Analisi di taglio indotta da flusso di migrazione delle cellule di B di zona marginale murino In Vitro

Cellule del sistema immunitario sono più le cellule nel corpo umano e spesso devono vedersela con forza di taglio dal flusso sanguigno e linfatico. Tuttavia, ci sono relativamente pochi studi sulla migrazione indotta da forza di taglio di leucociti^1,2,3,4,5. Presentiamo qui un protocollo affidabile e quantitativo per analizzare la risposta di una cellula immune al flusso in vitro. Esecuzione del saggio non necessita di fabbricazione dei componenti, e tutte le attrezzature e materiali di consumo sono commercialmente disponibili. Il protocollo, tra cui analisi di purificazione e migrazione di cellule, possa essere eseguito in un solo giorno. Infine, anche se Descriviamo la migrazione delle cellule di B di zona marginale (MZBs), il protocollo può essere adattato per analizzare la migrazione contro flusso di altri tipi di cellule del sistema immunitario. Pertanto, è possibile utilizzare questo test per analizzare sistematicamente una vasta gamma dei leucociti con un pannello completo delle condizioni.

MZBs sono una popolazione delle cellule di B che, nel topo, si trovano solo nella milza e navetta tra all’interno dei follicoli e le zone marginali^6,7,8,9. La zona marginale è uno strato di cellule immunitarie circa 5 – 10 cellule spesse. Lo strato delle cellule avvolge il follicolo e consiste principalmente di MZBs e macrofagi, ma anche cellule T (iNKT) naturali invarianti dell’uccisore, cellule dendritiche (DCs) e neutrofili, tra gli altri¹⁰. Le cellule nella zona marginale sono esposte al flusso di sangue unidirezionale che proviene dalle arterie spleniche che terminano in un seno marginale che circonda il follicolo. Il sangue scorre dai fori nel seno marginale attraverso la zona marginale ed è quindi raccolti nei seni venosi nella polpa rossa e ripristinato la circolazione¹¹. Il libero flusso di sangue lava sopra la MZBs e li espone agli antigeni trasportati nel sangue. Il MZBs portano l’antigene nel follicolo da automaticamente la spola tra la zona marginale ed interno del follicolo, che non è esposto a sangue. Così, come MZBs navetta verso il follicolo, deve migrano fino la forza di taglio del flusso sanguigno¹² (Figura 1A).

In questo protocollo, descriviamo come determinare quantitativamente come cellule immuni come MZBs rispondere a nessun flusso o ad alto flusso in vitro, al fine di rivelare come sono programmati per eseguire la migrazione in vivo. Nel primo passaggio, MZBs sono purificati da una milza del mouse usando i branelli magnetici accoppiati agli anticorpi da corredi disponibili nel commercio. Il MZBs appena isolate sono introdotte nel pozzo di una diapositiva di camera di flusso, permesso di insediarsi sul ligandi delle integrine ed esposti al flusso del tampone di migrazione utilizzando un sistema di pompa (Figura 2A). Le cellule sono Imaging utilizzando un sistema di time-lapse video microscopia. Le immagini vengono poi elaborate per l’analisi con un plugin di ImageJ gratuito,^13,MTrack2¹⁴, rintracciare automaticamente le celle. Le tracce possono essere quantificate quindi con il libero Ibidi chemiotassi strumento¹⁵ per determinare vari parametri tra cui velocità, rettilineità e indice di migrazione. Questi valori possono essere utilizzati per determinare gli effetti inibitori della migrazione, stimolatori delle cellule, chemochine e altri prodotti chimici che influiscono sulla migrazione della migrazione di shear-flusso indotto al fine di comprendere le forze che controllano il movimento delle cellule immuni in vivo.