola di riferimento adeguati vincolato dalla proteina che può essere etichettata fluorescente. Con il sistema di erogazione controllato, un gradiente di concentrazione può essere generato per qualsiasi tipo di legante; di conseguenza, interazioni proteina-proteina e farmaco-proteina possono essere misurate Analogamente ad alta fedeltà e throughput.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo J. Müller per cloni di cDNA e membri del laboratorio Gallia, in particolare S. Bergelt, per i preziosi consigli e discussione vivace. Questo lavoro è stato supportato da 646 SFB, reti di regolazione nell’espressione del genoma e manutenzione (C.J., P.B.), il centro per la scienza di proteina integrato (U.G.) e la scuola di specializzazione per quantitativi Biosciences Monaco di Baviera (M.S.). U.G. riconosce supporto dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 646, SFB 1064, CIPSM, QBM), il Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF: ebio – Innovationswettbewerb Systembiologie) e la fondazione Humboldt (Alexander von Humboldt, Cattedra).
Cy5-labled 16- / 18-bp DNA-oligomers | Eurofins | Custom synthesis | |
16- / 18-bp DNA-oligomers | Eurofins | Custom synthesis | |
Nile Blue A | Sigma | N5632-25G | |
Sensoplate plus microplate 96- or 384-well, PS | Greiner | 655891 | 175 µm thick glass bottom |
384 Well Sensoplate, black | Greiner | 788896 | |
Agarose, low gelling temperature | Sigma | A9414-50G | |
Sodium Chloride | Merck | 1.06404.1000 | |
Tween-20 | Sigma | P1379-1L | |
Di-Potassium hydrogen phosphate trihydrate | Merck | 1.05099.1000 | |
Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1.04873.1000 | |
Q-POD Element | Merck Millipore | ZMQSP0DE1 | |
Millipak 40 Gamma Gold Filter | Merck Millipore | MPGL04GK2 | |
Milli-Q Integral 3 Water Purification System | Merck Millipore | ZRXQ003WW | |
Quantum TIX | Merck Millipore | QTUMOTIX1 | |
DL-Dithiothreitol | Sigma | 43815-1G | |
Mastercycler gradient | Eppendorf | Z316083 | |
SafeSeal tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.706.200 | |
Tube 15 mL | Sarstedt | 62.554.502 | |
Multiply-Pro cup 0.2 mL PP | Sarstedt | 72.737.002 | |
MICROSCOPY SETUP: | |||
Automated widefield microscope | LEICA | DMI6000 | |
Long distance objective | LEICA | HCX PL FLUOAR L 60x/0.60 N.A. Dry | |
638 nm line continuous diode laser | Omicron | PHOxX 638-40, 40mW | |
Back-illuminated EM-CCD Camera | Andor | iXon DV897 | |
Dichroic mirror | AHF | 640nm cut-off | |
Bandpass filter | AHF | ET bandpass 700/75 | |
Linear polarizer | Thorlabs | LPVISC050-MP2 | |
Polarizing beam splitter | Thorlabs | BS010 | |
Achromatic lens | Thorlabs | 200 mm focal length | |
Multimode optical fiber | Optronis | FVP600660710 | |
ROBOTIC SYSTEM: | |||
Our robotic system includes a Biomek NXP workstations with a 96-channel head and with Span-8 pipettors, connected with a servo-shuttle, are used for all liquid transfer steps. In addition, the system is equipped with orbital shakers and a microplate reader (Paradigm, Molecular device) served by the Span-8 gripper | Beckman Coulter | Biomek NXP | |
SOFTWARE: | |||
Programming language | National Instruments | Labview 9.0 | |
Script for the HiP-FA software available at | https://github.com/GeneCenterMunich/HiP-FA |