蛍光顕微鏡を使用して競争力のある滴定による転写因子の DNA 結合親和性の高感度測定

1. 偏光顕微鏡 広視野レーザ照明のフォーカスを連続的なダイオード レーザーの 638 nm 行 (40 mW) ビームのクリーンアップのためのマルチモード光ファイバーの開口部。レーザー光の偏光状態を設定するのには、ファイバーの出力で直線偏光子をマウントします。 ダイクロイック ミラー (640 nm のカット) とバンドパス フィルター (帯域 700/75) 発光の励起コンポーネントをブロックします。 その垂直と平行偏光成分に放出される光を分割偏光ビームスプリッターを通過する蛍光信号をしましょう。その後に焦点を当てる非反射ビーム (並列コンポーネント) と 200 ミリメートルの焦点距離の色消しレンズで反射されたビーム (垂直コンポーネント) (図 1bと1 c) 裏面照射型 EM CCD カメラのチップ。ミラーを使用すると、レンズに向かって垂直ビームの方向を調整します。 2 設計および参照の蛍光標識 DNA オリゴマーのテスト 参照 DNA のコア シーケンスを確認: 転写因子とのバインディングの競合ラベルのないライバル DNA オリゴマーの解離定数 (KD2) を測定する競争の試金をに基づいてメソッドを蛍光に分類された DNA の TF にアフィニティが参照 (KD1) として機能します。他のソースから得られるコンセンサス配列のように DNase フット プリントまたは細菌 1 ハイブリッド開始ポイント5,15として使用できます。注: 親指のルールとして、DNA の一致シーケンスと比較して TF に結合親和性 7 倍低下する 3 適切な参照。 ヒップ fa KD1s を前の手順で派生したコンセンサス配列の 2-3 仮単一突然変異の測定します。バインディングの完全な損失を避けるためにも固有ではない一致シーケンス内の位置を変更してみてください。注意: リファレンス ・ シーケンスが (私達はこのプロトコルの巨大な Gt で使用)、興味の転写因子に拘束されることが重要ですが、余りに強く、弱い競争相手が高濃度で打ち勝つことができますように。 拡張コア モチーフ (8-12 ペアを一般的にベース) による対称を追加する以上 16 塩基対の長さに並ぶ両側 (追加する適切なバインディングの側鎖) のシーケンス。必要に応じて (長時間拘束ドメイン、たとえば)、(〜 50 基本対の長さ腰 FA 試金でテスト済み) まで長いシーケンスを使用します。注意: は異所性結合部位を作成する予想される拠点を追加しないように注意してください。(例えば、 PySite22) このプロセスを容易に使用可能な Pwm から結合部位を予測計算ツールを使用します。 ラベル参照 DNA として蛍光でラベル付けされている順序オリゴマーでは転送するか、または逆に 3’、5′ 端のストランド。たとえば cy5 の組合せ、Bodipy 650 または 10 μ m (100 μ M 10 x の在庫) 水と希釈濃度で他の適切な染料として段階的手順 3.1 で説明を使用します。 33 mM カリウム リン酸バッファーを追加して 500 mL の結合バッファー × 1 を準備 (pH = 7.0)、90 mM, 塩化ナトリウムと蒸留水で 0.01% 非イオン性洗剤。また 3 x 3 倍濃度でを除いて同じコンポーネントが含まれる結合バッファーを準備します。原液として x 結合バッファー 1 の結合バッファー x 3 を使用する場合準備ボリューム > 500 mL。そうでなければ、250 mL を準備します。注: この構成は、転写因子安定しグルタチオン s-トランスフェラーゼ (GST) 二量体化を防ぐために最適化されていました。 0.8 を含む結合バッファーを 200 μ l 添加の FA 手順 1 で説明した測定顕微鏡のセットアップで nM を参照ガラス底顕微鏡 96 ウェル プレート (TF 濃度の異なる 5-6 ウェルズ) TF の異なる量の存在下で DNA を標識使用する TF 濃度を決定します。TF の増加額で滴定シリーズを実行し、試金のためカーブを DNA 参照オリゴマーの完全な結合を示す高原に達する濃度を選択します。注: 最適な TF 濃度は TF DNA 解離定数の値に依存します。一般的に、低い KDsは低濃度を必要とします。 3. オリゴマー焼鈍 ラベル付き参照 (前の手順で決められた順) DNA の DNA オリゴマーをアニール、7 μ L 色素標識 10 mM の前方の単一座礁させた DNA 溶液と水の 186 μ L でそのラベルのない逆の補数の 10 mM 濃度の 7 μ L を混ぜます。 ライバルの DNA シーケンスのためミックス 20 μ L (水、製造元によって提供される) で 100 mM ソリューションの対応する逆の 100 mM の 20 μ L で前方の単一座礁させた DNA の一本鎖測定する個人競技者の各シーケンスの DNA。 熱処理を施した別標準 PCR サーマルサイクラー 3 分 70 ° C までのソリューションを加熱し、0.1 K/s の速度で RT に温度低下によってを実行します。PCR 機がその速度で温度勾配をサポートしていない場合は単に気温の低下とともに段階的な孵化を行う (テストされた 3 の 99 サイクル サイクルあたり-0.40 k s)。 4. ゲル作製 注: 次のセクションについて説明しますジェルの 2 種類の準備: 1) 滴定井戸蛋白質が付いているゲルを含み、それぞれライバルの DNA シーケンスのためDの K を決定するために使用し、2) 校正井戸に NB の使用すべての特定の時間ポイントと獲得高さで DNA 濃度を決定します。96 ウェル プレートで実験の準備にフォーカスがあるが、384 ウェル プレート形式の対応するボリュームが示されています。 研究所電子レンジで沸騰することにより結合バッファーで 0.5 %w/v 低融点アガロースを溶解します。完全な分解の後 ddH2O 可能の蒸発を補うために、もう一度ボリュームを調整します。注: 利便性のためのゲルの 10 20 10 mL 因数の在庫を準備、75 ° c が必要なときそれらを溶かします。室温ゲル株式を格納できます。注意: は、電子レンジでゲル溶液の過熱を避けるために注意してください。短い加熱時間の間揺れとの間隔が望ましい。 滴定および校正の井戸を準備するには、最初揺れ下 75 ° C で 2 つの 10 mL ゲル株式因数を溶かします。 各競技者の 240 μ L (20% のオーバーヘッドを含む) を使用 (n = ライバル シーケンスの数)。 等しい温度と両方のゲルの粘性を確保するのに NB 校正もゲルの同じボリュームを使用します。 35 ° C に温度を設定し、平衡に温度を待ちます。 滴定井戸 1.4 nM (最終濃度) 交配参照 DNA (で得られたステップ 3) TF タンパク質を追加 (最終濃度 CTF = 20-60 nM ステップ 2.6 で決定した)、n x 200 μ L または、96 n x 13 μ L の総ボリュームでバッファーの DTT (0.2 mM)、およびバインディング-384 ウェル プレートそれぞれ (プラス オーバーヘッド) の形式、または。反転振動で徹底的にミックス (ボルテックスにかけないでください)。 ゆっくりとウェル プレート滴定井戸に前の手順で作製したゲル溶液の 96 ウェル プレート形式 (386 井戸 13 μ L/ウェル) ウェルあたり 200 μ L を追加します。 校正井戸最初追加 5 nM NB (合計ボリューム調整数と使用するウェル プレート形式によって井戸; 通常 5-6 ウェル プレートあたりで十分です) の井戸の外溶けたゲル。 ピペットの 200 μ L (384 ウェル プレート形式の 13 μ L) ニオブ添加ゲルのウェル プレート滴定ウエル内でゆっくりと気泡を避けるようにしてください。注: 電子 pipets またはロボットの使用状況は、再現性を著しく増加します。 常温では、10 分の 4 ° C で別の 10 分を固めるゲルを聞かせて (結露ガラスからその後必要に応じてを削除) します。不均一なゲルの表面を避けるために完全に水平面上のこれらのすべての手順を実施することを確認します。注意: タンパク質含有ゲルは通常安定した 4 ° C で、少なくとも数時間、 5. ライバル DNA ソリューションを追加します。 注: 以下の解決策は滴定を開始する前に準備する必要があります、同時に校正と滴定の井戸の上に追加されます。 焼なましラベル参照 DNA および蛋白質結合バッファー x 3 で 3 回でゲル株式因数より高い濃度を追加します。 それぞれ 40 μ L で得られた溶液のミックス 20 μ L は、手順 3 で取得した競合企業 DNA ソリューションを熱処理しました。 各校正も焼鈍競合 (同じ長さの任意のシーケンスに適して) DNA の 40 μ L で 15 mM NB ソリューションを含む結合バッファー x 3 の 20 μ L をミックスします。注: 384 ウェル プレート、合計で 60 μ L ではなく 21 μ L を使用します。 必要に応じて、380 で吸光度を測定することによって分光板のさまざまな坑井のゲルの高さレベルの均一性をチェック (吸光度値がゲルの高さに比例して) ウェル プレート リーダーを使用して nm。 (手順 3 で焼鈍) 混合競技者 DNA ソリューション、ゲルの上に 50 μ L (384 ウェル プレート形式の 7 μ L) を追加します。利用可能な場合、電子マルチ チャンネル pipets または 96 チャネル ピペッティング ヘッドを使用して可能な限り同時にすべての競合他社のソリューションを追加しようとしました。競合他社のソリューションの付加の後で顕微鏡段階のプレートを置き、測定はすぐに (ステップ 7) を始めます。 6. 画像の取得 Zのシリーズも順次取得-スタック (例えば、使用 12 面と照明時間の 100-300 ms)。よく表面に余りに近くで画像撮影を避けるため (< ここで使用される板で ~1.4 μ m) 任意偏波のバイアスを除外します。 ラベルの参照、DNA、TF からの完全なバインド解除まで測定の 10-25 サイクルを行います。エンドポイントはバインディングと競技者 DNA の拡散によって 1-2 時間後通常達されます。 7. FA(z,t)の生データからの抽出 ウェル プレートをイメージされている、一度生蛍光画像から偏波 (I+) (I=) 平行、垂直に興味の領域強度コンポーネント (図 1c) のピクセルの平均値を計算します。これは、ヒップ FA ソフトウェア23を使用して自動的に行うことができます。注: ヒップ FA ソフトウェア、取扱説明書、およびテスト データセットは、ダウンロードした23をすることができます。また、以下で詳細に説明されているよう私は= 、私+を抽出し、滴定曲線の下流の分析を実行するその他のカスタム書かれたソフトウェアを使用します。 各ウェルの FA を計算します。各ウェルのスクリプトが各 z 位置でFA(z,t)を計算し、時点tによると。式 1:ここで G は垂直チャネルというバイアスの G 因子を修正する計測器です。 知られている異方性の蛍光色素を含む任意の溶液の FA を測定することにより顕微鏡のセットアップの G 因子を決定します。信号の 2 つの偏光成分を抽出し、式 1 を使用してGソリューションの FA を知ることを得る (G = このセットアップで 1.15)。 8. FANBからライバル DNA 濃度の定量のための検 各前方および逆引き参照のオリゴマー (100 mM ストック濃度; 使用するライバル シーケンスが同じ長さで任意のランダム シーケンス) の 120 μ L をアニールと NB を含む結合バッファー x 3 の 120 μ L ミックス (15 nM)。 合計で 6 希釈で x 結合バッファー 1 で 1:2 の希釈で希釈系列を準備します。200 μ L x 5 を含む結合バッファー 1 で 0.5% 低融点アガロース (T > 35 ° C) ゲルのこれらの希釈のミックス 50 μ L をトリプリケートで NB の nM。 96 ウェル プレートの前の手順で準備 6 ソリューションの各 200 μ L を追加し、完全なゲル化、ルート メジャー FA ソリューションのNBでヒップ FA セットアップを使用して、1 時間を確保するための 4 ° C で 1 時間のプレートを格納します。 前の手順に従ってFANB (z, t)を抽出し、ヒルの式を使用してデータに合います。式 2:CDNAが DNA オリゴマーの濃度をk結合部位の半分で DNA オリゴマーの濃度が占められる;FAmaxは正規化定数;nはヒル係数。k、 FAmaxとnは、フィッティング処理中にパラメーターとして設定されます。 (左下のパネル)、ヒップ FA ソフトウェアのフィッティング処理から得られる 3 つのパラメーターを入力します。 検数ヵ月ごとまたは顕微鏡のセットアップで変更した後定量を繰り返します。 9. ライバル DNA 濃度の定量 ヒップ FA ソフトウェアを使用して、c を抽出する (z、t)からFANB(z, t)測定 (図 3)。まず前のセクションで説明するよう校正曲線を取得し、継ぎ手パラメーターをソフトウェアに入力してください (詳細についてはマニュアルを参照してください)。 C < 100 nM (詳細についてはマニュアルを参照してください) を使用するためc(z,t)を自動的に推定するプログラムを使用して agarose のゲルのマトリックス内で競合企業 DNA の一次元拡散を記述する方程式 3 (図 3b) と仮定すると自由拡散。式 3:C0は競合企業 DNA の初期濃度です。erfは誤差関数;zは位置;Dは競合企業 DNA の拡散係数です。t0測定の開始時刻です。使用無料のパラメーターが C0 z/. 10 非常に強力な DNA 結合のヒップ fa 従来の競争力のある滴定 連続濃度の 96 ウェル プレート (または 384 ウェル プレート) の行に異なる競合企業 DNA オリゴマーを希釈: 0、1.25、3.5 インチ、9、19、45、90、190、425、900、1900 年と 4000 nM。Cy5 標識参照 DNA を追加 (1 nM) との結合バッファー (図 5、) ウェルあたり 200 μ L の容量で、一定の濃度で TF (20 ~ 50 nM)。熱力学の平衡を達成するまでに 40 分を待つし、(ヒップ FA セットアップ) と連携して各ウェルの z スタック (計算の FA 値を平均することによって変動を減少ウェルあたりのいくつかの画像を取得)。 平衡バインディングの滴定曲線を構築し、方程式 4 (図 5b) とそれらに合います。KDs は、従来の競争力のある滴定と同じによって得られる股関節 FA agarose のゲル行列20を使用して決定されます。 11 FA の滴定曲線のフィッティング手順 表示ヒップ FA ソフトウェアの個人競技者のシーケンスのため再建された滴定曲線FA(z,t) = f[c(z,t)]データの品質を視覚的に確認し、(詳細についてはマニュアルを参照してください)。必要な場合は、手順 10 でライバル DNA 濃度の定量に使用するパラメーターを絞り込みます。 競争力のある滴定試金24の解析解を与える方程式 4 を使用して自動的に各個々 の滴定曲線を合わせてください。式 4::ここでRTは蛋白質の集中;LTは、ラベル付けされていないとLSTは分類された DNA の集中;KD2は解離定数が決定されます。RTは作業中のタンパク質の濃度AとBは、正規化パラメーター。まずKD1、異なるKD2の値の決定のための参照として機能するを確認します。KD1はラベルのない競技者 DNA のシーケンスとして色素参照 DNA の配列を選択することによって容易にアッセイで判断できます (マニュアル参照)。 ソフトウェアで KD1の値を入力し、プレートのすべてのライバル DNA KD2の値を計算します。注: フィッティング処理の自由パラメーターがKD2 RT、 A、およびb. 解離定数KD2およびアクティブな蛋白質RTプレートのすべての個々 の滴定井戸の濃度をソフトウェアで「エクスポート」ボタンをクリックしてエクスポートします。 12. PWM 建設、蛋白質 DNA 相互作用と擬似カウントの特異性 20を前述のように、オンライン ツール WebLogo 3.0 (http://weblogo.threeplusone.com/create.cgi) を使用して別の Pwm のシーケンスのロゴを作成します。