قياس حساسية عالية من الانتماءات الملزمة الحمض النووي عامل النسخ بالتنافسية معايرة باستخدام مجهر الأسفار
Summary
هنا نقدم طريقة جديدة لتحديد الانتماءات الملزمة في التوازن وفي الحل مع حساسية عالية على نطاق واسع. وهذا يحسن التحليل الكمي لربط الحمض النووي عامل النسخ. الأسلوب الذي يستند إلى الأسفار الآلي تباين القياسات في نظام التسليم المراقب.
Abstract
القياس الكمي الدقيق لعامل النسخ (TF)-التفاعلات الحمض النووي ضروري لفهم تنظيم التعبير الجيني. نظراً للنهج القائمة تعاني من قيود كبيرة، قمنا بتطوير أسلوب جديد لتحديد الحمض النووي TF ملزم الانتماءات مع حساسية عالية على نطاق واسع. يعتمد على مبدأ تباين (اتحاد كرة القدم) الأسفار المنشأة المقايسة لكن يدخل تحسينات فنية هامة. أولاً، نحن قياس منحنى معايرة تنافسية كاملة اتحاد كرة القدم في بئر واحدة بإدراج TF ومرجع مسمى فلوريسسينتلي الحمض النووي في مصفوفة مسامية [اغروس] هلام. غير مسمى الحمض النووي أوليجومير يتم تحميلها على أعلى كمنافس، ومن خلال نشرها، يشكل تدرج الزمانية. التدرج فا الناتج هو ثم تلا استخدام إعداد مجهر ابيفلوريسسينسي مخصصة. هذا الإعداد محسنة يزيد كثيرا من حساسية الكشف عن إشارة اتحاد كرة القدم، السماح بربط الضعفاء والأقوياء على حد سواء كمياً موثوق بها، حتى بالنسبة لجزيئات أوزان الجزيئية مماثلة. بهذه الطريقة، يمكننا قياس واحد منحنى معايرة كل من لوحة متعددة جيدا جيدا، ومن خلال إجراءات مناسبة، يمكن استخراج تفارق المطلق ثابت (كد) وتركيز البروتين النشط. عن طريق اختبار كافة المتغيرات طفرة نقطة واحدة من توافق معين ملزم التسلسل، يمكننا استطلاع في المشهد خصوصية أسرة ملزم TF، عادة على لوحة واحدة. مصفوفات الوزن الموقف الناجم عن ذلك (PWMs) تتفوق تلك المستمدة من الأساليب الأخرى في التنبؤ في فيفو شغل TF. نقدم هنا، دليلاً تفصيليا لتنفيذ الورك فا في مجهر فلوري إليه تقليدية وخط أنابيب تحليل البيانات.
Introduction
ونظرا للدور المركزي لعوامل النسخ (TFs) في تنظيم الجينات، تحديد تفضيلاتهم ملزم بطريقة كمية أمر بالغ الأهمية. الدراسات المنوي قبل فون هيبل عرض فكرة أن TFs تنظيمية تعترف بسرعة الحمض النووي، مثل أن تجليدها يصفها توازن دينامي حراري، بينما يسيطر عليها أحداث المصب تجنيد بوليميريز الحمض النووي الريبي للمروج حركية أبطأ1. في فيفو ملزمة الدراسات التي أجريت مؤخرا تشير إلى أن هذه الصورة يحتمل أكثر تعقيداً2،3؛ ومع ذلك، هذه الافتراضات العامة بمثابة تقديرات تقريبية جيدة، ودعمت العديد من النهج الحسابية العثور على العناصر التنظيمية المستقلة، والتنبؤ بالتعبير عن تسلسل4،،من56. بينما الربط التوازن وبالتالي يعمل بنجاح كمفهوم، الأساليب الحالية لتحديد التفاعلات الحمض النووي TF تركز على ربط خصوصية وعادة لا مباشرة تدبير الانتماءات الملزمة في التوازن. القياس المنتظم لربط TF-الحمض النووي يمثل تحديا تقنيا كبيرا، والأساليب القائمة على عدة قيود مختلفة.
إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين متبوعاً بعمق التسلسل (الرقائق-seq)7، التقنية في فيفو الأكثر انتشارا، لا تسمح بقياس الانتماءات الملزمة أو التعريب الدقيق لمواقع داخل أجزاء الجينوم الربط. عدة في المختبر الأساليب، بما في ذلك الدناز footprinting8التنقل الغرواني الكهربي العالي (أمسا)9, السطحية مأكل مثل الطحين الرنين (موارد البرنامج الخاصة)10وعبارة ثيرموفوريسيس11 قادرة على قياس الانتماءات الملزمة، ولكن هم الإنتاجية منخفضة نسبيا. وفي المقابل، تقنيات إنتاجية عالية منها البروتين ملزمة [ميكروارس]12وتقنية HT-سيليكس13،14والبكتيرية المختلطة واحدة (B1H)15 ليست قادرة على قياس الانتماءات الملزمة، وعادة ما تسفر عن الإفراط محددة ملزمة متواليات، الذي يرجع أساسا إلى انتقاء صارمة أو الغسيل الخطوات اللازمة. التطورات الأخيرة تشمل الوجه يضرب تسلسل العميق على أساس16، seq سيليكس17، والمستندة إلى ميكروفلويديكس MITOMI18 أو ابتسامة Seq19، التي تسمح لاستخراج الانتماءات الملزمة المطلقة؛ ومع ذلك، أنها تعتمد على قياس كثافة الأسفار المسماة TF والحمض النووي. الأسفار إشارات، ولذلك يصبح الحد من تركيزات منخفضة البروتين وفي تحديد قيم كد منخفضة (< ~ 10 نانومتر). وعلاوة على ذلك، الربط TF-الحمض النووي في هذه الأساليب يأخذ مكان على سطوح رقيقة، رفع القضايا مع الربط غير محدد و/أو صف السيارات الخلفية، مما يجعل من الصعب على دقة قياس ضعف الربط.
لمعالجة أوجه القصور هذه، قمنا بتطوير أسلوب جديد لتحديد الحمض النووي TF تقارب المناظر الطبيعية في التوازن وفي الحل الذي طالبنا عالية الأداء fluorescence تباين (HiP فا)20. التقنية استناداً إلى فحص تباين (اتحاد كرة القدم) الأسفار المقررة21 ولكن تعديل لقياس ثوابت ملزمة مع حساسية عالية وواسعة النطاق باستخدام المجهر الآلي مخصص وإعداد التحليل.
وترصد المقايسة فا التفاعل بين الأنواع المسماة فلوريسسينتلي (مثل أوليجومير الحمض النووي) لشريك ملزم، في هذه الحالة TF، بقياس الدوران الجزيئية للجزيء المسمى. عند الربط إلى TF، يتناقص سرعة دوران سبب radius هيدرودينامية أعلى والوزن الجزيئي للمجمع ملزمة، مما يؤدي إلى زيادة اتحاد كرة القدم. القياس الدقيق لربط قوي جداً (كد < ~ 1 نانومتر) يتطلب استخدام تركيزات منخفضة من مرجع مسماة، الحمض النووي (ج < ~ 1 نانومتر). وهذا يصعب تحقيقه مع أداة تجارية مثل قارئ ميكروسكوبية قياسية. وباﻹضافة إلى ذلك، فرق كبيرة حجم (10 100 إضعاف) بين المجمعات المنضمة وغير المنضمة ضروري عادة، الذي يحظر القياس للتفاعلات بين المجالات الملزمة TF وقصيرة ليغومرات الحمض النووي، التي عادة ما تكون من الأوزان الجزيئية مماثلة تقريبا . وأخيراً، منحنى معايرة كامل يتطلب عادة إعداد وقياس آبار متعددة تحتوي على سلسلة تركيز للأنواع تيتراتينج.
لمعالجة هذه القضايا، نحن نستخدم إعداد مجهرية ويديفيلد، تعديل لتحقيق كشف عالية الحساسية وتسمح قياسات اتحاد كرة القدم في مختلف المواقف ض من بئر واحدة. وهذا تمكننا من رصد التفاعلات الربط بين أنواع مماثلة من الوزن الجزيئي، ومع ارتفاع الانتماءات. ويتحقق أعلى من الناتج عن طريق قياس اتحاد كرة القدم في لوحة جيدا متعدد الأشكال والاضطلاع سلسلة معايرة أسرة واحدة جيدا باستخدام إيصال نظام الخاضعة للرقابة (الشكل 1). وعلاوة على ذلك، عن طريق استخدام مقايسة ملزمة تنافسية، نحن استخراج ثوابت ملزمة ليس فقط، بل أيضا تركيز البروتين النشط. هذا سمة هامة للمقايسة، نظراً لجزء فقط من جزيئات TF أعرب نشطة بسبب ميسفولدينج البروتين أو تدهور. ويستند الإعداد التجريبية مجهر ابيفلوريسسينسي تجارية مجهزة بمراحل بيزو XY و Z. نحن ترقية النظام مع الإثارة الليزر الخارجي، ثم الكشف عن الاثنين تنبعث مكونات الاستقطاب الخطي على رقاقة الكاميرا م-اتفاقية مكافحة التصحر مع الكم عالية الكفاءة للكشف عن الضوء (الشكل 1ب وج 1). النظام يستخدم هدفا فتحه عددية عالية (غ) بالإضافة إلى جهاز استشعار حساسة جداً، ومما يتيح حساسة للغاية فا القياسات. عن طريق تسجيل الأسفار z-المكدسات، ملزمة التفاعلات يمكن أن يقاس على طول محور ع الضوئية عند استخدام مصفوفة متجانسة كواشف مختبر. جميع هذه التعديلات يمكن تنفيذها على نظام موجود لسهولة وفعالية من حيث التكلفة.
نحن نوظف مقايسة تنافسية ملزمة التي تقارب ملزم من أوليجومير الحمض النووي غير مسمى يقاس بالمقارنة مع الحمض النووي المسمى فلوريسسينتلي، الذي يخدم كمرجع. وأدرجت TF ومرجع الحمض النووي في تركيزات ثابتة في مصفوفة جل مسامية [اغروس] (المسام حجم ~ 1 ميكرومتر) يشكل بيئة غير التفاعل للربط. المرجع هو المسمى الحمض النووي مع Cy5. هذه الصبغة أثبتت أنها مناسبة تماما للقياسات اتحاد كرة القدم بسبب بقائه fluorescence طويلة نسبيا (~ 1ns) وانبعاث fluorescence في استعملنا الطيف المرئي (خلفية صف السيارات منخفضة). تركيز TF في فائض المولى على مرجع Cy5 الحمض النووي، وضمان أن جميع المراجع الحمض النووي مرتبط بالبروتين. حلاً منافس غير مسمى الحمض النووي ثم تودع على سطح هلام وينشر داخل المصفوفة المسامية، إنشاء الانحدار تركيز ج (z, t) أن التغييرات على z-موقف البؤري والزمن t (الشكل 1أ من الشكل 2أ-2 ج). TF ملزمة للحمض النووي Cy5-المرجع وهكذا يتعرض محلياً بتركيزات مختلفة للمنافس الحمض النووي التي تتنافس للتوثيق، مما يؤدي إلى FA متغيرة بشكل حيوي من الحمض النووي إشارة Cy5 FAREF(z, t) (الشكل 2ب و 2 (ج)).
لتحديد c(z,t) تركيز المنافس، نقيس في آبار منفصلة (معايرة الآبار) اتحاد كرة القدم بشكل حيوي تغيير إشارة “النيل الأزرق” (ملحوظة) فاNB(z, t) (الشكل 2و 3). هذه الصبغة إينتيركالاتيس في الحمض النووي وذلك بمثابة جهاز استشعار الحمض النووي للمنافس الحمض النووي. مع هذا النظام التسليم المراقب، يمكن قياس عشرات ومئات من مختلف الانتماءات الملزمة البروتين الحمض النووي داخل لوحة متعددة جيدا واحدة (96-384 جيدا أو لوحة تنسيق). ثم يتم قياس تسلسلياً حتى تشريد المرجع المسمى الحمض النووي من فريق العمل كاملة. علينا تحديد خصوصية ملزم لعامل معين حسب قياس الانتماءات جميع الطفرات قاعدة واحدة 3 ن من تسلسل توافق طول ن. الهيب فا يتطلب كميات قليلة من البروتين (~ بمولس كل منحنى المعايرة) ويظهر انخفاض تقلب في تحديد ك قد[معامل الاختلاف (CV) < 20%]، بينما تسمح القياسات على نطاق واسع نسبيا. ويمكن إجراء الأسلوب الآلي يدوياً أو بالكامل باستخدام نظام روبوتية، أسفر عن السير الذاتية حتى أقل (الشكل 4، اللوحة العلوية). الانفصال من الثوابت يتم قياسها بدقة عالية وصولاً إلى 0.5 نانومتر. للانتماءات مرتفعة للغاية (كد < 500 م)، يمكننا استخدام معايرة تنافسية معيار (الشكل 5) بسبب عدم الدقة في قياس تركيزات الحمض النووي المنافس عند مستويات منخفضة (< 100 nM).
يمكن أن تكون نفذت على ما يقرب من أي معيار الورك فا، مقلوب، مجهر فلوري ابيفلوريسسينسي، قدمت توافر مرحلة XY الآلي ومرحلة محور ع بيزو. المكونات البصرية بنيت حولها إعداد ويديفيلد الآلي مجهزة من الأهداف البعيدة المدى. في الممارسة العملية، يمكن تكييفها للأهداف مع الخصائص الأخرى (في عمل معين، والمسافة والفتحة العددية) المقايسة. ومع ذلك، يتطلب هذا تحسين المعلمات (المسافات بين z-شرائح، المسامية والارتفاع [اغروس] هلام، إلخ.). من الممكن أيضا استخدام أنواع أخرى من الليزر أو الكاميرا. ويرد أدناه وصف مفصل للإجراءات التجريبية بأكملها وتحليل البيانات في المقطع بروتوكول.
Protocol
Representative Results
Discussion
الهيب فا أسلوب جديد شامل لتحديد المناظر الطبيعية تفضيل ملزمة للتفاعلات TF-الحمض النووي. ومن التدابير الانتماءات الملزمة من حيث الحمض النووي عزر المتغيرات مباشرة، تجنب أي الافتراض أن أفضليات ملزمة تنعكس في تواتر حدوث النوكليوتيدات في مجموعة من موثقات فوق العتبة. القياس يجري في الحل دون التثبيت وتدخل الميكانيكية أو الكيميائية برد فعل ملزم، تقارب شروط التوازن قدر الإمكان. نظام التسليم المراقب يسمح قياس منحنى المعايرة الكامل داخل واحدة جيدا ويزيد الإنتاجية والموثوقية في الوقت نفسه توفير البروتين. يسمح استخدام هدفا مع ارتفاع الفتحة العددية والكاميرا م-اتفاقية مكافحة التصحر مع جمع خفيفة عالية كفاءة للكشف عن الضوء الفلورسنت حساسة للغاية. ومن ثم مع هذا الإعداد، فا الصغيرة يتغير منخفضة كما يمكن كشف النائب 10-15 بدقة؛ في الممارسة العملية، وهذا يعني أن أي رد فعل ملزم هو سهولة الكشف عن الزيادة الجماعية بعد ملزم الحد الأدنى (منخفضة كنسبة شامل 2) التي. عادة هذا ليس الحال بالنسبة للنظم التجارية مثل القراء الميكروسكوبية. بسبب حساسية عالية، الورك فا يوسع نطاق ثوابت التفكك التي يمكن قياس موثوق بها في مجموعة بيكومولار. مصممون الطاقات ملزم بدقة على عدة أوامر من ضخامة.
لتقييم نوعية PWMs المنقحة، أجرينا نوعين من التحليل20. نحن اختبار، لخمسة عوامل تجزئة شبكة الجينات، وجيدا كيف يمكن التنبؤ PWMs مختلفة الملامح seq رقاقة تجريبية في مناطق الجينوم 21 تجزئة الجينات. كاختبار ثاني، قمنا باستخدام نموذج التسلسل للتعبير4 أن تتنبأ أنماط التعبير من القدرة على الانقسام على أساس تركيز البروتين وتفضيل ملزمة TFs المشاركة. في كلتا العمليتين، وجدنا أن PWMs الورك فا أقل محددة تؤدي إلى حد كبير أفضل من footprinting أكثر تحديداً و B1H PWMs20.
خلافا لأساليب حيثياته ، الورك فا يتطلب بعض المعرفة المسبقة بالأفضلية المعطاة لفريق العمل ملزم. ومع ذلك، تسلسل توافق معروفة TFs العديد من، والعديد من الأساليب القائمة يمكن توريد منهم13،،من1415. إذا لزم الأمر، تسلسل صحيح الربط الأمثل ويمكن الاطلاع على شكل تكراري.
قمنا باستخدام الحمض النووي إشارة ليغومرات المسمى فلوريسسينتلي مع Cy5 وبوديبي–650. أثبتت هذه الأصباغ أداء جيدا لكرة القدم قياسات نظراً لتباين المنضمة وغير المنضمة المرجع المسمى الحمض النووي الأكبر بين الأصباغ اختبار مختلفة. وهذا ما يضمن طائفة ديناميكية الحد أقصى لقيم كرة القدم. وبصفة عامة، أي صبغة الفلورسنت مع الأسفار عمر ≥ 1 ns يرجح أن يكون مناسباً لكنه يحتاج إلى أن تختبر أولاً. إذا كان ذلك ممكناً، فإنه ينصح باستخدام الأصباغ الاستشعاع في نطاق الأشعة تحت الحمراء القريبة للتقليل من البروتين أوتوفلوريسسينسي.
أن الخطوة الأكثر أهمية من الإجراءات التجريبية هي بيبيتينج الهلام في لوحات جيدا. إمكانية تكرار نتائج جيدة يتطلب أحجام جل أن تكون موحدة قدر الإمكان. التغيرات في الارتفاع جل تترجم إلى تغييرات الانتشارية oligomer الحمض النووي تنافسية، وبالتالي تغييرات واضحة في تقارب عند تقييم البيانات. وهذا هو المصدر الرئيسي للفرق في تكرار تقنية. ويحسن استخدام تقنيات بيبيت أو الأتمتة الإلكترونية إمكانية تكرار نتائج. ويمكن تجنب فقاعات الهواء داخل الجل ببطء وعناية بيبيتينج. من المهم أيضا لإضافة جميع الحلول المنافس على رأس الآبار المعايرة مع تأخير صغيرة قدر الإمكان. لإمكانية تكرار نتائج أفضل، يمكن أن يكون آليا العملية برمتها باستخدام روبوت بيبيتينج مع حاضنات الحرارة. هو جزء هام لنقل البروتوكول لأتمتة التحسين اللازمة لدرجة حرارة الحاضنة وأوقات الاحتضان. تأكد لإيجاد توازن أمثل بين لزوجة الهلام (أي. ولا باردة جداً) والاستقرار للبروتينات (أي، لا حار جداً). وهذا يتوقف على حد سواء على سرعة الاستغناء عن المواد الهلامية في الآبار والاستقرار من البروتين المستخدمة.
الهيب فا يجعل استخدام نظام التسليم المراقب ليغومرات الحمض النووي المنافس. لإنشاء منحنيات المعايرة، من الضروري تحديد تركيز الحمض النووي المنافس c(z,t) لكل معطى z-ضع داخل المصفوفة جل والوقت نقطة t. هذا خطوة حاسمة أخرى، نظراً لعزم كس يعتمد مباشرة على c(z,t). وتستخدم لهذا الغرض (الشكل 1د، الشكل 2) معايرة الآبار التي تحتوي على صبغ ملحوظة كجهاز استشعار لتركيز الحمض النووي. عادة، وتكفي 3-5 معايرة الآبار التي تحتوي على ملاحظة للوحة الواحدة. قبل أن يقيم أي الورك فا التجربة، ينبغي إنشاء منحنى معايرة ملحوظة للإنشاء قبل تنفيذ سلسلة معايرة تقليدية من NB حله في [اغروس] هلام مع منافس الحمض النووي لأي تسلسل بتركيزات مختلفة (الرقم 3 )، كما هو موضح بالتفصيل في الخطوة 8. في حالة ربط قوي جداً (كد < 500 م)، يصبح استقراء المستخدمة لتحديد تركيزات منخفضة من منافس الحمض النووي تحد، نظراً لأنها أقل دقة من قياس مباشر. ومع ذلك، ل TFs مع هذه منخفضة ك قد، يمكن استخدام الإعداد الورك فا القيام معايرة تنافسية تقليدية في المخزن المؤقت ملزم دون استخدام مصفوفة [اغروس] هلام (الشكل 5). على سبيل المثال، يمكن إجراء المعايرة كامل واحد بتركيزات مختلفة 12 من الدنا المنافس في صف واحد من لوحة 96-جيدا.
نظام التسليم المراقب أيضا يتطلب سرعة حركية ملزمة TF-الحمض النووي والبروتينات مستقرة، منذ نشر على الرغم من [اغروس] هلام الديناميكية (على الرغم من بطء). يمكن اختبار كل الخصائص مباشرة مع الإعداد الورك فا بالتالي، مع مرور الوقت، اتحاد كرة القدم TFs للفائدة عندما تلتزم منهما المسمى فلوريسسينتلي مرجع الحمض النووي. قياس معدلات كعلى كOFF لعوامل التحقيق، وتبين لهم أن يكون بناء على أمر من ميلي ثانية إلى ثانية20، وفقا لآخر الدراسات30. هذا سريع بما فيه الكفاية لضمان أن تجري القياسات في التوازن. وفي حالة أخرى ردود فعل ملزم بحركية أبطأ، يمكن ضبطها الانتشارية للمنافس بخفض تركيزه أو تقليل حجم المسام هلام. في حالة اختبار TFs، كلها قد ر سريعقبالة (~ ثانية)، وقت قياس إجمالي حوالي 1-2 ساعة كافية لضمان توازن دينامي حراري في كل قياس.
مشكلة محتملة أخرى تتصل بالبروتين هو تشكيل المجاميع البروتين التي قد تغير من قياسات اتحاد كرة القدم. استخدام شروط المخزن المؤقت الأخرى التي تحتوي على إضافات مختلفة (مثل تينسيديس) يمكن أن يمنع تشكيل التجميعية، إذا لزم الأمر.
وقد عملنا على افتراض الخطي لبوم؛ ومع ذلك، يمكن تحجيم الورك فا لتشمل جميع الطفرات النوكليوتيدات دي ممكن في التسلسل إلى توافق في الآراء. وأخيراً، يمكن تكييفها لقياس أنواع أخرى من التفاعلات ملزمة الورك فا. والشرط الأساسي أن يكون متاح جزيء إشارة مناسبة ملزمة بالبروتين الذي يمكن أن يكون المسمى فلوريسسينتلي. مع نظام التسليم المراقب، يمكن إنشاء تدرج لوني تركيز لأي نوع من [ليغند]؛ ولذلك، يمكن قياس تفاعلات البروتين البروتين والبروتين المخدرات مع المثل العالية الدقة والإنتاجية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر ج. مولر لاستنساخ كدنا وأعضاء من مختبر فرنسي، وخاصة س. بيرجيلت، لمشورة قيمة ونقاش حماسي. وأيد هذا العمل SFB 646، شبكات تنظيمية في التعبير الجينوم والصيانة (كج, P.B.)، المركز للعلوم البروتين المتكامل (عنوان)، ومدرسة الدراسات العليا للعلوم الكمية ميونيخ (ماجستير). تسلم عنوان دعم الأوقيانوغرافية ألماني (SFB 646، SFB 1064، سيبسم، كبم)، أوند فيما für بونديسمينيستيريوم Forschung (الألمانية: أبيو-سيستيمبيولوجي إيننوفاتيونسويتبيويرب)، هومبولدت-المؤسسة (ألكسندر فون همبولدت، و الأستاذية).
Materials
| Cy5-labled 16- / 18-bp DNA-oligomers | Eurofins | Custom synthesis | |
| 16- / 18-bp DNA-oligomers | Eurofins | Custom synthesis | |
| Nile Blue A | Sigma | N5632-25G | |
| Sensoplate plus microplate 96- or 384-well, PS | Greiner | 655891 | 175 µm thick glass bottom |
| 384 Well Sensoplate, black | Greiner | 788896 | |
| Agarose, low gelling temperature | Sigma | A9414-50G | |
| Sodium Chloride | Merck | 1.06404.1000 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379-1L | |
| Di-Potassium hydrogen phosphate trihydrate | Merck | 1.05099.1000 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1.04873.1000 | |
| Q-POD Element | Merck Millipore | ZMQSP0DE1 | |
| Millipak 40 Gamma Gold Filter | Merck Millipore | MPGL04GK2 | |
| Milli-Q Integral 3 Water Purification System | Merck Millipore | ZRXQ003WW | |
| Quantum TIX | Merck Millipore | QTUMOTIX1 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma | 43815-1G | |
| Mastercycler gradient | Eppendorf | Z316083 | |
| SafeSeal tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.706.200 | |
| Tube 15 mL | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Multiply-Pro cup 0.2 mL PP | Sarstedt | 72.737.002 | |
| MICROSCOPY SETUP: | |||
| Automated widefield microscope | LEICA | DMI6000 | |
| Long distance objective | LEICA | HCX PL FLUOAR L 60x/0.60 N.A. Dry | |
| 638 nm line continuous diode laser | Omicron | PHOxX 638-40, 40mW | |
| Back-illuminated EM-CCD Camera | Andor | iXon DV897 | |
| Dichroic mirror | AHF | 640nm cut-off | |
| Bandpass filter | AHF | ET bandpass 700/75 | |
| Linear polarizer | Thorlabs | LPVISC050-MP2 | |
| Polarizing beam splitter | Thorlabs | BS010 | |
| Achromatic lens | Thorlabs | 200 mm focal length | |
| Multimode optical fiber | Optronis | FVP600660710 | |
| ROBOTIC SYSTEM: | |||
| Our robotic system includes a Biomek NXP workstations with a 96-channel head and with Span-8 pipettors, connected with a servo-shuttle, are used for all liquid transfer steps. In addition, the system is equipped with orbital shakers and a microplate reader (Paradigm, Molecular device) served by the Span-8 gripper | Beckman Coulter | Biomek NXP | |
| SOFTWARE: | |||
| Programming language | National Instruments | Labview 9.0 | |
| Script for the HiP-FA software available at | https://github.com/GeneCenterMunich/HiP-FA |
References
- Berg, O. G., von Hippel, P. H. Selection of DNA binding sites by regulatory proteins. Statistical-mechanical theory and application to operators and promoters. Journal of Molecular Biology. 193, 723-750 (1987).
- Hammar, P., et al. Direct measurement of transcription factor dissociation excludes a simple operator occupancy model for gene regulation. Nature Genetics. 46, 405-408 (2014).
- Chen, J., et al. Single-molecule dynamics of enhanceosome assembly in embryonic stem cells. Cell. 156, 1274-1285 (2014).
- Segal, E., Raveh-Sadka, T., Schroeder, M., Unnerstall, U., Gaul, U. Predicting expression patterns from regulatory sequence in Drosophila segmentation. Nature. 451, 535-540 (2008).
- Schroeder, M. D., et al. Transcriptional control in the segmentation gene network of Drosophila. PLoS Biology. 2, 271 (2004).
- He, X., Samee, M. A., Blatti, C., Sinha, S. Thermodynamics-based models of transcriptional regulation by enhancers: the roles of synergistic activation, cooperative binding and short-range repression. PLoS Computionnal Biology. 6, (2010).
- Wilson, M. D., et al. Species-Specific Transcription in Mice Carrying Human Chromosome 21. Science. 322, 434-438 (2008).
- Galas, D. J., Schmitz, A. Dnaase footprinting – simple method for detection of protein-DNA binding specificity. Nucleic Acids Research. 5, 3157-3170 (1978).
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature Protocols. 2, 1849-1861 (2007).
- Liedberg, B., Nylander, C., Lundstrom, I. Surface-plasmon resonance for gas-detection and biosensing. Sensors and Actuators. 4, 299-304 (1983).
- Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nature Communications. 1, (2010).
- Berger, M. F., et al. Compact, universal DNA microarrays to comprehensively determine transcription-factor binding site specificities. Nature Biotechnology. 24, 1429-1435 (2006).
- Nitta, K. R., et al. Conservation of transcription factor binding specificities across 600 million years of bilateria evolution. eLife. 4, (2015).
- Jolma, A., et al. DNA-Binding Specificities of Human Transcription Factors. Cell. 152, 327-339 (2013).
- Noyes, M. B., et al. A systematic characterization of factors that regulate Drosophila segmentation via a bacterial one-hybrid system. Nucleic Acids Research. 36, 2547-2560 (2008).
- Nutiu, R., et al. Direct measurement of DNA affinity landscapes on a high-throughput sequencing instrument. Nature Biotechnology. 29, (2011).
- Riley, T. R., et al. SELEX.-seq: a method for characterizing the complete repertoire of binding site preferences for transcription factor complexes. Methods Molecular Biology. 1196, 255-278 (2014).
- Maerkl, S. J., Quake, S. R. A systems approach to measuring the binding energy landscapes of transcription factors. Science. 315, 233-237 (2007).
- Isakova, A., et al. SMiLE-seq identifies binding motifs of single and dimeric transcription factors. Nature Methods. 14, 316-322 (2017).
- Jung, C., et al. True equilibrium measurement of transcription factor-DNA binding affinities using automated polarization microscopy. Nature Communications. 9, 1605 (2018).
- Weber, G. Polarization of the fluorescence of macromolecules: Fluorescent conjugates of ovalbumin and bovine serum albumin. Biochemical Journal. 51, 155-168 (1952).
- . Github Available from: https://github.com/Reutern/PySite (2018)
- . Github Available from: https://githum.com/GeneCenterMunich/HiP-FA (2018)
- Roehrl, M. H., Wang, J. Y., Wagner, G. A general framework for development and data analysis of competitive high-throughput screens for small-molecule inhibitors of protein-protein interactions by fluorescence polarization. Biochemistry. 43, 16056-16066 (2004).
- St Johnston, D., Nuesslein-Volhard, C. The origin of pattern and polarity in the Drosophila embryo. Cell. 68, 201-220 (1992).
- Pankratz, M., Jäckle, H., Bate, M., Martinez Arias, A. . The Development of Drosophila melanogaster, Vol. 1. , 467-516 (1993).
- Zhao, Y., Ruan, S. X., Pandey, M., Stormo, G. D. Improved Models for Transcription Factor Binding Site Identification Using Nonindependent Interactions. Genetics. 191, (2012).
- Noureddine, M. A., et al. Probing the functional impact of sequence variation on p53-DNA interactions using a novel microsphere assay for protein-DNA binding with human cell extracts. PLoS Genetics. 5, 1000462 (2009).
- Veprintsev, D. B., Fersht, A. R. Algorithm for prediction of tumour suppressor p53 affinity for binding sites in DNA. Nucleic Acids Research. 36, 1589-1598 (2008).
- Geertz, M., Shore, D., Maerkl, S. J. Massively parallel measurements of molecular interaction kinetics on a microfluidic platform. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 16540-16545 (2012).
