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Biochemistry

Haute sensibilité mesure des affinités de liaison de l’ADN-facteur de Transcription par titrage concurrentiel à l’aide de la microscopie en Fluorescence

Published: February 07, 2019
doi:
10.3791/58763
, , , ,
1Gene Center and Department of Biochemistry, Center for Protein Science Munich (CIPSM),Ludwig-Maximilians-Universität München

Summary

Nous présentons ici une nouvelle méthode permettant de déterminer les affinités de liaison à l’équilibre et en solution avec la sensibilité élevée sur une grande échelle. Cela permet d’améliorer l’analyse quantitative de liaison ADN-facteur de transcription. La méthode repose sur des mesures d’anisotropie fluorescence automatisé dans un système de livraison contrôlé.

Abstract

Une quantification précise de facteur de transcription (TF)-interactions ADN est essentiel pour comprendre la régulation de l’expression génique. Étant donné que les approches existantes souffrent de limitations importantes, nous avons développé une nouvelle méthode pour déterminer les affinités de liaison TF-ADN avec la sensibilité élevée sur une grande échelle. Le test repose sur le principe d’anisotropie (FA) de fluorescence établie mais introduit des améliorations techniques importantes. Tout d’abord, nous mesurons une courbe de titrage concurrentiel de FA complet dans un seul puits en y incorporant les TF et une référence fluorescent étiquetée ADN dans une matrice de gel d’agarose poreux. Sans étiquette DNA oligomère est chargé sur le dessus comme un concurrent et, par la diffusion, forme un gradient spatio-temporelle. Le gradient de FA qui en résulte est ensuite donné lecture en utilisant une configuration de microscope épifluorescence personnalisés. Cette configuration améliorée augmente considérablement la sensibilité de détection de signal de FA, ce qui permet une liaison faible et forte à doser fiable, même pour les molécules de poids moléculaires semblables. De cette façon, nous pouvons mesurer une courbe de titrage / puits d’une plaque multipuite, et grâce à une procédure d’ajustement, on peut extraire la constante de dissociation absolue (KD) et la concentration de la protéine active. En testant toutes les variantes de mutation de point unique d’un consensus donné lie séquence, nous pouvons sondage le paysage de spécificité de liaison entière de TF, généralement sur une seule plaque. Les matrices de poids position qui en résulte (PWM) surclassent celles obtenues par d’autres méthodes pour prédire en vivo occupation TF. Nous présentons ici un guide détaillé de mise en œuvre HiP-FA sur un microscope à fluorescence automatisé conventionnel et le pipeline d’analyse de données.

Introduction

Étant donné le rôle central des facteurs de transcription (TFs) dans la régulation des gènes, déterminer leurs préférences de fixation de manière quantitative est d’une importance primordiale. Séminales études par von Hippel a introduit la notion que TFs réglementation reconnaissent rapidement ADN, tels que leur liaison est bien décrite par l’équilibre thermodynamique, tandis que les événements en aval de l’ARN polymérase pour le promoteur de recrutement sont contrôlés par de cinétique plus lente1. En vivo contraignantes des études récentes suggèrent que cette photo est probablement plus complexe2,3; Néanmoins, ces hypothèses générales servent de bonnes approximations et soutiennent plusieurs approches informatiques pour rechercher des éléments cis-régulateurs et prédire l’expression de séquences4,5,6. Alors que l’attache d’équilibre a ainsi été utilisée avec succès comme un concept, les méthodes actuelles de détermination des interactions ADN-TF mettre l’accent sur la spécificité de liaison et généralement ne sont pas directement mesurer les affinités de liaison à l’équilibre. La mesure systématique de la TF-DNA binding représente un défi technique considérable, et les méthodes existantes présentent plusieurs limites différentes.

Immunoprécipitation de la chromatine suivie profond séquencement (ChIP-seq)7, la plus répandue en vivo technique, ne permet pas la mesure des affinités de liaison ou la localisation précise des sites dans les fragments génomiques de liaison. Plusieurs in vitro méthodes, y compris la DNase empreinte8, mobilité électrophorétique Maj (EMSA)9, surface plasmon resonance (SPR)10et micro-échelle thermophorèse11 sont capables de mesurer les affinités de liaison, mais ils sont relativement faible débit. À l’inverse, les techniques à haut débit, notamment des protéines liant microarrays12HT-SELEX13,14et bactérienne un hybride (B1H)15 ne sont pas capables de mesurer les affinités de liaison et généralement céder trop spécifique liant les séquences, qui est principalement due à la sélection rigoureuse ou laver les étapes nécessaires. Développements plus récents incluent le séquençage en profondeur basé HiTS-FLIP16, SELEX-seq17et l’axée sur la microfluidique MITOMI18 ou19de sourire-Seq, qui permettent une extraction des affinités de liaison absolue ; Cependant, ils s’appuient sur la mesure des intensités de fluorescence de TF et d’ADN marqué. Signaux fluorescents, par conséquent, se limitant à des concentrations de faible teneur en protéines et dans la détermination de faibles valeurs de KD (< ~ 10 nM). En outre, la liaison TF-ADN dans ces méthodes se déroule sur une surface mince, soulevant des questions avec liaison non-spécifique et/ou arrière-plan auto-fluorescence, ce qui rend difficile de quantifier précisément la liaison faible.

Pour pallier ces lacunes, nous avons développé une nouvelle méthode pour déterminer les paysages d’affinité TF-ADN à l’équilibre et en solution, que nous avons appelé haute performance fluorescence anisotropie (HiP-FA)20. La technique est basée sur la fluorescence établie anisotropie (FA) dosage21 mais modifiée pour mesurer les constantes de fixation avec la sensibilité élevée et à grande échelle utilisant un microscope automatisé personnalisé et la configuration de l’analyse.

Le dosage de FA surveille l’interaction des espèces fluorescent étiquetés (comme un oligomère d’ADN) à un partenaire de liaison, dans ce cas un TF, en mesurant la rotation moléculaire de la molécule marquée. Lors de la liaison à la TF, sa vitesse de rotation diminue en raison du rayon hydrodynamique plus élevé et le poids moléculaire du complexe lié, qui se traduit par une augmentation FA. La mesure exacte de la très forte liaison (KD < ~ 1 nM) nécessite l’utilisation de faibles concentrations de référence étiquetée, ADN (c < ~ 1 nM). C’est difficile à réaliser avec un instrument commercial tel qu’un lecteur de microplaque standard. En outre, une différence de grande taille (10-100 fois) entre les complexes liées et non liées est habituellement nécessaire, interdisant la mesure des interactions entre domaines de liaison TF et courts oligomères d’ADN, qui sont typiquement des poids moléculaires à peu près semblables . Enfin, une courbe de titrage complet nécessite normalement la préparation et la mesure de plusieurs puits contenant une série de concentration pour les espèces de titration.

Pour résoudre ces problèmes, nous utilisons une configuration de microscope widefield, modifiée pour atteindre la sensibilité de détection élevé et permettent des mesures de FA à z-positions différentes d’un seul puits. Cela nous permet de surveiller les interactions de liaison entre les espèces de poids moléculaire semblable et avec des affinités élevées. Un débit plus élevé est obtenu en mesurant la FA en formats de plaque multipuits et procéder à une série de titrage complet en un seul bien à l’aide d’un contrôle système de livraison (Figure 1a). En outre, grâce à un essai de liaison compétitive, nous avons extrait non seulement les constantes de fixation, mais aussi la concentration de protéine active. Il s’agit d’une caractéristique importante de l’analyse, étant donné qu’une partie des molécules exprimées TF sont actives en raison d’un mauvais repliement des protéines ou de dégradation. Le dispositif expérimental est issu d’un microscope à épifluorescence commercial équipé d’étapes XY et Z-piezo. Nous avons modernisé le système avec excitation laser externe, puis détecté que les deux émis des composantes de la polarisation linéaire sur la puce d’une EM-CCD caméra avec un rendement quantique élevée pour la détection de lumière (Figure 1b et 1C). Le système utilise un objectif de forte ouverture numérique (NA) couplé à un capteur ultrasensible et offre ainsi des mesures hautement sensibles de FA. En enregistrant la fluorescence z-cheminées, les contraignant des interactions peut être mesurée le long de l’axe optique z lors de l’utilisation d’une matrice hétérogène pour les réactifs. Toutes ces modifications peuvent être facilement mises en œuvre sur un système existant et sont rentables.

Nous employons un essai de liaison compétitive dans laquelle l’affinité d’un oligomère d’ADN sans étiquette est mesurée par rapport à l’ADN fluorescent étiqueté, qui sert de référence. TF et référence ADN sont incorporés à des concentrations fixes dans une matrice de gel d’agarose poreux (pore taille ~ 1 µm) qui constitue un environnement sans interaction pour la liaison. La référence ADN est étiqueté avec Cy5. Ce colorant s’est avéré bien adapté pour les mesures de FA en raison de sa durée de vie de fluorescence relativement longue (~ 1ns) et émission de fluorescence dans l’infra-rouge du spectre visible (fond faible auto-fluorescence). La concentration de TF est en excès molaire sur ADN Cy5-référence, veiller à ce que tous les ADN de référence est lié aux protéines. Une solution de concurrent sans étiquette ADN est alors déposée sur la surface du gel et se diffuse à l’intérieur de la matrice poreuse, établir un gradient de concentration c (z, t) qui change sur le z-position du plan focal et du temps t (Figure 1a, Figure 2a-2C). Le TF liaison à l’ADN Cy5-référence est donc localement exposé à différentes concentrations du concurrent ADN qui est en concurrence pour la liaison, conduisant à une FA change dynamiquement de l’ADN de Cy5-référence FAREF(z, t) (Figure 2b et 2C).

Pour déterminer le c(z,t) de concentration concurrent, nous mesurons en puits séparés (puits d’étalonnage), la FA change dynamiquement du signal du Nil bleu (n.-b.), FANB(z, t) (Figure 2un et 3). Ce colorant s’intercale dans l’ADN et agit ainsi comme une sonde d’ADN pour le concurrent de l’ADN. Avec ce système de livraison contrôlé, des dizaines ou des centaines de différentes affinités de liaison des protéines et l’ADN peuvent être mesurées au sein d’une seule plaque multipuite (format de plaque de 96 ou 384 puits). Mesure est ensuite exécutée séquentiellement jusqu’à un déplacement complet de la référence marqué l’ADN de la TF. Nous avons déterminé la spécificité de liaison pour un facteur donné en mesurant les affinités de toutes les mutations de base unique de 3 N de la séquence consensus de longueur N. Hanche-FA nécessite de faibles quantités de protéines (~ pmols par la courbe de titrage) et spectacles à faible variabilité dans la détermination de KDs [coefficient de variation (CV) < 20 %], tout en permettant des mesures à relativement grande échelle. La méthode peut être effectuée manuellement ou entièrement automatisée à l’aide d’un système robotisé, ayant pour résultat encore plus bas CVs (Figure 4, panneau supérieur). Constantes de dissociation sont mesurés avec une grande précision jusqu’à 0,5 nM. Pour une affinité extrêmement élevée (KD < 500 pM), nous utilisons un titrage concurrentiel standard (Figure 5) en raison des imprécisions dans la mesure des concentrations d’ADN aux concurrents à des niveaux faibles (< 100 nM).

Hanche-FA peuvent être mis en œuvre sur presque n’importe quelle norme, inversé, fluorescent microscope à épifluorescence, fourni la disponibilité d’un XY-stade automatisé et une étape d’axe z piezo. Composants optiques ont été construits autour d’une installation automatisée widefield équipée d’un objectif de longue distance. Dans la pratique, le dosage peut être adapté aux objectifs présentant d’autres caractéristiques (dans un travail particulier, distance et ouverture numérique). Cependant, cette technique nécessite optimisation des paramètres (distances entre les z-tranches, la porosité et la hauteur du gel d’agarose, etc..). L’utilisation d’autres types de lasers ou de la caméra est également possible. Une description détaillée de l’ensemble de la procédure expérimentale et analyse des données est donnée ci-dessous dans la section protocole.

Protocol

1. polarisation microscopie Pour un éclairage laser widefield, concentrer une ligne de 638 nm d’un laser diode continu (40 mW) sur l’ouverture de la fibre optique multimode pour nettoyage du faisceau. Monter un polariseur linéaire à la sortie de la fibre pour définir la polarisation de la lumière laser. Bloquer la composante de l’excitation de la lumière émise avec un miroir dichroïque (seuil de 640 nm) et un filtre passe-bande (passe-bande 700/75). Laissez le signal de fluorescence passent par un séparateur de faisceau polarisant, qui fractionne la lumière émise en ses composantes polarisées perpendiculaires et parallèles. Alors, se concentrer le faisceau non réfléchie (composante parallèle) et le faisceau réfléchi (composante perpendiculaire) avec une lentille achromatique de 200 mm de focale sur la puce d’une caméra CCD EM rétro-éclairé (Figure 1b et 1C). Utiliser un miroir pour ajuster la direction du faisceau perpendiculaire vers l’objectif. 2. conception et essais de référence fluorescentes marquées DNA oligomère Déterminer la séquence de base de l’ADN de référence : la méthode est basée sur une analyse concurrentielle qui mesure la constante de dissociation (KD2) entre un facteur de transcription et les oligomères d’ADN concurrent sans étiquette qui est en concurrence pour la liaison avec un ADN fluorescent étiqueté dont affinité à la TF agit comme un références (KD1). La séquence consensus obtenue d’autres sources comme l’empreinte de DNase ou bactérienne 1-hybride peut servir comme un départ point5,15.Remarque : comme une règle, une référence appropriée ADN a un 3 d’ordre 7 diminution de l’affinité de liaison pour la TF par rapport à la séquence consensus. Mesurer par HiP-FA le KD1s de mutations unique provisoires de 2-3 de la séquence consensus dérivé à l’étape précédente. Essayez de muter dans la séquence consensus des positions qui ne sont pas trop spécifiques pour éviter la perte complète de la liaison.Remarque : Il est important que la séquence de référence est liée par le facteur de transcription d’intérêt (nous avons utilisé dans le présent protocole Gt géant), mais pas trop fortement, afin que les concurrents plus faibles il peuvent supplanter à des concentrations élevées. Étendre le motif de base (8-12 paires de base généralement) à une longueur de 16 paires de bases ou plus en ajoutant symétriquement flanquant la séquence de deux côtés (ajouter des chaînes latérales pour la liaison correcte). Si nécessaire (plus longtemps biding domaines, par exemple), utilisez des séquences plus longues (jusqu’à environ 50 paires de base ont été testés avec le test HiP-FA).Attention : Veillez à ne pas d’ajouter les bases qui devraient créer des sites de liaison ectopique. Utiliser des outils informatiques qui permettent de prédire les sites de fixation de PWM disponible pour faciliter ce processus (par exemple, PySite,22). Comme référence étiquetée ADN, oligomères d’ordre qui sont étiquetées fluorescent soit transmettre ou inverser le fil à l’extrémité 3′ ou 5′. Utilisez, par exemple Cy5, Bodipy-650 ou tout autre colorant approprié à une concentration de 10 µM (stock de 10 x 100 µM) dans de l’eau et diluer par étapes comme décrit à l’étape 3.1. Préparer 500 mL de 1 x tampon de liaison en ajoutant un tampon phosphate potassium 33 mM (pH = 7,0), 90 mM NaCl et 0,01 % de détergent non ionique dans l’eau distillée. Aussi préparer 3 x tampon de liaison, qui contient les mêmes composants, sauf à des concentrations triple. Si vous utilisez 3 x tampon de liaison comme solution-mère pour le 1 x tampon de liaison, préparer des volumes > 500 mL ; Sinon, préparer 250 mL.Remarque : Cette composition a été optimisée pour la stabilité de facteur de transcription et de prévenir la dimérisation de glutathion S-transférase (GST). Mesure avec le programme d’installation de microscopie décrite à l’étape 1 la FA 200 µl de tampon de liaison contenant 0,8 nM libellé référence ADN en présence d’une quantité différente de TF dans une plaque de 96 puits de microscopie verre bas (5-6 puits avec différentes concentrations de TF) au déterminer la concentration de TF à utiliser. Effectuer une série de titration avec des quantités croissantes de TF et choisir pour le dosage de la concentration pour laquelle la courbe atteint un plateau, ce qui indique une liaison complète de l’oligomère de référence de l’ADN.Remarque : La concentration optimale de TF dépend des valeurs des constantes de dissociation TF-ADN. En règle générale, inférieure KDs nécessitent des concentrations plus faibles. 3. oligomère recuit Pour recuire les oligomères d’ADN de la référence étiquetée ADN (séquence déterminée à l’étape précédente), mélanger 7 µL d’un colorant marquée de 10 mM vers l’avant simple brin ADN solution et 7 µL d’une concentration de 10 mM de son complément inverse non étiqueté dans 186 µL d’eau. Pour les séquences d’ADN de concurrent, mélanger 20 µL des solutions de 100 mM (dans l’eau, fourni par le fabricant) de l’ADN simple brin avant avec 20 µL de 100 mM de la correspondante inverse simple brin ADN pour chaque séquence de chaque concurrent doivent être mesurés. Effectuer le recuit séparément dans un cycler PCR standard en chauffer les solutions à 70 ° C pendant 3 min et en diminuant la température de la RT à raison de 0,1 K/s. Si la machine PCR utilisée ne supporte pas les gradients de température à ce rythme, il suffit de faire des incubations par étapes avec la température (testés étaient 99 cycles de 3 s avec K-0,40 par cycle). 4. préparation du gel Remarque : La section suivante explique la préparation de deux différents types de gels : 1) les puits de titrage contiennent des gels avec protéine et servent à déterminer le K sDpour les séquences d’ADN de concurrents respectifs, et 2) les puits d’étalonnage utilisent NB à déterminer la concentration d’ADN à chaque hauteur de point et l’acquisition de temps donné. L’accent est mis sur la préparation de l’expérience dans une plaque à 96 puits, mais les volumes correspondants à un format de plaque 384 puits sont également indiqués. Dissoudre 0,5 % p/v bas point de fusion d’agarose dans le tampon de liaison en la faisant bouillir dans un four à micro-ondes de laboratoire. Après dissolution complète, réglez le volume à nouveau avec les ddH2O pour compenser l’évaporation possible.Remarque : Pour plus de commodité, préparation d’un stock de 10-20 mL 10 parties aliquotes de gels et faire fondre à 75° C lorsqu’ils sont nécessaires. Les stocks de gel peuvent être stockés à température ambiante.Attention : Veillez à éviter la surchauffe de la solution de gel dans le four à micro-ondes. Court temps de chauffage avec agitation des intervalles entre les deux sont préférables. Pour préparer les puits de titrage et de calibrage, tout d’abord faire fondre deux 10 mL gel stock parties aliquotes à 75 ° C sous agitation. Utiliser 240 µL (y compris frais généraux de 20 %) pour chaque concurrent (n = nombre de séquences de concurrent). Utilisez le même volume de gel pour le puits de calibration NB pour assurer une température égale et la viscosité des deux gels. Régler la température à 35 ° C, puis attendez que la température de s’équilibrer. Pour les puits de titrage, ajouter 1,4 nM (concentration finale) hybridé référence ADN (obtenu en étape 3), protéine TF (concentration finale CTF = 20-60 nM, tel que déterminé à l’étape 2.6), TNT (0,2 mM) et la liaison de la mémoire tampon dans un volume total de n x 200 µL ou n x 13 µL dans un 96 – ou 384 puits plaque format, respectivement (plus les frais généraux). Mélanger soigneusement en inversant/secouant (ne pas de vortex). Ajouter lentement 200 µL / puits en format de plaque à 96 puits (13 µL/puits puits 386) de la solution de gel préparé à l’étape précédente dans les puits de titrage la plaque bien. Pour les puits de calibration, ajoutez d’abord 5 nM NB au gel fondu à l’extérieur des puits (totales volume selon le format de plaque bien utilisé et le nombre d’étalonnage puits ; 5-6 par plaque puits est généralement suffisant). Pipeter 200 µL (13 µL pour format de plaque 384 puits) du Nouveau-Brunswick contenant un gel lentement dans les puits de titration de la plaque bien et n’oubliez pas d’éviter les bulles d’air.Remarque : L’utilisation des pipettes électroniques ou robotique augmente considérablement la reproductibilité. Laisser le gel se solidifient pendant 10 min à ta et un autre 10 min à 4 ° C (retirer la condensation de la vitre par la suite si nécessaire). Assurez-vous d’effectuer toutes ces étapes sur une surface parfaitement horizontale pour éviter les surfaces gel non homogènes.Remarque : Les gels contenant de la protéine sont généralement stables pendant au moins plusieurs heures à 4 ° C. 5. ajouter la Solution d’ADN concurrent Remarque : Les solutions suivantes doivent être préparées avant de commencer le titrage et sont ajoutées sur le dessus des puits de calibration et de titrage en même temps. Ajouter que le recuit marqué référence ADN et les protéines chez 3 x tampon de liaison à 3 fois les concentrations plus élevées que les aliquotes de stock de gel. Mélanger 20 µL de la solution obtenue avec 40 µL de chaque recuit solution concurrent d’ADN obtenue à l’étape 3. Pour chaque puits de calibration, mélanger 20 µL de 3 x tampon de liaison contenant 15 mM NB solution 40 µl de recuit concurrent ADN (n’importe quelle séquence de même longueur est adapté).Remarque : Pour les plaques 384 puits, utilisez µL 21 au lieu de 60 µL au total. Vous pouvez également vérifier l’homogénéité les niveaux de hauteur de gel dans les différents puits de la plaque par spectroscopie en mesurant l’absorbance à 380 nm, en utilisant un lecteur de plaque multipuits (les valeurs d’absorbance sont proportionnels aux hauteurs de gel). Ajouter 50 µL (7 µL pour format de plaque 384 puits) des solutions d’ADN concurrent mixtes (recuit à l’étape 3) sur le dessus les gels. Essayez d’ajouter toutes les solutions de concurrent aussi simultanément que possible à l’aide de pipettes multicanaux électroniques ou une tête de pipetage de 96 voies, si elles sont disponibles. Après l’addition des solutions concurrent, placer la plaque sur la platine du microscope et commencer les mesures immédiatement (étape 7). 6. Acquisition d’images Séquentiellement acquérir fois série de z-piles (p. ex., utilisation 12 avions et 100-300 ms de temps d’illumination). Éviter de prendre des photos trop près de la surface du bien (< ~1.4 µm avec les plaques utilisées dans les présentes) d’exclure toute partialité de polarisation. Effectuez 10 à 25 cycles de mesures jusqu’à la séparation complète de l’ADN de référence marquée de la TF. Le point de terminaison est généralement atteint après 1-2 h, selon la cinétique de liaison et de la diffusivité du concurrent ADN. 7. extraction des FA(z,t) de données brutes Une fois une plaque puits a été imagée, calculer à partir des images brutes fluorescence les valeurs de pixel moyenne des régions d’intérêt pour le parallèle (I=) et verticalement (I+) polarisées intensité composants (Figure 1c). Cela peut être fait automatiquement à l’aide de la hanche-FA logiciel23.Remarque : Le logiciel HiP-FA, un manuel d’instructions et un ensemble de données de test peuvent être téléchargé23. Également utiliser tout autre logiciel d’écriture personnalisée pour extraire I= et j’ai+ et effectuer l’analyse en aval des courbes de titrage, tel que décrit en détail ci-dessous. Calculer FA pour chaque puits. Pour chaque puits, le script calcule FA(z,t) dans chaque position z et temps point t selon :Équation 1 :Où G est l’instrument de G-facteur qui corrige tout biais vers le chenal perpendiculaire. Déterminer le facteur G de l’installation de microscopie en mesurant la FA de toutes les solutions contenant un colorant fluorescent de l’anisotropie connu. Extraire les composants de deux polarisation du signal et ensuite utiliser l’équation 1 pour obtenir G, sachant la FA de la solution (G = 1,15 dans cette configuration). 8. courbe d’étalonnage pour la détermination de la Concentration d’ADN de concurrent de FANB Recuire 120 µL de chaque oligomère de référence avant et arrière (concentration stock 100 mM ; n’importe quelle séquence aléatoire avec la même longueur que le concurrent séquence peut être utilisé) et mélanger avec 120 µL de 3 x tampon de liaison contenant NB (15 nM). Préparer une série de dilution avec des dilutions de 1:2 en 1 x tampon de liaison avec des 6 dilutions au total. Mélanger 50 µL de ces dilutions avec 200 µL de gel d’agarose (T > 35 ° C) point de fusion bas de 0,5 % en 1 x tampon de liaison contenant 5 nM du NB de réanalysés. Ajouter 200 µL de chacune des 6 solutions préparées à l’étape précédente dans une plaque à 96 puits et stocker la plaque pendant 1 h à 4 ° C pour assurer la complète gélification, puis 1 h à RT. mesure la FANB des solutions à l’aide de la configuration de hanche-FA. Extrait de FANB (z, t) conformément à l’étape précédente et ajuster les données en utilisant une équation de Hill :Équation 2 :Où CADN est la concentration de l’oligomère d’ADN ; k la concentration des oligomères ADN à laquelle la moitié des sites de liaison sont occupés ; FAmax est une constante de normalisation ; et n est le coefficient de Hill. k, FAmax et n sont définies comme paramètres libres au cours de la procédure d’ajustement. Entrer les trois paramètres obtenus à partir de la procédure d’ajustement dans le logiciel HiP-FA (dans le panneau inférieur gauche). Répéter la détermination de la courbe d’étalonnage après quelques mois ou après des changements dans la configuration de la microscopie. 9. détermination des Concentrations d’ADN de concurrent Utilisez le logiciel HiP-FA pour extraire c (z, t) partir des mesures de FANB(z, t) (Figure 3). Tout d’abord obtenir la courbe d’étalonnage comme décrit dans la section précédente et entrez les paramètres d’ajustement du logiciel (voir le manuel pour plus de détails). Utilisez le programme d’extrapoler automatiquement c(z,t) pour c < 100 nM (voir le manuel pour plus de détails) en utilisant l’équation 3 (Figure 3b), qui décrit la diffusion unidimensionnelle du concurrent ADN dans le gel d’agarose, en supposant que diffusion gratuite.Équation 3 :C0 est la concentration initiale du concurrent ADN ; ERF est la fonction d’erreur ; z est la position ; D est le coefficient de diffusion du concurrent ADN ; et t0 est l’heure du départ des mesures. Les paramètres libres utilisés sont C0 et z /. 10. classique titrage concurrentiel avec HIP-FA pour fixation à l’ADN très fort En série de diluer les oligomères d’ADN différents concurrents dans les lignes d’une plaque à 96 puits (ou une plaque 384 puits) aux concentrations de : 0, 1,25, 3.5, 9, 19, 45, 90, 190, 425, 900, 1900 et 4000 nM. Ajoutez la référence étiquetés Cy5 ADN (1 nM) et TF (20 à 50 nM) à une concentration constante, avec un volume total de 200 µL / puits dans le tampon de liaison (Figure 5a). Attendre 40 min jusqu’à ce que l’équilibre thermodynamique est atteint et d’acquérir (avec l’installation de hanche-FA) z-piles pour chaque puits (dispositif acquiert plusieurs images / puits réduit la variabilité en faisant la moyenne des valeurs calculées de FA). Construire les courbes de titrage de liaison équilibre et fixez-les avec l’équation 4 (Figure 5b). KDs déterminée par titration concurrentielle classique sont identiques à ceux obtenus par HIP-FA à l’aide d’un gel d’agarose de matrice des20. 11. procédure des courbes de titrage FA d’ajustement Les courbes de titrage reconstituées pour les séquences de chaque concurrent d’affichage dans le logiciel HiP-FA FA(z,t) = f[c(z,t)] et vérifier visuellement la qualité des données (voir le manuel pour plus de détails). Le cas échéant, préciser les paramètres utilisés pour déterminer les concentrations d’ADN de concurrent à l’étape 10. S’adapter à chaque courbe de titration individuelle automatiquement à l’aide d’équation 4, qui donne une solution analytique pour le titrage concurrentiel essais24.Équation 4 :Avec :Où RT est la concentration de la protéine ; LT est le sans étiquette et LST est la concentration d’ADN marquée ; D2 de la K est la constante de dissociation à déterminer ; RT est la concentration de protéine active ; et A et B sont des paramètres de normalisation.Tout d’abord déterminer KD1, qui sert de référence pour déterminer les différentes valeurs de KD2 . KD1 est peut être aisément déterminée avec le test en choisissant la séquence d’ADN de colorant-référence que la séquence du concurrent sans étiquette ADN (voir manuel). Entrez la valeur obtenue de KD1 dans le logiciel et de calculer les valeurs de KD2 pour tous les concurrents ADN sur la plaque.Remarque : Les paramètres libres de la procédure d’ajustement sont KD2, R,T, A et B. Exporter la constante de dissociation KD2 et la concentration de la protéine active RT pour tous les puits de titration individuelle de la plaque en cliquant sur le bouton « Exporter » dans le logiciel. 12. PWM Construction, spécificité des interactions protéine-ADN et comtes de Pseudo Créer les logos de séquence pour le PWM différents à l’aide de l’outil en ligne WebLogo 3.0 (http://weblogo.threeplusone.com/create.cgi), comme décrit plus haut20.

Representative Results

Nous avons appliqué le HiP-FA à TFs de la segmentation gène réseau25,26, qui génère le modèle corps antéro-postérieur des embryons de drosophile, en grande partie par le biais de la régulation transcriptionnelle. De ce réseau, nous avons choisi le bZIP domaine TF géant (Gt) pour une analyse détaillée (Figure 4). Comme des facteurs de transcription pleine longueur sont difficiles à exprimer et donnent pour la plupart les mêmes préférences de liaison que leur ADN liant domaines (DBD)13, nous avons utilisé le DBD fusionnés avec TPS et exprimé la construction dans les protéines de fusion e. coli GST à fournir les mêmes résultats que seul DBDs20. La séquence consensus Gt (uneTTACGTAAC) représente la séquence de liaison plus forte que nous avons déterminé tel que décrit ci-dessus. Ensuite, nous avons étudié l’influence sur l’énergie de liaison de toutes les mutations de point unique possibles au sein de la séquence Gt 10-mer (un total de 30), flanqué des bases supplémentaires aux extrémités 5′ et 3′. Nous avons mesuré deux répétitions dont échantillons de gel ont été produites à l’aide d’automation et une réplique supplémentaire produites manuellement pour comparaison. Le KDs se situe entre 0,6 nM > 2000 pour les séquences séparément mutées, et nous a également confirmé l’absence totale de se lier à une séquence de « non contraignant » (données non présentées). Spécificités TF-ADN sont généralement modélisées en utilisant une matrice de poids position (PWM), dans lequel un score est attribué à chaque nucléotide possible à chaque position dans le motif de liaison. Le PWM suppose que chaque position contribue à reliure force indépendamment et dans la plupart des cas constitue un modèle suffisant pour TF contraignant préférences27. Nous avons généré PWM révisé basé sur nos mesures d’affinité qui suit établit les procédures28,29 et comparés à deux PWM précédemment rapportées dans la littérature. Le premier est issu des comtes de fréquence de nucléotides des sites identifiés par ADN empreinte4,5de fixation, et le deuxième PWM a été obtenu par la sélection bactérienne un hybride (B1H). 15 La forte similarité de la ce pour les trois répétitions (Figure 4, panneau supérieur), y compris pour l’échantillon préparé manuellement (réplication 3), illustre la grande reproductibilité de la méthode de hanche-FA. Tandis que le PWM obtenue par HiP-FA est globalement semblables à la PWM obtenue avec les autres méthodes (Figure 4, panneau inférieur), il y a des déviations significatives : à la position 2 (flèche noire), le début du motif coeur bZIP, mutations T > (G, C, A) conduire à compléter la perte de la liaison dans le motif obtenu par HiP-FA, qui est compatible avec le motif B1H mais pas avec celle obtenue avec l’empreinte de DNase, dans lequel la liaison reste relativement forte pour bases (G, A). À l’inverse, à la position 7 (flèche grise), la mutation T > C conduit à beaucoup liaison plus forte que ce qui était attendu basé sur le PWM précédemment mesurée. Autres écarts sont plus subtil mais non moins important. Dans l’ensemble, le PWM HiP-FA est moins spécifique que les deux autres, compte tenu du fait que plusieurs mutations du consensus entraînent toujours liaison modérément forte. Cela peut être quantifiée à l’aide du contenu de l’information (IC). L’IC est de 11,5 bits pour la matrice de hanche-FA (moyenne des trois répliques), comparée à IC = 13,4 bits et 16,8 bits pour l’empreinte de la DNase et matrices B1H, respectivement. Généralement (mais pas universellement), le PWM obtenue par HiP-FA est moins précis que ceux obtenus par d’autres méthodes, basées sur 26 TFs enquêté sur20. Figure 1:des représentations schématiques de la hanche-FA test et montage expérimental. b système de livraison gel pour titrer concurrent ADN unique puits. (b) installation de hanche-FA microscopie. Personnalisé de microscope widefield automatique avec détection de lumière de fluorescence polarisée sur un EM-CCD de la caméra. (c) les premières images de fluorescence avec les deux régions d’intérêt utilisé pour déterminer le parallèle (rouge) et la perpendiculaire (vert) polarisé composants. (d) synoptique typique d’une plaque à 96 puits. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 2 : Données brutes FA et courbes de titrage reconstituées. (a) trajectoire de FA(z,t) typique d’un étalonnage cupule contenant NB (b, c) Fa(z,t) les trajectoires de temps pour les deux puits de titrage mesurant la liaison forte (b) et un concurrent de liaison plus modéré (c) DNA. (d, e) Correspondant reconstruit mesures de titration de FA et monté des courbes pour le fort (d) et modéré (e) contraignant. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 3 : Détermination de la concentration du concurrent ADN c (z, t) à l’aide du Nil bleu (n.-b.). (a) courbe d’étalonnage FA-concentration pour 16 oligomères de paires de bases ADN. Dans une série de classiques de titrage, NB est incorporé en gel d’agarose avec différentes concentrations d’ADN de concurrent. L’affinité du NB d’ADN est indépendant de séquence20; par conséquent, les mêmes courbes d’étalonnage peuvent être utilisées pour la détermination de c (z, t) pour des séquences d’ADN différentes de la même longueur. b profil diffusion temps concurrent ADN à un arbitraire z hauteur déterminée à l’aide de cinq puits de calibration. Pour chaque cycle de mesure, le FAs moyen de quatre puits contenant du NB sont affiché comme points blancs. Les courbes sont montés à l’aide de l’équation 3 (ligne blanche, des puits individuels en couleur) et le c (z, t) à de faibles concentrations (C < ~ 100 nM) est déterminé par la courbe extrapolée de raccord. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 4 : Liaison des spécificités de la famille de domaine bZIP TF géant (Gt). HIP-FA PWM de trois répétitions : deux préparés en utilisant automation et un préparé manuellement (panneau supérieur) sont comparées avec la PWM généré par l’empreinte de DNase et par la méthode de sélection un hybride (B1H) bactérienne (panneau inférieur). Dans l’ensemble, les motifs de liaison HIP-FA concordent avec les données précédentes, mais montrent également des différences significatives, comme le souligne avec des flèches noires et grises. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 5 : Classique titrage concurrentiel avec HIP-FA. (a) conception de la plaque montre 8 concurrents différents ADN dilués en série dans le tampon de liaison dans une seule ligne d’une plaque à 96 puits. Une carte de chaleur FA apparaît pour forces de liaison arbitraire différente. (b) concurrentiel titrage des trois concurrents DNAs liant à la TF Bcd avec des affinités différentes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Hanche-FA est une nouvelle méthode complète pour déterminer les paysages de préférence de liaison des interactions ADN-TF. Il mesure des affinités de liaison de mutational ADN motif variantes directement, en évitant toute hypothèse sous-jacente que les préférences de fixation sont reflétées dans la fréquence d’apparition des nucléotides dans un ensemble de liants au-dessus de seuil. Mesure a lieu dans la solution sans immobilisation et d’interférence mécanique ou chimique dans la réaction de liaison, se rapprochant des conditions d’équilibre autant que possible. Le système de livraison contrôlé permet de mesurer une courbe de titrage complet au sein d’un même bien et augmente le débit et la fiabilité tout en économisant des protéines. À l’aide d’un objectif avec une grande ouverture numérique et EM-CCD caméra avec un rendement élevé de collecte lumineuse permet une détection lumière fluorescente hautement sensible. Donc, avec cette configuration, FA petit changements aussi bas que 10-15 mP peut être détectée avec précision ; dans la pratique, cela signifie que toute réaction de liaison dont l’augmentation de la masse après que liaison est minime (aussi bas qu’un rapport de masse des 2) est facilement détectable. Ce n’est généralement pas le cas avec les systèmes commerciaux comme des lecteurs de microplaque. Grâce à sa haute sensibilité, HiP-FA étend la gamme des constantes de dissociation qui peut être évalué de façon fiable dans la gamme picomoles. Énergies de liaison sont déterminés avec précision plusieurs ordres de grandeur.

Pour évaluer la qualité de la PWM révisé, nous avons réalisé deux types d’analyse20. Nous avons testé, pour cinq facteurs du réseau gène segmentation, comment bien différents PWM permet de prédire des profils de ChIP-seq expérimentaux dans les régions génomiques de 21 gènes de segmentation. Un deuxième test, nous avons utilisé un modèle d’expression de la séquence4 qui prédit les profils d’expression des exhausteurs de segmentation sur la base de la liaison préférence et la concentration protéique de TFs participantes. Dans les deux exercices, nous avons constaté que la moins spécifique PWM HiP-FA effectuer beaucoup mieux que l’empreinte plus spécifique et B1H PWM20.

Contrairement aux méthodes de novo , HiP-FA nécessite une connaissance préalable de préférence de liaison de donnée TF. Toutefois, des séquences consensus sont connus pour TFs beaucoup, et beaucoup de méthodes existantes peut leur fournir13,14,15. Le cas échéant, la séquence de la véritable fixation optimale se trouve par itération.

Nous avons utilisé des oligomères de référence ADN fluorescent étiquetés Cy5 et Bodipy-650. Ces colorants sont avérés pour effectuer bien pour les mesures de la FA, l’anisotropie de l’ADN marqué-référence dépendant et indépendant étant le plus important parmi les différents colorants testés. Cela garantit une portée dynamique maximale pour les valeurs de la FA. En règle générale, n’importe quel colorant fluorescent avec une fluorescence lifetime ≥ 1 ns est susceptible d’être adapté mais doit être mis à l’essai d’abord. Si possible, il est conseillé d’utiliser des colorants réagissant dans la gamme de l’infrarouge proche pour minimiser la protéine autofluorescence.

L’étape la plus critique de la méthode expérimentale est le pipetage du gel dans les plats. Bonne reproductibilité exige le gel des volumes être aussi uniformes que possible. Changements de hauteur de gel sont traduites en changements de diffusivité de l’oligomère ADN concurrentiel et donc au changements apparents d’affinité lorsqu’on évalue les données. Il s’agit de la principale source de variance dans une adaptation technique. L’utilisation d’une techniques de pipette ou automatisation électronique améliore la reproductibilité. Bulles d’air dans le gel peuvent être évités en pipettant également, lente et minutieuse. Il est également important d’ajouter les toutes les solutions de concurrent sur le dessus des puits de titrage avec peu de retard que possible. Pour une meilleure reproductibilité, l’ensemble du processus peut être automatisé à l’aide d’un robot de pipetage avec incubateurs de chaleur. La nécessaire optimisation de la température de l’incubateur et les temps d’incubation est essentiel pour le transfert du protocole à l’automatisation. Assurez-vous de trouver un équilibre optimal entre la viscosité du gel (i.e., pas trop froid) et de la stabilité des protéines (c.-à-d., pas trop chaud). Cela dépend à la fois sur la vitesse de distribution des gels dans le puits et la stabilité de la protéine utilisée.

Hanche-FA fait usage d’un système de livraison contrôlé pour les oligomères d’ADN de concurrent. Pour construire les courbes de titrages, il est nécessaire de déterminer la concentration d’ADN concurrent c(z,t) pour chaque donnée z-positionner dans le gel et le point tdu temps. Il s’agit d’une autre étape critique, étant donné que la détermination de KDs dépend directement de c(z,t). Puits de calibration contenant le colorant NB comme un capteur pour la concentration d’ADN sont utilisés à cet effet (dde laFigure 1, Figure 2a). 3-5 puits de calibrage contenant NB par plaque sont généralement suffisants. Avant d’évaluer toute hanche-FA expérimenter, une courbe d’étalonnage NB devrait être construite pour l’installation en exécutant une série de classiques de titrage du NB dissous dans le gel d’agarose avec un concurrent de l’ADN de n’importe quelle séquence à différentes concentrations (Figure 3 un), comme cela est expliqué en détail à l’étape 8. Dans le cas de très forte liaison (KD < 500 h), l’extrapolation utilisée pour la détermination de faibles concentrations de concurrent ADN devient limitant, car il est moins précis qu’une mesure directe. Toutefois, pour TFs avec ce bas KDs, le programme d’installation de hanche-FA peut servir à effectuer un titrage concurrentiel conventionnels dans le tampon de liaison sans l’utilisation d’une matrice de gel d’agarose (Figure 5). Par exemple, un titrage complet avec 12 différentes concentrations d’ADN concurrent peut être effectuée en une seule rangée d’une plaque de 96 puits.

Le système de livraison contrôlé nécessite également les cinétique de liaison rapide TF-ADN et protéines stables, depuis la diffusion si le gel d’agarose est dynamique (bien que lente). Ces deux propriétés peuvent être testées directement avec l’installation de hanche-FA en se conformant, au fil du temps, la FA le TFS d’intérêt lorsqu’elle est liée à leurs respectifs fluorescent étiqueté référence ADN. Nous avons mesuré le taux KON et KOFF pour les facteurs étudiés et les ai trouvés est de l’ordre des millisecondes à secondes20, conformément à d’autres études30. C’est suffisamment rapide pour s’assurer que les mesures se déroulent à l’équilibre. Dans le cas d’autres réactions de liaison avec une cinétique plus lente, la diffusivité du concurrent peut être réglée en abaissant sa concentration ou réduire la taille de pore de gel. Dans le cas de la TSF testées, qui tous ont vite TOFF (~ secondes), un temps de mesure totale d’environ 1-2 h est suffisant pour assurer l’équilibre thermodynamique à chaque mesure.

Un autre problème potentiel lié à la protéine est la formation d’agrégats de protéines qui peuvent altérer les mesures de FA. L’utilisation d’autres conditions de tampon contenant différents additifs (comme tensides) peut empêcher la formation globale, si nécessaire.

Nous avons travaillé dans l’hypothèse de linéarité de la PWM ; Cependant, HIP-FA peut être redimensionnée afin d’inclure toutes les mutations possibles di-nucléotides de la séquence consensus. Enfin, HiP-FA peut être adapté pour mesurer les autres types d’interactions de liaison. Le prérequis est d’avoir une molécule de référence approprié disponible lié par la protéine qui peut être étiquetée fluorescent. Avec le système de livraison contrôlé, un gradient de concentration peut être généré pour tout type de ligand ; par conséquent, interactions protéine-protéine et protéine-médicament peuvent être mesurées de la même façon de haute fidélité et un débit.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions J. Müller de clones d’ADNc et les membres du laboratoire de la Gaule, en particulier S. Bergelt, de précieux conseils et discussion animée. Ce travail a été soutenu par SFB 646, réseaux de régulation dans l’Expression du génome et l’entretien (juge en chef, P.B.), le centre pour Science de la protéine intégrée (UG) et la Graduate School de Munich de Biosciences Quantitative (M.S.). U.G. reconnaît soutenir par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 646, SFB 1064, CIPSM, QBM), le Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF : ebio – Innovationswettbewerb Systembiologie) et la Fondation Humboldt (Alexander von Humboldt, Poste de professeur).

Materials

Cy5-labled 16- / 18-bp DNA-oligomers Eurofins Custom synthesis
16- / 18-bp DNA-oligomers Eurofins Custom synthesis
Nile Blue A Sigma N5632-25G
Sensoplate plus microplate 96- or 384-well, PS Greiner 655891 175 µm thick glass bottom
384 Well Sensoplate, black Greiner 788896
Agarose, low gelling temperature Sigma A9414-50G
Sodium Chloride Merck 1.06404.1000
Tween-20 Sigma P1379-1L
Di-Potassium hydrogen phosphate trihydrate Merck 1.05099.1000
Potassium dihydrogen phosphate Merck 1.04873.1000
Q-POD Element Merck Millipore ZMQSP0DE1
Millipak 40 Gamma Gold Filter Merck Millipore MPGL04GK2
Milli-Q Integral 3 Water Purification System Merck Millipore ZRXQ003WW
Quantum TIX Merck Millipore QTUMOTIX1
DL-Dithiothreitol Sigma 43815-1G
Mastercycler gradient Eppendorf Z316083
SafeSeal tube 1.5 mL Sarstedt 72.706.200
Tube 15 mL Sarstedt 62.554.502
Multiply-Pro cup 0.2 mL PP Sarstedt 72.737.002
MICROSCOPY SETUP:
Automated widefield microscope LEICA DMI6000
Long distance objective LEICA HCX PL FLUOAR L 60x/0.60 N.A. Dry
638 nm line continuous diode laser Omicron PHOxX 638-40, 40mW
Back-illuminated EM-CCD Camera Andor iXon DV897
Dichroic mirror AHF 640nm cut-off
Bandpass filter AHF ET bandpass 700/75
Linear polarizer Thorlabs LPVISC050-MP2
Polarizing beam splitter Thorlabs BS010
Achromatic lens Thorlabs 200 mm focal length
Multimode optical fiber Optronis FVP600660710
ROBOTIC SYSTEM:
Our robotic system includes a Biomek NXP workstations with a 96-channel head and with Span-8 pipettors, connected with a servo-shuttle, are used for all liquid transfer steps. In addition, the system is equipped with orbital shakers and a microplate reader (Paradigm, Molecular device) served by the Span-8 gripper Beckman Coulter Biomek NXP
SOFTWARE:
Programming language National Instruments Labview 9.0
Script for the HiP-FA software available at https://github.com/GeneCenterMunich/HiP-FA
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References

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Jung, C., Schnepf, M., Bandilla, P., Unnerstall, U., Gaul, U. High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (144), e58763, doi:10.3791/58763 (2019).
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