Análise de cisalhamento induzida pelo fluxo de migração de murino Marginal Zone B células In Vitro

Células do sistema imune são as células mais motile no organismo humano e muitas vezes têm que lidar com a força de cisalhamento do fluxo de sangue e da linfa. No entanto, existem relativamente poucos estudos sobre a migração induzida por força de cisalhamento de leucócitos^1,2,3,4,5. Apresentamos aqui um protocolo confiável e quantitativo para analisar a resposta de uma célula imune ao fluxo in vitro. Realizar o ensaio não exige a fabricação de componentes, e todos os equipamentos e bens de consumo estão disponíveis comercialmente. O protocolo, incluindo análise de purificação e migração de células, pode ser executado em um único dia. Finalmente, embora descrevemos a migração de células B de zona marginal (MZBs), o protocolo pode ser adaptado para analisar a migração contra fluxo de outros tipos de células do sistema imunológico. Portanto, é possível usar este teste para analisar sistematicamente uma ampla gama de leucócitos com um painel abrangente das condições.

MZBs são uma população de células B que, no rato, são encontrados apenas no baço e no serviço de transporte entre o interior dos folículos e as zonas marginais^6,7,8,9. A zona marginal é uma camada de células imunitárias aproximadamente 5 a 10 células grossas. A camada de células envolve o folículo e consiste principalmente de MZBs e macrófagos, mas também invariável naturais assassinos (iNKT) as células T, células dendríticas (DCs) e os neutrófilos, entre outros¹⁰. As células da zona marginal são expostas ao fluxo unidirecional de sangue provenientes de artérias esplênica que terminam em um seio marginal ao redor do folículo. O sangue flui de buracos no seio marginal através da zona marginal é coletado em seios venosos na polpa vermelha e restaurado para a circulação de¹¹. O fluxo livre do sangue lava sobre os MZBs e expõe-los aos antígenos transportados no sangue. Os MZBs carregam o antígeno para o folículo por vaivém automaticamente entre a zona marginal e dentro do folículo, o que não é exposto ao sangue. Assim, como MZBs shuttle para o folículo, eles devem migrar da força de cisalhamento do fluxo de sangue¹² (figura 1A).

Neste protocolo, descrevemos como determinar quantitativamente como imune as células tais como MZBs responder sem fluxo ou fluxo elevado in vitro, a fim de revelar como eles são programados para migrar em vivo. Na primeira etapa, MZBs são purificados de um baço de rato usando grânulos magnéticos acoplados aos anticorpos de kits disponíveis comercialmente. Os MZBs recentemente isoladas são introduzidos dentro do poço de um slide de câmara de fluxo, permitiu resolver para ligantes integrina e expostos ao fluxo de buffer de migração usando um sistema de bomba (Figura 2A). As células são fotografadas usando um sistema de Time-Lapse vídeo microscopia. As imagens são então processadas para análise com um plugin grátis ImageJ,^13,MTrack2¹⁴, para controlar automaticamente as células. Faixas em seguida podem ser quantificadas com o livre Ibidi quimiotaxia ferramenta¹⁵ para determinar vários parâmetros, incluindo velocidade, retidão e índice de migração. Estes valores podem ser usados para determinar os efeitos de inibidores de migração, estimuladores de célula, quimiocinas e outros produtos químicos que afetam a migração para a migração de cisalhamento-fluxo induzido a fim de compreender as forças que controla o movimento de células imunes in vivo.