تحليل القص الناجمة عن تدفق الهجرة من المنطقة الهامشية الفاري ب الخلايا في المختبر
Summary
منطقة هامشية ب الخلايا (مزبس) الاستجابة لقوة تدفق القص بإعادة توجيه مسار الهجرة تدفق. هذا البروتوكول يوضح كيفية تسجيل وتحليل الهجرة استخدام وحدة فلويديكس، مضخة، ونظام التصوير بالمجهر، والبرمجيات الحرة.
Abstract
منطقة هامشية ب الخلايا (مزبس) هي عدد سكانها ب الخلايا التي توجد في مناطق الماوس هامشية الطحال الذي يطوق المسام. للوصول إلى المسام، يجب ترحيل مزبس قوة القص لتدفق الدم. ونقدم هنا طريقة لتحليل هذا الناجم عن تدفق MZB الهجرة في المختبر. أولاً، يتم مزبس المعزولة من الطحال الماوس. وثانيا، استقر على يغاندس إنتغرين في شرائح الدائرة تدفق مزبس وتتعرض للقص تدفق وتصويرها تحت مجهر أثناء ترحيل. ثالثا، تتم معالجة الصور مزبس ترحيل استخدام الخلية التلقائي MTrack2 تتبع البرنامج المساعد إيماجيج، وكمياً المسارات الخلية الناتجة باستخدام أداة إنزيمية عبدي. وتكشف بيانات الهجرة مدى سرعة نقل الخلايا وكيف في كثير من الأحيان أنها تغير الاتجاه، وعما إذا كان ناقل تدفق القص يؤثر على اتجاه الهجرة وتشارك فيه يغاندس إنتغرين. على الرغم من أننا نستخدم مزبس، الأسلوب يمكن تكييفها لتحليل الهجرة من أي الكريات البيض الذي يستجيب إلى قوة تدفق القص بسهولة.
Introduction
الخلايا المناعية هي الخلايا الأكثر متحركة في الجسم البشري، وغالباً ما يجب أن يتعامل مع قوة القص من تدفق الدم والليمفاوية. ومع ذلك، هناك دراسات قليلة نسبيا على الهجرة الناجمة عن قوة القص من الكريات البيضاء1،2،3،،من45. نحن الحاضرين هنا بروتوكولا موثوقة والكمية لتحليل استجابة إحدى الخلايا المناعية للتدفق في الأنابيب. لا تتطلب إجراء المقايسة تصنيع المكونات، وجميع المعدات والمواد الاستهلاكية متوفرة تجارياً. يمكن تنفيذ البروتوكول، بما في ذلك خلية تحليل تنقية والهجرة، في يوم واحد. وأخيراً، على الرغم من أن يصف لنا هجرة الخلايا باء منطقة هامشية (مزبس)، يمكن تكييفها مع البروتوكول لتحليل الهجرة ضد تدفق أنواع أخرى من الخلايا المناعية. ولذلك، من الممكن لاستخدام هذا التحليل لمنهجية تحليل طائفة واسعة من الكريات البيضاء مع لوحة شاملة للظروف.
مزبس هي عدد سكانها ب الخلايا التي تم العثور عليها فقط في الطحال والمكوك، في الماوس، وبين المناطق داخلية المسام والمناطق الهامشية6،7،،من89. منطقة هامشية طبقة من الخلايا المناعية حوالي 5 – 10 خلايا سميكة. طبقة الخلايا مظاريف المسام ويتكون أساسا من مزبس والضامة ولكن أيضا ثابتة الطبيعية القاتل تي (إينكت) الخلايا والخلايا الجذعية (DCs) والعدلات، بين أمور أخرى10. الخلايا في المنطقة الهامشية التي تتعرض لتدفق الدم أحادي الاتجاه التي تنشأ من الشرايين الطحال الذي ينهي في تجويف هامشية المحيطة المسام. الدم يتدفق من ثقوب في الجيوب الأنفية هامشية من خلال منطقة هامشية وهي ثم جمعها في الجيوب الوريدية في اللب الأحمر واستعادتها إلى تداول11. يغسل أكثر مزبس الحرة–تدفق الدم ويعرضهم لمولدات المضادات في الدم. تحمل مزبس antigen في المسام بجولات مكوكية تلقائياً بين منطقة هامشية وداخل المسام، التي لم تتعرض للدم. وهكذا، كالمكوك مزبس نحو المسام، يجب أن يهاجر قوة القص ل تدفق الدم12 (الشكل 1A).
في هذا البروتوكول، ونحن تصف كيفية تحديد الكمية كيف الخلايا المناعية مثل مزبس الاستجابة للا تدفق أو تدفق عالية في المختبر، بغية الكشف عن الكيفية التي يتم برمجتها لترحيل في فيفو. في الخطوة الأولى، يتم تنقية مزبس من طحال ماوس استخدام الخرز المغناطيسية بالإضافة إلى الأجسام المضادة من مجموعات المتاحة تجارياً. أدخلت في البئر لشريحة الدائرة تدفق مزبس طازجة معزولة، وسمح لهم بالتوطن على يغاندس إنتغرين، وعرضه لتدفق الهجرة المخزن المؤقت باستخدام نظام مضخة (الشكل 2A). يتم تصويرها الخلايا باستخدام نظام الوقت الفاصل بين الفحص المجهري فيديو. ثم تتم معالجة الصور للتحليل مع البرنامج المساعد ImageJ حرة، MTrack2،من1314، لتعقب الخلايا تلقائياً. ثم يمكن قياس المسارات مع أداة إنزيمية عبدي الحرة15 لتحديد معلمات مختلفة بما في ذلك السرعة، والاستقامة، ومؤشر الهجرة. يمكن استخدام هذه القيم لتحديد آثار الهجرة مثبطات، المنبهات الخلية والمستقطبات وغيرها من المواد الكيميائية التي تؤثر على الهجرة على الهجرة الناجمة عن تدفق القص بغية فهم القوى السيطرة على حركة الخلايا المناعية المجراة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف لنا هنا طريقة لتحليل هجرة الخلايا التي كشف قوة تدفق القص والاستجابة عن طريق تغيير هجرتها. وأظهر تحليل مزبس أن مزبس ترحيل تلقائياً على المتكاملة-1 وبحضور التدفق، وسيتم ترحيل تدفق. في أعمالنا السابقة، واظهرنا أن مزبس لا يتم ترحيل تدفق على VCAM-1 ولكن بدلاً من ذلك تبقى ثابتة في مكانها. منطقة ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
بتأييد هذا العمل من المنح المقدمة من “دويتشه الأوقيانوغرافية” SFB 854/TP11 إلى العاصم ك.
Materials
| VWR Cell Strainer, 70 µm | VWR | 10199-656 |
| Pre-Separation Filters, 30 µm | Miltenyi | 130-095-823 |
| MZB and FOB cell isolation kit | Miltenyi | 130-100-366 |
| B220 CD45R, clone RA3-6B2, FITC | Biolegend | 103206 |
| CD21 / CD 35, clone 7G6, APC | BD Biosciences | 558658 |
| CD23, clone B3B4, PE | Biolegend | 101608 |
| HBSS | Biochrom | L2035 |
| D-PBS 1x | Gibco by Life Technologies | 14190-094 |
| BSA albumin fraction V, fatty acid-free | Roth | "0052.3" |
| ICAM-1 | R&D Systems | 796-IC-050 |
| Ibidi µ-slides VI 0.4, hydrophobic, uncoated | Ibidi | 80601 |
| Perfusion set, white, 50 cm, 0.8 mm | Ibidi | 10963 |
| Ibidi Pump system | Ibidi | 10902 |
References
- Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Current Opinions in Cell Biology. 20 (5), 525-532 (2008).
- Dominguez, G. A., Anderson, N. R., Hammer, D. A. The direction of migration of T-lymphocytes under flow depends upon which adhesion receptors are engaged. Integrative Biology (Cambridge). 7 (3), 345-355 (2015).
- Steiner, O., et al. Differential roles for endothelial ICAM-1, ICAM-2, and VCAM-1 in shear-resistant T cell arrest, polarization, and directed crawling on blood-brain barrier endothelium. Journal of Immunology. 185 (8), 4846-4855 (2010).
- Valignat, M. P., Theodoly, O., Gucciardi, A., Hogg, N., Lellouch, A. C. T lymphocytes orient against the direction of fluid flow during LFA-1-mediated migration. Biophysical Journal. 104 (2), 322-331 (2013).
- Woolf, E., et al. Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces. Nature Immunology. 8 (10), 1076-1085 (2007).
- Cinamon, G., et al. Sphingosine 1-phosphate receptor 1 promotes B cell localization in the splenic marginal zone. Nature Immunology. 5 (7), 713-720 (2004).
- Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W., Cyster, J. G. Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport. Nature Immunology. 9 (1), 54-62 (2008).
- Cyster, J. G., Schwab, S. R. Sphingosine-1-phosphate and lymphocyte egress from lymphoid organs. Annual Reviews in Immunology. 30, 69-94 (2012).
- Schwab, S. R., Cyster, J. G. Finding a way out: lymphocyte egress from lymphoid organs. Nature Immunology. 8 (12), 1295-1301 (2007).
- Cerutti, A., Cols, M., Puga, I. Marginal zone B cells: virtues of innate-like antibody-producing lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 13 (2), 118-132 (2013).
- Mebius, R. E., Kraal, G. Structure and function of the spleen. Nature Reviews Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).
- Tedford, K., et al. The opposing forces of shear flow and sphingosine-1-phosphate control marginal zone B cell shuttling. Nature Communications. 8 (1), 2261 (2017).
- ImageJ. MTrack2 Available from: https://imagej.net/MTrack2 (2018)
- . MTrack2 Available from: https://valelab4.ucsf.edu/~nstuurman/IJplugins/MTrack2.html (2018)
- . Chemotaxis and Migration Tool Available from: https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html (2018)
- Reeves, J. P., Reeves, P. A. Removal of lymphoid organs. Current Protocols in Immunology. , (2001).
- . Manual Tracking Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/manual-tracking.html (2018)
- . ibidi Pump System Available from: https://ibidi.com/perfusion-system/112-ibidi-pump-system.html (2018)
