JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

רגישות גבוהה מדידה של שעתוק הזיקות איגוד מקדם-DNA על ידי טיטור תחרותי באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית

Published: February 07, 2019
doi:
10.3791/58763
, , , ,
1Gene Center and Department of Biochemistry, Center for Protein Science Munich (CIPSM),Ludwig-Maximilians-Universität München

Summary

כאן אנו מציגים שיטה לקביעת הזיקות מחייב שיווי משקל ועל בתמיסה עם רגישות גבוהה בקנה מידה גדול. זה משפר את ניתוח כמותי של שעתוק מקדם-DNA מחייב. השיטה מבוססת על מידות חיזקו פלורסצנטיות אוטומטי מערכת מבוקרת.

Abstract

כימות מדויק של גורם שעתוק (TF)-DNA אינטראקציות חיוני להבנת ברגולציה של ביטוי גנים. מאז גישות קיימות סובלים מגבלות משמעותיות, פיתחנו שיטה חדשה לקביעת TF-DNA הזיקות מחייב עם רגישות גבוהה בקנה מידה גדול. וזמינותו מסתמך על העיקרון חיזקו (FA) זריחה הוקמה אך מציגה שיפורים טכניים חשובים. ראשית, אנו מודדים עיקול טיטור תחרותי מלא פא לבאר בודדת על-ידי שילוב TF והפניה fluorescently שכותרתו DNA במטריצה ג’ל agarose נקבובי. אוליגומר DNA ללא תווית טעון על גבי כמתחרה וצורות, באמצעות דיפוזיה, הדרגתי-עתיים. מעבר הצבע פא וכתוצאה מכך הוא אז לקרוא באמצעות מלכודת מיקרוסקופ epifluorescence מותאם אישית. תוכנית התקנה זו משופרת מגדיל מאוד את הרגישות של זיהוי האות פא, המאפשר קשירה חזקים וחלשים כאחד ניתן באופן אמין לכמת, אפילו עבור מולקולות של משקולות מולקולרי דומה. באופן זה, אנו יכולים למדוד עקומת טיטור אחד לכל טוב של צלחת רב טוב, באמצעות הליך מתאים, אנחנו יכולים לחלץ קבוע דיסוציאציה מוחלטת (דK) והן ריכוז חלבון פעיל. על-ידי בדיקת כל מוטציה נקודה אחת הווריאציות של קונצנזוס נתון מחייב רצף, אנחנו יכולים הסקר בנוף ירידה לפרטים הכריכה כולה של TF, בדרך כלל על לוח אחד. מטריצות משקל העמדה המתקבלת (PWMs) לפעול טוב יותר אלה נגזר בשיטות אחרות לניבוי ויוו TF תפוסה. כאן, אנו מציגים מדריך מפורט ליישום היפ-פא מיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומטיות קונבנציונאלי, הצינור ניתוח נתונים.

Introduction

נתון התפקיד המרכזי של גורמי שעתוק (TFs) הכונה, קביעת ההעדפות שלהם מחייב בצורה כמותית היא בעלת חשיבות עליונה. מחקרים הזרע על ידי פון היפל הציג את הרעיון שלא שר רגולטוריות לזהות במהירות ה-DNA, כך שלהם מחייב ובכן מתואר על ידי שיווי משקל תרמודינמי, בזמן האירועים במורד הזרם של גיוס RNA פולימראז כדי האמרגן נשלטות על-ידי קינטיקה איטי1. מחקרים שנעשו לאחרונה ויוו איגוד מציע כי התמונה הזאת הוא סביר יותר מורכב2,3; יחד עם זאת, הנחות כלליות אלה לשמש הערכות טוב, תומך גישות חישובית רבות כדי למצוא אלמנטים cis-רגולציה ולחזות ביטוי מ רצפי-4,–5,–6. בזמן שיווי משקל מחייב ולכן ננקטה בהצלחה כמושג, שיטות לקביעת TF-DNA אינטראקציות להתמקד מחייב ירידה לפרטים ואינם בדרך כלל ישירות מידה מחייב הזיקות על שיווי משקל. המדידה השיטתית של TF-DNA איגוד מייצג אתגר טכני משמעותי, ויש שיטות קיימות מספר מגבלות שונות.

Immunoprecipitation כרומטין ואחריו עמוק רצף (צ’יפ-seq)7, הנפוצות ביותר ויוו הטכניקה, אינו מתיר את המדידה של איגוד הזיקות או לוקליזציה מדויק של איגוד אתרי בתוך שברי גנומית. במספר במבחנה שיטות כולל DNase footprinting8, electrophoretic ניידות shift (EMSA)9, משטח פלזמון תהודה (SPR)10ו- microscale thermophoresis11 מסוגלים למדוד את הזיקות האיגוד, אבל הם תפוקה נמוכה יחסית. לעומת זאת, טכניקות תפוקה גבוהה כולל מיקרו-מערכים של איגוד חלבון12,13,HT-SELEX14אחד-היברידית חיידקי (B1H)15 אינם מסוגלים למדוד את הזיקות מחייב, בדרך כלל תשואות יתר על המידה ספציפית האיגוד רצפים, וזה בעיקר בזכות הבחירה מחמירים או לשטוף את הצעדים הדרושים. פיתוחים מאוחרים יותר כוללים רצף עמוק מבוסס ה-להיטים-FLIP16, SELEX-seq17, לבין MITOMI מבוססי מיקרופלואידיקה18 או חיוך-Seq19, אשר מאפשרים לחילוץ של הזיקות איגוד מוחלט; עם זאת, הם מסתמכים על מדידת עוצמות קרינה פלואורסצנטית שכותרתו TF ודנ א. קרינה פלואורסצנטית אותות, לכן, להיות הגבלת בריכוזים נמוכים חלבון, בקביעת ערכי KD נמוכה (< ~ 10 ננומטר). יתר על כן, האיגוד TF-DNA בשיטות האלה מתקיים על משטחים דקים, העלאת בעיות עם איגוד לא ספציפי ו/או רקע אוטומטי-זריחה, מה שהופך את זה קשה לכמת במדויק את איגוד חלש.

כדי לטפל מגבלות אלה, פיתחנו שיטה חדשה כדי לקבוע נופים זיקה TF-DNA שיווי משקל ועל בפתרון, שאנו קוראים להם ביצועים גבוהים פלורסצנטיות חיזקו (היפ-פא)20. הטכניקה היא מבוססת על assay חיזקו (FA)21 קרינה פלואורסצנטית הוקמה אך שונה כדי למדוד איגוד קבועים עם רגישות גבוהה, בקנה מידה גדול באמצעות מיקרוסקופ אוטומטי מותאם אישית ניתוח ההתקנה.

וזמינותו פא מנטרת את האינטראקציה של מינים fluorescently שכותרתו (כמו אוליגומר דנ א) שותף מחייב, במקרה זה TF, על ידי מדידת הרוטציה מולקולרית של המולקולה שכותרתו. על קשירה TF, מהירות הסיבוב שלה יורדת עקב רדיוס hydrodynamic גבוה יותר משקל מולקולרי של המתחם מאוגד, דבר המתבטא פא מוגברת. המדידה מדויק של איגוד חזק מאוד (KD < ~ 1 ננומטר) מחייב שימוש ריכוזים נמוכים של הפניה שכותרתו, ה-DNA (c < ~ 1 ננומטר). זה קשה להשיג עם מכשיר מסחרי כגון קורא microplate רגיל. בנוסף, שינוי גודל גדול (10-100 קיפול) בין מתחמי המאוגדים והלא מאוגדים הוא בדרך כלל הכרחי, האוסר על מדידה של אינטראקציות בין TF מחייב תחומים קצר oligomers הדנ א, אשר בדרך כלל של משקולות מולקולרית בערך דומה . לבסוף, עיקול טיטור מלא בדרך כלל דורש הכנה של מדידה של מספר בארות המכיל סידרה ריכוז עבור המין titrating.

כדי לטפל בבעיות אלה, אנו משתמשים מלכודת מיקרוסקופ widefield, שונה כדי להשיג איתור רגישות ולאפשר מדידות ה-FA ב- z-עמדות שונות של באר בודדת. זה מאפשר לנו לעקוב אחר מחייב אינטראקציות בין מינים של משקל מולקולרי דומה ועם הזיקות גבוהה. תפוקה גבוהה יותר מושגת על ידי מדידת פא בתוך צלחת טוב מרובה תבניות, בביצוע סדרות טיטור כל יחיד טוב תוך שימוש מבוקר משלוח במערכת (איור 1). יתר על כן, על ידי שימוש assay איגוד תחרותיים, אנחנו לחלץ לא רק הקבועים מחייב, אלא גם את הריכוז של חלבון פעיל. זוהי תכונה חשובה של וזמינותו, שכן רק חלק ביטוי TF מולקולות פעילים חלבון misfolding או השפלה. הגדרת הניסוי מבוסס על מיקרוסקופ epifluorescence מסחריים המצוידים XY – ו Z-piezo בשלבים. אנחנו לשדרג את המערכת עם לייזר חיצוני עירור, ואז זיהה שהשני הנפלטים קיטוב לינארי רכיבים על השבב של מצלמת EM-CCD עם נצילות קוונטית גבוהה לגילוי אור (איור 1b ו- 1 c). המערכת משתמשת יעד מפתח נומרי גבוהה (NA) מצמידים חיישן רגיש במיוחד, ובכך ונותנת לו מדידות פא רגישה מאוד. על ידי רישום פלורסצנטיות z-במחסן, איגוד אינטראקציות ניתן למדוד לאורך ציר z אופטי בעת שימוש במטריצה הטרוגנית עבור שני המגיבים. כל השינויים הללו ניתן ליישם בקלות על מערכת קיימת, חסכונית.

אנו מעסיקים וזמינותו של איגוד תחרותיים שבו נמדד בזיקה איגוד של אוליגומר ללא תווית ה-DNA לעומת ה-DNA fluorescently שכותרתו, אשר משמש כהפניה. TF והפניה DNA משולבים בריכוזים קבוע במטריצה ג’ל agarose נקבובי (נקבובית גודל ~ 1 מיקרומטר) המהווה סביבה ללא אינטראקציה עבור האיגוד. ההפניה DNA מסומן עם Cy5. צבע זה התבררה מתאים היטב פא מדידות בשל תקופת חייו פלורסצנטיות ארוכות יחסית (~ 1ns) ואת פליטת קרינה פלואורסצנטית ב מרחיקת אדום של הספקטרום הנראה (auto נמוך-ידי קרינה פלואורסצנטית רקע). ריכוז TF היא טוחנת עודף מעל DNA Cy5-הפניה, ולהבטיח כי כל התייחסות DNA מאוגד חלבון. פתרון של תווית מתחרה DNA ואז נצבר על פני ג’ל ו מפזרת בתוך המטריקס נקבובי, הקמת הדרגתי ריכוז c (z, t) ומשתנה במשך את z-העמדה של מטוס מוקד, בזמן t (איור 1, איור 2-2 c). TF מאוגד ל- DNA Cy5-התייחסות ולכן חשוף באופן מקומי ריכוזים שונים של המתחרה DNA מתחרה עבור איגוד, המוביל אל פא בשומר דנ א Cy5-הפניה פאREF(z, t) (איור 2b ו- 2 c).

כדי לקבוע את c(z,t) ריכוז המתחרה, אנו מודדים בבארות נפרד (כיול וולס) אות הפא באופן דינמי המשתנה של הנילוס הכחול (NB) פאNB(z, t) (איור 2ו- 3). צבע זה intercalates לתוך ה-DNA, ובכך משמש חיישן ה-DNA עבור המתחרה הדנ א. עם מערכת מבוקרת זו מסירה, ניתן למדוד עשרות למאות הזיקות מחייב חלבון-דנ א שונים בתוך לוח רב טוב אחד (96 – או 384-ובכן צלחת תבנית). המדידה מתבצעת ואז ברצף עד תזוזה מוחלטת של ההפניה שכותרתו DNA מ TF. אנחנו נקבע יחודיות מחייב עבור גורם נתון על ידי מדידה של הזיקות של 3 N כל יחיד-בסיס מוטציות של רצף קונצנזוס באורך N. היפ-פא דורשת כמויות נמוכות של חלבון (~ pmols לפי עקומת טיטור) מראה השתנות בקביעת K sD[מקדם של וריאציה (CV) < 20%], תוך מתן אפשרות מדידות בקנה מידה גדול יחסית נמוך. השיטה יכול להתבצע באופן ידני או באופן מלא אוטומטית באמצעות מערכת רובוטית, וכתוצאה מכך CVs אפילו פחות (איור 4, החלונית העליונה). קבועי דיסוציאציה נמדדים עם רמת דיוק גבוהה עד 0.5 ננומטר. עבור הזיקות גבוהה מאוד (KD < 500 pM), אנו משתמשים טיטור תחרותי סטנדרטי (איור 5) עקב אי דיוקים מדידת ריכוזים מתחרה DNA ברמות נמוכות (< 100 ננומטר).

יכול להיות מיושם על כמעט בכל קנה מידה, הפוכה, מיקרוסקופ פלואורסצנטי epifluorescence, סיפק את הזמינות של שלב-תרשימי XY אוטומטיים ו שלב ציר z piezo היפ-פא. רכיבים אופטיים נבנו סביב התקנה אוטומטית widefield מצויד עם מטרה למרחקים ארוכים. בפועל, וזמינותו ניתן להתאים מטרות עם מאפיינים אחרים (ב עבודה מסוימת, מרחק ו מפתח נומרי). עם זאת, זה דורש אופטימיזציה של הפרמטרים (המרחקים בין z-פרוסות, נקבוביות וגובה agarose ג’ל, וכו ‘.). השימוש של סוגים אחרים של לייזרים או מצלמה אפשרי גם כן. תיאור מפורט של כל התהליך ניסיוני, ניתוח נתונים ניתנת להלן בסעיף פרוטוקול.

Protocol

1. קיטוב מיקרוסקופ לתאורת לייזר widefield, למקד את קו nm 638 של לייזר דיודה רציפה (40 mW) על הצמצם של סיב אופטי כינוייהם עבור קרן ניקוי. הר מקטב ליניארי על הפלט של הסיבים כדי להגדיר את קיטוב של אור לייזר. לחסום את הרכיב עירור של האור הנפלט עם מראה ודיקרואיק זוהר (ניתוק nm 640), מסנן bandpass (bandpass 700/75). תן את האות פלורסצנטיות לעבור דרך מפצל קרן מהפכנית, אשר מתפצל האור הנפלט מרכיביו מקוטב בניצב ומקבילי. לאחר מכן, מתמקדים הקרן-משוקף (רכיב מקביל), קרן משתקף (רכיב בניצב) עם עדשה אכרומטית של 200 מ”מ אורך מוקד השבב של מצלמה EM-CCD בחזרה מואר (איור 1b ו- 1 c). להשתמש במראה כדי להתאים את הכיוון של הקורה בניצב לכיוון העדשה. 2. תכנון ובדיקות של הפניה מתויג פלורסנט DNA אוליגומר לקבוע את רצף הליבה של ההפניה DNA: השיטה מבוססת על assay תחרותי המודד את קבוע דיסוציאציה (KD2) בין גורם שעתוק DNA מתחרה ללא תווית אוליגומר מתחרה עבור איגוד עם fluorescently תוויות הדנ א של מי זיקה TF משמש הפניות (KD1). רצף קונצנזוס ממקורות אחרים כמו DNase footprinting או 1-היברידית חיידקי יכול לשמש5,נקודת המוצא15.הערה: כפי כלל אצבע, הפניה מתאימה הדנ א 3 כדי 7-fold הדירי זיקה מחייבת TF בהשוואה את רצף קונצנזוס. מדוד על ידי היפ-פא KD1s של 2-3 מוטציות יחיד לא סופית של רצף קונצנזוס נגזר בשלב הקודם. נסה להפוך למוטציות בתפקידים רצף הסכמה שאינם ספציפיים מדי כדי למנוע אובדן מוחלט של האיגוד.הערה: חשוב כי הרצף הפניה נמדד על ידי הגורם שעתוק של עניין (השתמשנו בפרוטוקול זה Gt ענק), אך לא חזק, כך המתחרים חלשים יכולים לגבור זה בריכוזים גבוהים. להרחיב את מוטיב הליבה (8-12 לבסס זוגות בדרך כלל) לאורך של 16 בסיסי זוגות או יותר על-ידי הוספת באופן סימטרי איגוף רצף ב הצדדים (להוסיף שרשראות צד לכריכה נאותה). במידת הצורך (יותר מושך תחומים, לדוגמה), להשתמש רצפים ארוכים (עד ~ 50 זוגות בסיס אורך נבדקו עם וזמינותו היפ-פא).זהירות: היזהרו לא להוסיף בסיסים שצפוי ליצור אתרי קישור חוץ רחמי. השתמש כלים חישוביים לחזות אתרי קישור מ- PWMs זמין כדי להקל על התהליך (למשל, PySite22). התייחסות שכותרתו דנ א, oligomers סדר המסומנות fluorescently על העבר או הפוך גדיל בקצה 3′ או 5′. להשתמש, לדוגמה Cy5, Bodipy-650 או כל צבע מתאים אחרים-ריכוז של 10 מיקרומטר (מיקרומטר 100 10 x מניות) במים, ורכים stepwise כפי שמתואר בשלב 3.1. הכנת 500 מ של 1 x מחייבת מאגר על-ידי הוספת 33 מ מ אשלגן פוספט מאגר (ה-pH = 7.0), 90 מ מ NaCl, ו- 0.01% דטרגנט ללא יונית במים מזוקקים. גם להכין 3 x מאגר איגוד, אשר מכיל את המרכיבים אותן, למעט בריכוזים המשולשת. אם משתמש 3 x מחייבת מאגר כפתרון מניות עבור 1 x מחייבת מאגר, להכין אמצעי אחסון > 500 מ”ל; אחרת, להכין 250 מ.הערה: את היצירה היה מותאם ליציבות פקטור שעתוק וכדי למנוע גלוטתיון S-טרנספראז (GST) dimerization. למדוד עם הגדרת מיקרוסקופ המתוארים שלב 1 הפא של 200 µL מחייב מאגר המכיל 0.8 nM המסומנת בתווית הפניה דנ א בנוכחות כמות שונה של TF בצלחת זכוכית התחתון מיקרוסקופ 96-ובכן (5-6 בארות עם ריכוזים שונים של TF) כדי לקבוע את הריכוז TF לשימוש. לבצע סדרה טיטור עם הגדלת כמויות של TF ולבחור עבור וזמינותו הריכוז עבורו עקומת מגיע מישור, המציין איגוד מלאה של אוליגומר ההפניה ה-DNA.הערה: ריכוז TF האופטימלי תלוי הערכים של קבועי דיסוציאציה TF-DNA. באופן כללי, K נמוךDs דורשים ריכוז נמוך יותר. 3. אוליגומר חישול כדי anneal את oligomers הדנ א של ההפניה שכותרתו DNA (רצף שנקבע בשלב הקודם), מערבבים 7 µL 10 מ מ, התווית על-ידי צבע לפנים חד גדילי DNA פתרון ו µL 7 של ריכוז 10 מ מ של המשלים שלו הפוכה ללא תווית ב 186 µL של מים. עבור רצפי דנ א המתחרה, לערבב 20 µL של פתרונות 100 מ מ (במים, המסופקים על ידי היצרן) של קדימה דנ א חד גדילי עם µL 20 מ”מ של השדות המקבילים הפוכה חד גדילי ה-DNA של כל רצף זכיות בודדים כדי למדוד. לבצע את חישול בנפרד ב הצנטרפוגה PCR רגיל על ידי חימום פתרונות 70 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות ו הפחתת הטמפרטורה RT בשיעור של 0.1 K/s. אם המכונה PCR נעשה שימוש אינו תומך מעברי צבע הטמפרטורה בקצב הזה, פשוט לעשות stepwise incubations עם הפחתת טמפרטורות (שנבדקו היו 99 מחזורי 3 לשנייה עם-0.4 K בכל מחזור). 4. ג’ל הכנה הערה: הסעיף הבא מסביר את הכנת שני סוגי ג’לים שונים: 1) הבארות טיטור מכילים ג’לים עם חלבונים משמשים כדי לקבוע את KDs עבור רצפי דנ א המתחרה המתאימים ואת 2) הבארות כיול לעשות שימוש NB כדי לקבוע את ריכוז הדנ א בגובה נקודת ורכישה בכל זמן נתון. הדגש הוא על הכנת הניסוי בצלחת 96-ובכן, אך יצוינו גם אמצעי האחסון המתאים עבור תבנית צלחת 384-. טוב. להמיס 0.5% w/v נקודת התכה נמוכה agarose במאגר של הכריכה על ידי הרתחה זה תנור מיקרוגל מעבדה. לאחר התפרקות מוחלטת, לכוונן את עוצמת הקול שוב עם ddH2O כדי לפצות על אידוי אפשרי.הערה: לנוחיותכם, להכין מלאי של 10-20 מ”ל aliquots היחסי של ג’ל, להמיס אותם ב 75 מעלות צלזיוס, כאשר הם נדרשים. ג’ל מניות שניתן לאחסן ב- RT.התראה: הקפד להימנע superheating של הפתרון ג’ל במיקרוגל. קצר זמן חימום מרווחי ברעידות בין עדיפים. כדי להכין טיטור וכיול בארות, להמיס קודם מניות-aliquots שני של 10 מ ל ג’ל, ב 75 ° C תחת רועדת. השתמש µL 240 (כולל 20% תקורה) עבור כל אחד מהמתחרים (n = מספר רצפי המתחרה). השתמש באותו אמצעי אחסון של ג’ל על הבאר כיול NB כדי להבטיח של טמפרטורה שווה, צמיגות של שני ג’לים. לאחר מכן להגדיר את הטמפרטורה עד 35 ° צלזיוס, מחכה לטמפרטורה equilibrate. בשביל הבארות טיטור, להוסיף nM (ריכוז סופי) hybridized 1.4 הפניה DNA (שלב שהושג ב 3), חלבון TF (הריכוז הסופי CTF = 20-60 ננומטר, כפי שנקבע בשלב 2.6), DTT (0.2 מ מ), ואיגוד מאגר ב הנפח הכולל של n x 200 µL או µL n x 13 בשנת 96 – או 384-ובכן צלחת תבנית, בהתאמה (בתוספת תקורה). לערבב ביסודיות על ידי היפוך/רועד (לעשות לא מערבולת). לאט לאט להוסיף µL 200 לאדם טוב בתבנית 96-ובכן צלחת (13 µL/טוב של בארות 386) של הפתרון ג’ל מוכן בשלב הקודם לתוך הבארות טיטור את הצלחת היטב. בשביל הבארות כיול, להוסיף 5 nM NB לג’ל מומסת מחוץ הבארות (סכום נפח בהתאם לתבנית צלחת טוב בשימוש על המספר של כיול בארות; בד כ 5-6 לכל צלחת טוב זה מספיק). פיפטה 200 µL (13 µL עבור תבנית 384-ובכן צלחת) של NB המכיל ג’ל באיטיות בתוך הבארות טיטור צלחת טוב, לוודא למנוע בועות אוויר.הערה: השימוש pipets אלקטרונית או רובוטיקה מגדיל באופן משמעותי הפארמצבטית. . תן את הג’ל לחזק 10 דקות ב RT, עוד 10 דקות ב 4 ° C (להסיר עיבוי הזכוכית לאחר מכן במידת הצורך). ודא לנהל את כל הצעדים הללו על משטח אופקי לחלוטין כדי להימנע inhomogeneous ג’ל משטחים.הערה: ג’ל המכיל חלבונים יציבים בדרך כלל לפחות מספר שעות-4 מעלות צלזיוס. 5. הוספת הפתרון מתחרה DNA הערה: הפתרונות הבאים צריך להיות מוכן לפני שמתחילים טיטרציה, נוספות על הבארות טיטור וניסוי בו זמנית. הוסף ש-annealed שכותרתו הפניה DNA וחלבון 3 x מחייבת מאגר ב 3 פעמים ריכוז גבוה יותר aliquots מלאי ג’ל. µL מיקס 20 של הפתרון שהושג עם 40 µL של כל אחד annealed מתחרה DNA הפתרון שהושג בשלב 3. במשך כל כיול, מערבבים µL 20 של 3 x מחייבת מאגר המכיל 15 מ מ NB פתרון עם 40 µL של annealed מתחרה DNA (כל רצף באותו האורך מתאים).הערה: עבור לוחות 384-ובכן, יש להשתמש 21 µL במקום 60 µL סך הכל. לחלופין, סמן את ההומוגניות של רמות גובה ג’ל הבארות שונים של הצלחת spectroscopically על ידי מדידת את ספיגת-380 nm, שימוש בקורא צלחת רב טוב (הערכים ספיגת הם יחסיים הגולן ג’ל). להוסיף 50 µL (7 µL עבור תבנית 384-ובכן צלחת) הפתרונות המתחרה מעורב דנ א (annealed בשלב 3) על גבי ג’לים. נסה להוסיף את כל הפתרונות המתחרה בו זמנית ככל האפשר באמצעות pipets רב-ערוצי אלקטרונית או ראש pipetting 96-ערוץ, אם זמין. לאחר תוספת של הפתרונות המתחרה, למקם את הצלחת על הבמה מיקרוסקופ ולהתחיל את המידות מיד (שלב 7). 6. ייבוא תמונות לרכוש ברצף פעמים סדרת z-ערימות (למשל, שימוש 12 מטוסים ו- ms 100-300 של זמן תאורה). למנוע לקיחת תמונות קרוב מדי אל פני השטח טוב (< ~1.4 מיקרומטר עם הגלופות המשמשות בתקנון) כדי לא לכלול כל הטיית קיטוב. לבצע מחזורים 10-25 של מדידות עד מאוגדן מלאה של הפניה שכותרתו לדנ א TF. נקודת הקצה נגיש בדרך כלל לאחר 1-2 h, בהתאם איגוד קינטיקה diffusivity של המתחרה הדנ א. 7. החילוץ של FA(z,t) מן הנתונים הגולמיים ברגע צלחת טוב היה עם תמונה, לחשב תמונות raw פלורסצנטיות ערכי הפיקסלים הממוצע של אזורים מעניינים עבור המקבילה (I=), בניצב (I+) מקוטב עוצמת רכיבי (איור 1c). ניתן לבצע זאת באופן אוטומטי באמצעות תוכנה היפ-פא23.הערה: התוכנה היפ-פא, חוברת הדרכה, dataset הבדיקה ניתן שהורדו23. לחלופין, להשתמש בכל תוכנה אחרת בכתב מותאם אישית לחלץ אני= ואני+ ולבצע את הניתוח במורד הזרם של עקומות טיטור, כמתואר בפירוט בהמשך. לחשב את הפא במשך כל. עבור כל טוב, קובץ ה-script מחשבת FA(z,t) -כל z-מיקום, זמן הצבע t על פי:משוואה 1:איפה G הוא הכלי גורם G המתקנת עבור כל הטיה לכיוון התעלה בניצב. לקבוע את הגורם G של ההתקנה מיקרוסקופ על ידי מדידת הפא של כל פתרון הכולל של הפלורסנט של חיזקו ידוע. לחלץ את הרכיבים קיטוב שני של האות ולאחר מכן להשתמש משוואה 1 כדי להשיג G, לדעת את הפא של הפתרון (G = 1.15 בהגדרת הזה). 8. עקומת כיול לקביעת ריכוז מתחרה DNA מ פאNB Anneal µL 120 של כל התייחסות ואחורה אוליגומר (100 מ מ מניות ריכוז; כל רצף אקראי באותו אורך כמו המתחרה רצף יכול לשמש) ומערבבים עם 120 µL של 3 x מחייבת מאגר המכיל NB (15 ננומטר). להכין סדרה דילול עם 1:2 דילולים 1 x מחייבת מאגר עם דילולים 6 בסך הכל. µL 50 מיקס של דילולים אלה עם 200 µL של 0.5% נקודת התכה נמוכה agarose (T > 35 ° C) ג’ל 1 x מחייבת מאגר המכיל 5 nM של NB ב- triplicates. להוסיף 200 µL של כל אחד הפתרונות 6 מוכן בשלב הקודם בצלחת 96-ובכן ולאחסן את הצלחת. בשביל h 1 ב 4 ° C כדי להבטיח gelation מלאה, אז 1 h-RT. למדוד הפאNB של הפתרונות באמצעות הגדרת היפ-פא. לחלץ את הפאNB (z, t) לפי השלב הקודם, להתאים לנתונים באמצעות משוואה היל:משוואה 2:איפה CDNA ריכוז אוליגומר הדנ א; k ריכוז DNA oligomers-איזה חצי מהאתרים איגוד תפוסים; פאמקסימום הוא קבוע נירמול; ו- n הוא המקדם היל. k, הפאמקסימום, ו n מוגדרים כפרמטרים חינם במהלך ההליך הולם. הזן את הפרמטרים שלושה המתקבל בהליך מתאים לתוכנה היפ-פא (בחלונית התחתונה השמאלית). חזור על הקביעה של עקומת כיול כל כמה חודשים, או לאחר ביצוע שינויים בכיוונון מיקרוסקופ. 9. קביעת מתחרה DNA ריכוז להשתמש בתוכנה היפ-פא כדי לחלץ c (z, t) מן המדידות פאNB(z, t) (איור 3). קודם להשיג את עקומת כיול כמתואר בסעיף הקודם ולהזין את הפרמטרים התאמה לתוכנה (ראה מדריך לקבלת פרטים). השתמש בתוכנית להסיק באופן אוטומטי c(z,t) c < 100 ננומטר (ראה ידני לקבלת פרטים) באמצעות משוואה 3 (איור 3b), המתאר את תפוצתיות חד-ממדי של המתחרה דנ א בתוך המטריצה ג’ל agarose, בהנחה דיפוזיה חופשית.משוואה 3:איפה ג0 הריכוז ההתחלתי של המתחרה DNA; erf היא פונקציית השגיאה; z הוא המיקום; D הוא מקדם דיפוזיה של המתחרה DNA; t0 שעת ההתחלה של המדידות. הפרמטרים ללא שימוש הם C0 ו ת /. 10. קונבנציונאלי טיטור תחרותי עם הירך-פא לכריכה DNA חזק מאוד באופן סדרתי לדלל את oligomers דנ א שונה המתחרה השורות של 96-ובכן צלחת (או צלחת 384-טוב) בריכוזים של: 0, 1.25, 3.5, 9, 19, 45, 90, 190, 425, 900, 1900 ו- 4000 ננומטר. להוסיף את ההפניה התווית על-ידי Cy5 דנ א (1 ננומטר) ו TF (20-50 ננומטר) על ריכוז קבוע, עם הנפח הכולל של µL 200 לאדם טוב מחייב מאגר (איור 5). לחכות 40 דקות עד שיווי משקל תרמודינמי מושגת ולרכוש (עם הגדרת היפ-פא) z-במחסן במשך כל (רכישת מספר תמונות לכל טוב מפחית את השתנות על ידי חישוב ממוצע ערכי פא מחושב). לבנות את עקומות טיטור מחייב שיווי משקל ולהתאים אותם עם משוואה 4 (איור 5b). ה-s Kדנקבע על ידי טיטור תחרותי קונבנציונאלי זהים לאלה מתקבלים על ידי היפ-פא באמצעות מטריצה של ג’ל agarose20. 11. מתאים הליך של עקומות טיטור פא להציג התוכנה היפ-פא העקומות טיטור המשוחזרת של הרצפים המתחרה בודדים FA(z,t) = f[c(z,t)] חזותית לבדוק את איכות הנתונים (ראה מדריך לקבלת פרטים). אם יש צורך, לחדד את הפרמטרים המשמש לקביעת הריכוזים DNA מתחרה בשלב 10. התאם כל עקומה טיטור בודדים באופן אוטומטי באמצעות משוואה 4, אשר נותן פתרון אנליטי עבור טיטור תחרותי מבחני24.משוואה 4:עם:איפה RT ריכוז חלבון; LT הוא תווית והוא Lסנט ריכוז הדנ א שכותרתו; KD2 הוא קבוע דיסוציאציה שיקבע; RT הוא הריכוז של חלבון פעיל; A ו- B הם פרמטרים נורמליזציה.ראשית קבע KD1, אשר משמש כהפניה לקביעת ערכי KD2 שונים. KD1 הוא ניתן בקלות לקבוע עם וזמינותו על-ידי בחירת רצף DNA לצבוע-הפניה כמו הרצף של המתחרה ללא תווית ה-DNA (עיין במדריך). הזן את הערך שהושג של KD1 בתוכנה ולחישוב ערכי KD2 עבור כל המתחרה הדנ א על הצלחת.הערה: הפרמטרים חינם של ההליך הולם הם KD2, RT, A, ו – b לייצא את קבוע דיסוציאציה KD2 , הריכוז של חלבון פעיל RT עבור כל הבארות טיטור בודדים של הצלחת על-ידי לחיצה על לחצן “ייצוא” בתוכנה. 12. PWM בניה, יחודיות של אינטראקציית חלבון-DNA, וספירות מדומה צור את הסמלים של רצף PWMs שונים באמצעות כלי מקוון WebLogo 3.0 (http://weblogo.threeplusone.com/create.cgi) כפי שתואר לעיל20.

Representative Results

אנחנו יחולו היפ-פא TFs של פילוח ג’ין רשת25,26, אשר מפיק את תבנית הגוף הקדמי-אחוריים של עוברי דרוזופילה, בעיקר באמצעות רגולציה תעתיק. מ רשת זו, בחרנו bZIP את תחום TF ענק (Gt) עבור ניתוח מפורט (איור 4). מאז גורמי שעתוק באורך מלא מתקשה לבטא תשואות בעיקר בהעדפות מחייב אותו כמו שלהם מחייב תחומים (DBD) של הדנ א13, אנחנו המשמש את DBD דבוקה GST והביע הבונה ב e. coli GST פיוז’ן חלבונים לספק את אותן תוצאות כמו DBDs לבד20. רצף הקונצנזוס Gt (TTACGTAAC) מייצג את רצף מחייב החזק קבענו כמתואר לעיל. אנחנו מכן חקר ההשפעה על האנרגיה איגוד של כל מוטציות נקודה אחת אפשרית בטווח 10-מר Gt רצף הסכמה (סך של 30), ולצדו בסיסים נוספים בקצוות 5′ ו- 3′. מדדנו משכפל שתי דגימות ג’ל אשר הופקו באמצעות אוטומציה, אחד שכפול נוספים המיוצרים באופן ידני עבור השוואה. KDs נע בין 0.6 אל > 2000 nM עבור רצפי ביחידים מוטציה, אישר לנו גם העדר מוחלט של איגוד רצף “מחייב” (נתונים לא מוצג). TF-DNA איגוד specificities הם בדרך כלל הדגם שימוש במטריצה משקל מיקום (PWM), שבו מוקצה ניקוד כל נוקלאוטיד אפשרי-כל תנוחה המוטיב מחייב. PWM מבוסס על ההנחה כי לכל תפקיד תורם מחייב כוח באופן עצמאי, ברוב המקרים מהווה מודל מספיק TF מחייב העדפות27. יצרנו PWMs מתוקנת המבוססת על המידות שלנו זיקה הבאים נוסדה הליכים28,29 , לעומת אותם שני PWMs דיווח בעבר בספרות. הראשונה מבוססת על נוקלאוטיד ספירות תדר של איגוד אתרי המזוהה על-ידי ה-DNA footprinting4,5, PWM השני היה מתקבל על ידי חיידקי אחד-היברידית (B1H) הנבחר. 15 הדמיון גבוהה של PWMs עבור שלושה משכפל (איור 4, החלונית העליונה), כולל עבור הדגימה להכין ידנית (שכפול 3), מדגים את הפארמצבטית גבוהה של השיטה היפ-פא. אמנם PWMs מתקבל על ידי היפ-פא הכוללת דומה PWMs שהושגו עם השיטות האחרות (איור 4, החלונית התחתונה), יש סטיות משמעותיות: במיקום 2 (חץ שחור), ההתחלה של המוטיב bZIP הליבה, מוטציות T > (G, C, A) להוביל להשלים את אבדן האיגוד ב מוטיב מתקבל על ידי היפ-פא, דבר העולה בקנה אחד עם מוטיב B1H אבל לא עם זה שהושג עם DNase footprinting, שבו האיגוד נשאר חזק יחסית עבור בסיסים (ז, א). לעומת זאת, ב מקם 7 (חץ אפור), המוטציה T > C מוביל הרבה איגוד חזק יותר מאשר הצפוי בהתבסס על PWMs נמדד קודם לכן. סטיות אחרות הן עדינות יותר אבל לא פחות חשוב. הכולל, PWM היפ-פא הוא פחות ספציפית יותר השניים האחרים, המשקף את העובדה כי מוטציות רבות מהקונסנזוס עדיין להניב חזק בינוני מחייב. זה ניתן לכמת באמצעות התוכן מידע (IC). IC הוא 11.5 סיביות עבור המטריצה היפ-פא (ממוצע של משכפל שלוש), בהשוואה ל IC = סיביות 13.4 וסיביות 16.8 DNase footprinting ו B1H מטריצות, בהתאמה. בדרך כלל (אם כי לא אוניברסלית), PWMs מתקבל על ידי היפ-פא הן ספציפיות פחות מאשר אלה התקבלו ע י שיטות אחרות, בהתבסס על 26 TFs חקר20. איור 1:תיאורים סכמטי של הירך-פא assay, הגדרת הניסוי. (א) ג’ל מערכת משלוח עבור titrating מתחרה DNA בבארות יחיד. (ב) היפ-פא מיקרוסקופ כיוונון. התאמה אישית של מיקרוסקופ widefield אוטומטית עם זיהוי אור מקוטב זריחה על מצלמה EM-CCD. (ג) גלם התמונה זריחה עם שני האיזורים עניין לקביעת המקבילה (אדום) ו בניצב (ירוק) מקוטב רכיבים. (ד) הפריסה טיפוסי של צלחת 96-ובכן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 2 : נתונים גולמי פא ועיקולים טיטור המשוחזרת. (א) מסלול FA(z,t) אופיינית עבור כיול טוב המכיל NB. (b, c) FA(z,t) הזמן מסלולים עבור שתי בארות טיטור מדידה איגוד חזק (b), המתחרה איגוד דנ א (ג) מתון יותר. (ד, ה) המתאים שיחזר פא טיטור מדידות ולהכניסם עקומות עבור חזקה (ד) ובינוני (e) מחייב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 3 : קביעת הריכוז של מתחרה DNA c (z, t) באמצעות הנילוס הכחול (NB). (א) פא-ריכוז עקומת כיול עבור 16 oligomers DNA בסיסים. בסדרת טיטור קונבנציונאלי, NB שמוטבע agarose ג’ל יחד עם ריכוזים שונים של מתחרה DNA. זיקתו של NB ל- DNA הוא תלוי-רצף20; לכן, עקומות כיול אותו יכול לשמש לקביעת c (z, t) עבור רצפי דנ א שונים באותו אורך. (ב) המתחרה פרופיל הדנ א זמן דיפוזיה בגובה שרירותי z באמצעות חמש בארות כיול. עבור כל מחזור המדידה, FAs ממוצע של ארבע בארות המכילות NB מוצגים כמו נקודות לבנות. העקומות כוללים באמצעות משוואה 3 (הקו הלבן, בארות בודדים בצבע) ו- c (z, t) בריכוזים נמוכים (C < ~ 100 ננומטר) נקבע על ידי עקומת התאמה משוערים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 4 : איגוד specificities של משפחת תחום bZIP TF ענק (Gt). PWMs היפ-פא של משכפל שלושה: שניים שהוכנו באמצעות אוטומציה ואחד שהוכנו באופן ידני (החלונית העליונה) לעומת PWMs שנוצר על ידי DNase footprinting על ידי חיידקי אחד-היברידית (B1H) בחירת השיטה (החלונית התחתונה). בסך הכל, המוטיבים איגוד היפ-פא מסכים עם הנתונים הקודמים, אבל גם מראים הבדלים משמעותיים, כפי שמודגש עם החצים שחור ואפור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 5 : קונבנציונלי טיטור תחרותי עם הירך-פא. (א) עיצוב מראה 8 דנ א שונה מתחרה באופן סדרתי מדולל במאגר איגוד בשורה בודדת של צלחת 96-ובכן. מפת החום של הפא מוצג עבור קישור שרירותי שונים נקודות החוזק. (ב) טיטור תחרותי של שלושה מתחרים DNAs איגוד TF Bcd עם הזיקות השונות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

היפ-פא הוא שיטה חדשה מקיפה לקביעת הנופים העדפה איגוד של אינטראקציות TF-DNA. זה מודד את הזיקות איגוד של mutational ה-DNA מוטיב משתנים ישירות, הימנעות כל הנחת היסוד כי איגוד העדפות משתקפים מתדירות המופעים נוקלאוטיד בקבוצת מעל הסף קלסרים. המדידה מתבצעת בפתרון ללא הנייח, הפרעה מכנית או כימית עם התגובה מחייב, קירוב שיווי משקל התנאים ככל האפשר. מערכת משלוח מבוקרת מאפשר מדידת עקומת טיטור מלא בתוך אחד טוב ומגדילה תפוקה ואמינות תוך חיסכון חלבון. באמצעות אובייקטיבית עם מפתח נומרי גבוהה, EM-CCD מצלמה עם יעילות אוסף אור גבוהה מאפשרת לגילוי אור פלורסנט רגישה מאוד. לפיכך, עם תוכנית התקנה זו, הפא קטן משתנה נמוך ככל 10-15 mP ניתן להבחין במדויק; בפועל, פירוש כל תגובה איגוד אשר העלייה ההמונית לאחר איגוד הוא מינימלי (יהיה נמוך ככל יחס מסה של 2) מזוהה בקלות. . זה בדרך כלל לא המקרה עם מערכות מסחריות כמו הקוראים microplate בשל רגישות גבוהה שלה, היפ-פא מרחיבה את טווח קבועי דיסוציאציה שניתן למדידה באופן מהימן לתוך הטווח picomolar. איגוד אנרגיות נקבעים במדויק על מספר סדרי גודל.

כדי להעריך את איכות PWMs המתוקן, ביצענו שני סוגים של ניתוח20. בדקנו, עבור חמישה גורמים של הרשת ג’ין פילוח, כמה טוב PWMs שונים יכולים לחזות פרופילים שבב-seq נסיוני באזורים גנומית של 21 גנים פילוח. כמו בדיקה נוספת, השתמשנו דגם כדי-ביטוי רצף4 אשר מנבאת דפוסי ביטוי של פילוח משפרי על בסיס מחייב העדפה וחלבון הריכוז של TFs המשתתפים. הן התרגילים, מצאנו PWMs היפ-פא ספציפית פחות לבצע באופן משמעותי יותר footprinting יותר ספציפי של B1H PWMs20.

שלא כמו שיטות דה נובו , היפ-פא דורש קצת ידיעה מוקדמת איגוד העדפה של TF נתון. עם זאת, רצפי הקונצנזוס ידועים TFs רבים, קיימות שיטות רבות יכולים לספק להם13,14,15. במידת הצורך, ניתן למצוא iteratively רצף נכון מחייב אופטימלית.

השתמשנו DNA הפניה oligomers בלוחיות fluorescently Cy5 ו Bodipy-650. צבעים אלה הוכיחו לבצע גם עבור הפא מדידות מאז. בנוגע למקורו של DNA הפניה מתויג המאוגדים והלא מאוגדים היו הגדולים ביותר בין צבעים שונים שנבדקו. פעולה זו מבטיחה טווח דינמית מרבי עבור ערכי ה-FA. באופן כללי, כל הפלורסנט עם ≥ שלמים קרינה פלואורסצנטית 1 ns צפוי להיות מתאים אבל צריך לבדוק קודם. במידת האפשר, מומלץ להשתמש צבעי ואזוריט בטווח קרוב-IR כדי למזער את החלבון autofluorescence.

השלב הקריטי ביותר של התהליך ניסיוני הוא pipetting של הג’ל לתוך הצלחות היטב. הפארמצבטית טובה דורשת אמצעי האחסון ג’ל כדי להיות כמו אחיד ככל האפשר. שינויי הגובה ג’ל מתורגם שינויים של diffusivity עבור אוליגומר תחרותי של ה-DNA, וכך משתנה לכאורה של אהדה בעת הערכת הנתונים. זה המקור העיקרי של שונות שכפול טכני. השימוש בטכניקות אלקטרונית pipet או אוטומציה משפר הפארמצבטית. בועות אוויר בתוך הג’ל יכול להימנע על ידי איטי וזהיר pipetting. זה חשוב גם להוסיף את כל הפתרונות המתחרה על הבארות טיטור עם עיכוב קטן ככל האפשר. עבור הפארמצבטית הטוב ביותר, כל התהליך יכול להיות אוטומטי באמצעות רובוט pipetting עם חום חממות. חלק קריטי להעברת הפרוטוקול אוטומציה הוא הכרחי אופטימיזציה של החממה הטמפרטורה והשעות הדגירה. הקפד למצוא איזון מיטבי בין צמיגות של הג’ל (כלומר. קר מדי) ואת יציבותו של חלבונים (קרי, לא חם מדי). זה תלוי גם על מהירות שחולק היחסי של ג’ל לתוך בארות ואת היציבות של החלבון בשימוש.

היפ-פא עושה שימוש מערכת מבוקרת עבור oligomers הדנ א המתחרה. כדי לבנות את עקומות titrations, יש צורך לקבוע את מתחרה DNA ריכוז c(z,t) עבור כל נתון z-מקמו בתוך המטריצה ג’ל והזמן נקודת t. זהו צעד קריטי נוסף, שכן הקביעה של KDs תלויה ישירות c(z,t). כיול בארות המכיל את צבען NB כמו חיישן ה-DNA ריכוז משמשים למטרה זו (איור 1d, איור 2). בדרך כלל, 3-5 כיול בארות המכיל NB לכל צלחת מספיקים. לפני הערכת כל הירך-פא ניסוי, עקומת כיול NB יש אפשרות לבנות עבור הסידור על-ידי ביצוע סדרת טיטור קונבנציונאלי NB מומס הג’ל agarose עם מתחרה DNA של כל רצף בריכוזים שונים (איור 3 ), כפי שהוסבר בהרחבה בשלב 8. במקרה של איגוד חזק מאוד (KD < 500 pM), אקסטרפולציה המשמש לקביעת ריכוזים נמוכים של מתחרה DNA הופך לגרוע, שכן הוא פחות מדויקות מדידה ישירה. עם זאת, עבור שר עם כזה נמוך KDs, ההגדרה של הירך-פא יכול לשמש לביצוע טיטור תחרותי קונבנציונאלי במאגר איגוד ללא שימוש מטריקס ג’ל agarose (איור 5). לדוגמה, ניתן לבצע אחת טיטור מלא עם 12 ריכוזים שונים של מתחרה DNA בשורה בודדת של צלחת 96-ובכן.

מערכת משלוח מבוקרת דורש גם קינטיקה מהיר של איגוד TF-DNA, חלבונים יציבים, מאז פעפוע למרות הג’ל agarose היא דינמית (אם כי איטי). שני המאפיינים יכול להיבדק ישירות עם ההגדרה של הירך-פא ידי הבאים, לאורך זמן, הפא של שר עניין כאשר הוא מאוגד כדי שלהם בהתאמה fluorescently שכותרתו הפניה הדנ א. אנו נמדדים המחירים KON ו- KOFF עבור הגורמים ובדוקים ומצא אותם להיות הסדר אלפיות השניה שניות20, על פי מחקרים אחרים30. . זה מספיק מהר כדי להבטיח כי מדידות יתקיים ב שיווי משקל. במקרה של תגובות אחרות מחייב עם קינטיקה איטי יותר, ניתן לכוונן את diffusivity של המתחרה על-ידי הורדת הריכוז שלו או הפחתת גודל הנקבוביות ג’ל. במקרה TFs שנבדקו, אשר כולם יש מהיר T. (~ שניות), זמן סך מדידה של 1-2 h מספיקה להבטיח שיווי משקל תרמודינמי-כל אחת מהמידות.

עוד נושא פוטנציאליים הקשורים החלבון הוא היווצרות של אגרגטים חלבון זה עשוי לשנות מידות הפא. השימוש של תנאים אחרים מאגר המכיל תוספים שונים (כמו tensides) יכול למנוע היווצרות צבירה, במידת הצורך.

עבדנו תחת ההנחה ליניאריות של PWM; עם זאת, היפ-פא וניתן לשנותם כדי לכלול כל המוטציות di אפשרי-נוקלאוטיד של רצף קונצנזוס. לבסוף, היפ-פא ניתן להתאים כדי למדוד סוגים אחרים של איגוד אינטראקציות. תנאי מוקדם הוא שתהיה מולקולה התייחסות מתאימה זמין מחויב על ידי החלבון אשר יכול להיקרא fluorescently. עם מערכת משלוח מבוקרת, הדרגתי הריכוז יכול להיווצר עבור כל סוג של ליגנד; לכן, ניתן למדוד אינטראקציות חלבון-חלבון וחלבון סמים עם דיוק גבוה באופן דומה והתפוקה.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים מולר ג’יי cDNA שיבוטים וחברי המעבדה גאליה, בפרט Bergelt ס, עצה יקר ודיון נמרצת. עבודה זו נתמכה על ידי SFB 646, רשתות בקרה רגולטריות הגנום ביטוי ותחזוקה (סי ת), המרכז עבור המדע חלבון משולב (U.G.), המדרשה עבור כמותיים החיים מינכן (טרשת נפוצה). U.G. מודה תמיכה על ידי פתוח (SFB 646, SFB 1064, CIPSM, QBM), את Bundesministerium לדנציג Bildung und Forschung (BMBF: ebio – Innovationswettbewerb Systembiologie), ושל קרן הומבולדט (אלכסנדר פון הומבולדט, פרופסורה).

Materials

Cy5-labled 16- / 18-bp DNA-oligomers Eurofins Custom synthesis
16- / 18-bp DNA-oligomers Eurofins Custom synthesis
Nile Blue A Sigma N5632-25G
Sensoplate plus microplate 96- or 384-well, PS Greiner 655891 175 µm thick glass bottom
384 Well Sensoplate, black Greiner 788896
Agarose, low gelling temperature Sigma A9414-50G
Sodium Chloride Merck 1.06404.1000
Tween-20 Sigma P1379-1L
Di-Potassium hydrogen phosphate trihydrate Merck 1.05099.1000
Potassium dihydrogen phosphate Merck 1.04873.1000
Q-POD Element Merck Millipore ZMQSP0DE1
Millipak 40 Gamma Gold Filter Merck Millipore MPGL04GK2
Milli-Q Integral 3 Water Purification System Merck Millipore ZRXQ003WW
Quantum TIX Merck Millipore QTUMOTIX1
DL-Dithiothreitol Sigma 43815-1G
Mastercycler gradient Eppendorf Z316083
SafeSeal tube 1.5 mL Sarstedt 72.706.200
Tube 15 mL Sarstedt 62.554.502
Multiply-Pro cup 0.2 mL PP Sarstedt 72.737.002
MICROSCOPY SETUP:
Automated widefield microscope LEICA DMI6000
Long distance objective LEICA HCX PL FLUOAR L 60x/0.60 N.A. Dry
638 nm line continuous diode laser Omicron PHOxX 638-40, 40mW
Back-illuminated EM-CCD Camera Andor iXon DV897
Dichroic mirror AHF 640nm cut-off
Bandpass filter AHF ET bandpass 700/75
Linear polarizer Thorlabs LPVISC050-MP2
Polarizing beam splitter Thorlabs BS010
Achromatic lens Thorlabs 200 mm focal length
Multimode optical fiber Optronis FVP600660710
ROBOTIC SYSTEM:
Our robotic system includes a Biomek NXP workstations with a 96-channel head and with Span-8 pipettors, connected with a servo-shuttle, are used for all liquid transfer steps. In addition, the system is equipped with orbital shakers and a microplate reader (Paradigm, Molecular device) served by the Span-8 gripper Beckman Coulter Biomek NXP
SOFTWARE:
Programming language National Instruments Labview 9.0
Script for the HiP-FA software available at https://github.com/GeneCenterMunich/HiP-FA
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berg, O. G., von Hippel, P. H. Selection of DNA binding sites by regulatory proteins. Statistical-mechanical theory and application to operators and promoters. Journal of Molecular Biology. 193, 723-750 (1987).
  2. Hammar, P., et al. Direct measurement of transcription factor dissociation excludes a simple operator occupancy model for gene regulation. Nature Genetics. 46, 405-408 (2014).
  3. Chen, J., et al. Single-molecule dynamics of enhanceosome assembly in embryonic stem cells. Cell. 156, 1274-1285 (2014).
  4. Segal, E., Raveh-Sadka, T., Schroeder, M., Unnerstall, U., Gaul, U. Predicting expression patterns from regulatory sequence in Drosophila segmentation. Nature. 451, 535-540 (2008).
  5. Schroeder, M. D., et al. Transcriptional control in the segmentation gene network of Drosophila. PLoS Biology. 2, 271 (2004).
  6. He, X., Samee, M. A., Blatti, C., Sinha, S. Thermodynamics-based models of transcriptional regulation by enhancers: the roles of synergistic activation, cooperative binding and short-range repression. PLoS Computionnal Biology. 6, (2010).
  7. Wilson, M. D., et al. Species-Specific Transcription in Mice Carrying Human Chromosome 21. Science. 322, 434-438 (2008).
  8. Galas, D. J., Schmitz, A. Dnaase footprinting – simple method for detection of protein-DNA binding specificity. Nucleic Acids Research. 5, 3157-3170 (1978).
  9. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature Protocols. 2, 1849-1861 (2007).
  10. Liedberg, B., Nylander, C., Lundstrom, I. Surface-plasmon resonance for gas-detection and biosensing. Sensors and Actuators. 4, 299-304 (1983).
  11. Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nature Communications. 1, (2010).
  12. Berger, M. F., et al. Compact, universal DNA microarrays to comprehensively determine transcription-factor binding site specificities. Nature Biotechnology. 24, 1429-1435 (2006).
  13. Nitta, K. R., et al. Conservation of transcription factor binding specificities across 600 million years of bilateria evolution. eLife. 4, (2015).
  14. Jolma, A., et al. DNA-Binding Specificities of Human Transcription Factors. Cell. 152, 327-339 (2013).
  15. Noyes, M. B., et al. A systematic characterization of factors that regulate Drosophila segmentation via a bacterial one-hybrid system. Nucleic Acids Research. 36, 2547-2560 (2008).
  16. Nutiu, R., et al. Direct measurement of DNA affinity landscapes on a high-throughput sequencing instrument. Nature Biotechnology. 29, (2011).
  17. Riley, T. R., et al. SELEX.-seq: a method for characterizing the complete repertoire of binding site preferences for transcription factor complexes. Methods Molecular Biology. 1196, 255-278 (2014).
  18. Maerkl, S. J., Quake, S. R. A systems approach to measuring the binding energy landscapes of transcription factors. Science. 315, 233-237 (2007).
  19. Isakova, A., et al. SMiLE-seq identifies binding motifs of single and dimeric transcription factors. Nature Methods. 14, 316-322 (2017).
  20. Jung, C., et al. True equilibrium measurement of transcription factor-DNA binding affinities using automated polarization microscopy. Nature Communications. 9, 1605 (2018).
  21. Weber, G. Polarization of the fluorescence of macromolecules: Fluorescent conjugates of ovalbumin and bovine serum albumin. Biochemical Journal. 51, 155-168 (1952).
  22. . Github Available from: https://github.com/Reutern/PySite (2018)
  23. . Github Available from: https://githum.com/GeneCenterMunich/HiP-FA (2018)
  24. Roehrl, M. H., Wang, J. Y., Wagner, G. A general framework for development and data analysis of competitive high-throughput screens for small-molecule inhibitors of protein-protein interactions by fluorescence polarization. Biochemistry. 43, 16056-16066 (2004).
  25. St Johnston, D., Nuesslein-Volhard, C. The origin of pattern and polarity in the Drosophila embryo. Cell. 68, 201-220 (1992).
  26. Pankratz, M., Jäckle, H., Bate, M., Martinez Arias, A. . The Development of Drosophila melanogaster, Vol. 1. , 467-516 (1993).
  27. Zhao, Y., Ruan, S. X., Pandey, M., Stormo, G. D. Improved Models for Transcription Factor Binding Site Identification Using Nonindependent Interactions. Genetics. 191, (2012).
  28. Noureddine, M. A., et al. Probing the functional impact of sequence variation on p53-DNA interactions using a novel microsphere assay for protein-DNA binding with human cell extracts. PLoS Genetics. 5, 1000462 (2009).
  29. Veprintsev, D. B., Fersht, A. R. Algorithm for prediction of tumour suppressor p53 affinity for binding sites in DNA. Nucleic Acids Research. 36, 1589-1598 (2008).
  30. Geertz, M., Shore, D., Maerkl, S. J. Massively parallel measurements of molecular interaction kinetics on a microfluidic platform. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 16540-16545 (2012).

Tags

Transcription Factor-DNA BindingFluorescence MicroscopyDissociation ConstantCompetitive TitrationAnisotropy MeasurementBinding AffinityProtein-DNA InteractionDNA AnnealingAgarose GelTitration PlateCalibration WellNile Blue Dye

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Jung, C., Schnepf, M., Bandilla, P., Unnerstall, U., Gaul, U. High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (144), e58763, doi:10.3791/58763 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image