生体外でマウス縁帯 B 細胞のせん断流動誘起移行の解析
Summary
辺縁帯 B 細胞 (MZBs) は、流れを自分の移行パスを再定位せん断流の力に対応します。このプロトコルは、記録し、流体工学ユニット、ポンプ、顕微鏡イメージング システム、フリー ソフトウェアを使用して移行を分析する方法を示しています。
Abstract
辺縁帯 B 細胞 (MZBs) は、卵胞を包むマウス脾辺縁ゾーンに存在する B 細胞の人口です。卵胞に到達、MZBs は血流のせん断力を移行する必要があります。この流動誘起 MZB 移行を体外の解析方法をご紹介します。まず、MZBs はマウスの脾臓から分離されます。第二に、MZBs はフロー チャンバー スライドでインテグリンのリガンドに定住、せん断流れに公開され、移行中の顕微鏡イメージを作成します。第三に、MTrack2 の自動細胞 ImageJ、トラッキングのプラグインを使用して移行の MZBs のイメージを処理して結果セル トラックが Ibidi 走化性ツールを使用して量を示されます。移行データは、セルがどのように高速移動、どのくらいの頻度彼らは方向を変更、かどうかせん断流動ベクトルに影響、その移行の方向、どのインテグリンのリガンドが関与しているを明らかにします。我々 は、MZBs を使用して、メソッド簡単にせん断流の力に反応する白血球の移行を分析するために適応できます。
Introduction
免疫細胞は人間の体内で最も運動性細胞、しばしば血液とリンパの流れからのせん断力と争わなければなりません。ただし、白血球1,2,3,4、5のせん断力による移動の研究は比較的少ないがあります。流れ体外への免疫細胞の応答を分析するための信頼のおける定量的プロトコルをご紹介します。アッセイを実行してもコンポーネントの作製が必要ありませんし、市販されているすべての機器および消耗品。1 日で細胞の浄化、移行の分析など、プロトコルを実行できます。最後に、辺縁帯 B 細胞 (MZBs) の移行を説明するがプロトコルを適応免疫細胞の他のタイプの流れに対して移行を分析することができます。したがって、この試金を使用して、条件の包括的なパネルと白血球の広い範囲を体系的に分析することは不可能です。
MZBs は、マウスの脾臓とシャトルでのみ発見されている B 細胞の人口卵胞の内部とマージナル ゾーン6,7,8,9間。辺縁帯厚約 5-10 の免疫細胞細胞の層であります。細胞層卵胞を包んで、10に、MZBs とマクロファージが、また不変の自然なキラー T (iNKT) 細胞、樹状細胞 (Dc) および他の中の好中球を主に成っています。辺縁帯の細胞は、卵胞周囲辺縁洞で終了している脾動脈から発生した単方向血流にさらされています。血辺縁帯を通じて縁洞の穴から流れるは赤脾静脈洞で収集し、11循環に復元します。血液の流動、MZBs を洗うし、血で運ばれる抗原にそれらを公開します。MZBs は、自動的に血液にさらされない卵胞の内側と辺縁帯間の往復で卵胞に抗原を運ぶ。したがって、MZBs へシャトルバス卵胞、として血流12 (図 1 a) せん断力を移行する必要があります。
このプロトコルでは定量的免疫細胞など MZBs がない流れまたは生体外で高流量に対応方法を決定する方法について述べる、明らかにどのようにするためにプログラムの体内に移行します。最初のステップで MZBs は市販のキットからの抗体に結合した磁気ビーズを用いたマウス脾臓から浄化されます。新鮮単離の MZBs が流れチェンバー スライドのウェルに導入、インテグリンのリガンド、着地させて、ポンプ システム (図 2 a) を使用して移行バッファーの流れにさらされています。セルは、タイムラプス ビデオ顕微鏡システムを使用して作成されます。無料の ImageJ のプラグイン、MTrack213,14、自動的にセルを追跡する分析のため、画像が処理されます。トラックは、速度、真直度、マイグレーション インデックスなど様々 なパラメーターを決定する無料 Ibidi 走化性ツール15定量化することができます。これらの値は、体内の免疫細胞の動きを制御する力を理解するためにせん断流移行に関する移行阻害剤、細胞刺激、ケモカイン、および他の移行に影響を与える化学物質の影響を決定する使用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
せん断流の力を検出し、その移行を変えることによって反応する細胞の移動を分析するための方法をご紹介します。MZBs の分析は示した MZBs が ICAM 1、フローの存在下で自発的に移行、流れに移行されます。我々 の以前の仕事では、MZBs は VCAM 1 の流れを移行しないが、代わりに場所は固定されたままを示した。マウスの脾辺縁帯には、赤脾髄には、icam-1 および VCAM 1 が含まれていますがの ICAM…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、k. d. f.」ドイツ研究振興協会「SFB 854/TP11 から助成金によって支えられた
Materials
| VWR Cell Strainer, 70 µm | VWR | 10199-656 |
| Pre-Separation Filters, 30 µm | Miltenyi | 130-095-823 |
| MZB and FOB cell isolation kit | Miltenyi | 130-100-366 |
| B220 CD45R, clone RA3-6B2, FITC | Biolegend | 103206 |
| CD21 / CD 35, clone 7G6, APC | BD Biosciences | 558658 |
| CD23, clone B3B4, PE | Biolegend | 101608 |
| HBSS | Biochrom | L2035 |
| D-PBS 1x | Gibco by Life Technologies | 14190-094 |
| BSA albumin fraction V, fatty acid-free | Roth | "0052.3" |
| ICAM-1 | R&D Systems | 796-IC-050 |
| Ibidi µ-slides VI 0.4, hydrophobic, uncoated | Ibidi | 80601 |
| Perfusion set, white, 50 cm, 0.8 mm | Ibidi | 10963 |
| Ibidi Pump system | Ibidi | 10902 |
References
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