Analyse der Scherung strömungsinduzierte Migration der Murine Marginal Zone B-Zellen In Vitro

Immunzellen sind die meisten bewegliche Zellen im menschlichen Körper und müssen oft mit Querkraft von Blut und Lymphe Strömung kämpfen. Allerdings gibt es vergleichsweise wenige Studien auf Scherung Kraft-induzierte Migration von Leukozyten^1,2,3,4,5. Wir stellen Ihnen hier eine zuverlässige und quantitative Protokoll um die Reaktion der einer Immunzelle auf in-vitro-Fluss zu analysieren. Durchführung des Tests erfordert keine Herstellung von Komponenten und alle Geräte und Verbrauchsmaterialien sind im Handel erhältlich. Das Protokoll, einschließlich Reinigung und Migration Zellanalyse, kann an einem einzigen Tag durchgeführt werden. Schließlich, obwohl wir die Migration der Randzone B-Zellen (MZBs) beschrieben wird, kann das Protokoll angepasst werden um Migration gegen andere Arten von Immunzellen zu analysieren. Daher ist es möglich, dieser Assay verwenden, um eine Vielzahl von Leukozyten mit einer umfangreichen Gruppe von Bedingungen systematisch zu analysieren.

MZBs sind eine Population von B-Zellen, die in der Maus, nur in der Milz und Shuttle gefunden werden, zwischen dem Innenraum der Follikel und die Randzonen^6,7,8,9. Die Randzone ist eine Schicht von Immunzellen ca. 5 – 10 Zellen dick. Die Zellschicht die Follikel umhüllt und besteht hauptsächlich aus MZBs und Makrophagen, aber auch invariante natürlichen killer (iNKT) T-Zellen, dendritischen Zellen (DCs) und Neutrophilen, unter anderem¹⁰. Die Zellen in der Randzone sind unidirektional Blutfluss aus Milz Arterien, die marginale Sinus rund um die Follikel kündigen ausgesetzt. Das Blut wird fließt aus den Löchern in den marginalen Sinus durch die Randzone und dann in venösen Sinus in dem roten Fruchtfleisch gesammelt und restauriert im Umlauf-¹¹. Der freie Fluss von Blut wäscht über den MZBs und setzt sie auf Antigene im Blut durchgeführt. Die MZBs tragen das Antigen in der Follikel transportiert automatisch zwischen der Randzone und innerhalb der Follikel, die nicht Blut ausgesetzt ist. So müssen sie als MZBs Shuttle in Richtung der Follikel, die Schubkraft der Blut fließen¹² (Abbildung 1A) Wandern.

In diesem Protokoll wir beschreiben, wie quantitativ zu bestimmen, wie die Immunzellen wie keine Strömung oder high-Flow-in-vitro-MZBs reagieren, um aufzuzeigen, wie sie sind so programmiert, dass um in Vivozu migrieren. In einem ersten Schritt werden aus einer Maus Milz mit magnetischen Beads gekoppelt an Antikörper aus handelsüblichen Kits MZBs gereinigt. Frisch isolierte MZBs sind in den Brunnen einer Strömung Kammer Folie eingeführt, erlaubt, sich auf Integrin Liganden und den Fluss der Migration Puffer mit einem Pumpensystem (Abbildung 2A) ausgesetzt. Die Zellen werden mit einem Time-Lapse video-Mikroskopie-System abgebildet. Anschließend werden die Bilder zur Analyse mit einem kostenlosen ImageJ-Plugin, MTrack2^13,14, um die Zellen automatisch zu verfolgen. Spuren können dann mit dem kostenlosen Ibidi Chemotaxis Werkzeug¹⁵ verschiedene Parameter wie Geschwindigkeit, Geradheit und Migration Index bestimmen quantifiziert werden. Diese Werte können zu bestimmen, die Auswirkungen der Migration-Inhibitoren, Zelle Stimulatoren, Chemokine und andere Chemikalien Migration beeinflussen auf der Schubfluss induzierte Migration verwendet werden, um die Immunzelle Bewegungskontrolle in-vivo Kräfte zu verstehen.