Yamultma akış kaynaklı geçiş antikorundan marjinal bölge B hücrelerinin in Vitro analizine
Summary
Marjinal zon B hücreleri (MZBs) kesme akışı gücüne geçiş yollarına kadar debi yeniden yönlendirme tarafından yanıt. Bu iletişim kuralı, kayıt ve analiz akışkanlar birim, pompa, mikroskop görüntüleme sistemi ve özgür yazılım kullanarak geçiş gösterilmiştir.
Abstract
Marjinal zon B hücreleri (MZBs) köklerinin örtmek fare splenik marjinal bölgeler içinde bulunan B hücreler nüfusu vardır. Folikülleri ulaşmak için MZBs kan akışını kesme kuvvetleri kadar geçirmeniz gerekir. Biz burada bu akış kaynaklı MZB geçiş tüp bebek analiz etmek için bir yöntem mevcut. İlk olarak, MZBs fare dalak izole edilmiştir. İkinci olarak, MZBs integrin ligandlar akışı odası slaytlarında yerleşmiş, akış yamultmak için maruz ve mikroskop altında geçiş sırasında görüntüsü. Üçüncü olarak, geçirme MZBs görüntülerini eklenti için ImageJ izleme MTrack2 otomatik hücre kullanılarak işlenir ve Ibidi kemotaksisi aracını kullanarak elde edilen hücre parça sayılabilir. Göç veri hücreleri nasıl hızlı hareket, ne kadar sıklıkla yönünü değiştirmek, yamultma akışı vektör kendi geçiş yönünü etkileyip ve hangi integrin ligandlar söz konusu ortaya koyuyor. Biz MZBs kullansa da, yöntem kolayca kesme akışı gücüne yanıt verir herhangi bir lökosit göç analiz etmek için adapte edilebilir.
Introduction
Bağışıklık hücreleri insan vücudunda en hareketli hücreler ve sık sık kan ve lenf akıştan kesme kuvvetleri ile uğraşmak zorundadır. Ancak, kesme kuvvetleri kaynaklı göç lökosit1,2,3,4,5nispeten az çalışma vardır. Burada bir bağışıklık hücre yanıt akış tüp bebek için analiz etmek için güvenilir ve nicel bir iletişim kuralı mevcut. Tahlil gerçekleştirmek bileşenleri imalatı gerekmez ve tüm ekipmanları ve sarf malzemeleri ticari olarak kullanılabilir. Hücre analizi, arıtma ve geçiş dahil olmak üzere iletişim kuralı, bir gün içinde gerçekleştirilebilir. Son olarak, her ne kadar biz göç marjinal zon B hücre (MZBs) tanımlamak, protokol geçiş akış bağışıklık hücreleri başka tür karşı analiz etmek için uyarlanabilir. Bu nedenle, bu tahlil sistematik olarak geniş bir lökosit koşulların kapsamlı bir paneliyle çözümle kullanmak mümkün olabilir.
MZBs olan nüfus, fare, sadece dalak ve servisi bulunan B hücre iç köklerinin ve marjinal bölgeler6,7,8,9arasında. Marjinal zon bağışıklık hücreleri yaklaşık 5-10 hücre kalın bir katmandır. Hücre katmanı folikül zarf ve öncelikle MZBs ve makrofajlar ama aynı zamanda değişmeyen doğal öldürücü T (iNKT) hücreleri, dendritik hücreler (DC) ve nötrofil, diğerleri arasında10oluşur. Marjinal zon hücrelerinde folikül çevreleyen bir marjinal sinüs sonlandırmak splenik arter kaynaklanan tek yönlü kan akışına maruz kalır. Kan marjinal bölgesi ile marjinal sinüs delikleri üzerinden akar ve sonra kırmızı hamuru venöz sinüsler içinde toplanır ve dolaşım11‘ e geri. Serbest akışı kan MZBs üzerinde yıkar ve onları kanda taşınan antijenleri için ortaya çıkarır. MZBs antijen kan maruz kalmaz folikül içinde ve marjinal zon arasında mekik tarafından otomatik olarak folikül taşımak. Böylece, folikül doğru MZBs Servisi, kan akışı12 (Şekil 1A) kesme kuvvetleri kadar geçirmeniz gerekir.
Bu iletişim kuralı, kantitatif MZBs hiçbir akışı veya yüksek akış tüp bebek için yanıt gibi nasıl bağışıklık hücreleri belirlemek anlatan, içinde vivogeçirmek için nasıl olduklarını ortaya çıkarmak için programlanmış. İlk adımda, MZBs manyetik boncuklar karşı antikorlar için piyasada kitleri birleştiğinde kullanarak bir fare dalak gelen saf. Taze izole MZBs integrin ligandlar yerleşmek için izin, bir akış odası slayt kuyunun içine tanıtıldı ve pompa sistemi (Şekil 2A) kullanarak geçiş arabellek akışına maruz. Hücreleri bir time-lapse video mikroskobu sistemi kullanarak yansıma. Görüntüleri daha sonra otomatik olarak hücreleri izleme MTrack213,–14, bir ücretsiz ImageJ eklentisi ile analiz için işlenir. Parça sonra hız, doğruluk ve geçiş dizin dahil olmak üzere çeşitli parametreleri belirlemek için ücretsiz Ibidi kemotaksisi aracı15 ile sayısal. Bu değerler bağışıklık hücre hareketi içinde vivo kontrol güçleri anlamak için kesme-akış indüklenen geçiş geçiş inhibitörleri, hücre uyarıcılar, kemokinler ve diğer geçiş etkileyen kimyasal etkileri belirlemek için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biz burada geçiş kesme akış gücü algılayan ve onların geçiş değiştirerek yanıt hücre analiz etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. MZBs bir analizini MZBs kendiliğinden ICAM-1 ve akış huzurunda geçirmek, akış geçireceği gösterdi. Önceki çalışmalarda, MZBs kadar debi VCAM-1 geçiş ama bunun yerine yerde sabit kalır gösterdi. İçerirken, kırmızı hamuru ICAM-1 ve VCAM-1 fare splenik marjinal zon esas olarak ICAM-1, içerir. Bu veri, MZBs kadar debi marjinal zon ama kırmızı hamuru i?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser K.-D.F. için “Deutsche Forschungsgemeinschaft” SFB 854/TP11 gelen hibe tarafından desteklenmiştir
Materials
| VWR Cell Strainer, 70 µm | VWR | 10199-656 |
| Pre-Separation Filters, 30 µm | Miltenyi | 130-095-823 |
| MZB and FOB cell isolation kit | Miltenyi | 130-100-366 |
| B220 CD45R, clone RA3-6B2, FITC | Biolegend | 103206 |
| CD21 / CD 35, clone 7G6, APC | BD Biosciences | 558658 |
| CD23, clone B3B4, PE | Biolegend | 101608 |
| HBSS | Biochrom | L2035 |
| D-PBS 1x | Gibco by Life Technologies | 14190-094 |
| BSA albumin fraction V, fatty acid-free | Roth | "0052.3" |
| ICAM-1 | R&D Systems | 796-IC-050 |
| Ibidi µ-slides VI 0.4, hydrophobic, uncoated | Ibidi | 80601 |
| Perfusion set, white, 50 cm, 0.8 mm | Ibidi | 10963 |
| Ibidi Pump system | Ibidi | 10902 |
References
- Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Current Opinions in Cell Biology. 20 (5), 525-532 (2008).
- Dominguez, G. A., Anderson, N. R., Hammer, D. A. The direction of migration of T-lymphocytes under flow depends upon which adhesion receptors are engaged. Integrative Biology (Cambridge). 7 (3), 345-355 (2015).
- Steiner, O., et al. Differential roles for endothelial ICAM-1, ICAM-2, and VCAM-1 in shear-resistant T cell arrest, polarization, and directed crawling on blood-brain barrier endothelium. Journal of Immunology. 185 (8), 4846-4855 (2010).
- Valignat, M. P., Theodoly, O., Gucciardi, A., Hogg, N., Lellouch, A. C. T lymphocytes orient against the direction of fluid flow during LFA-1-mediated migration. Biophysical Journal. 104 (2), 322-331 (2013).
- Woolf, E., et al. Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces. Nature Immunology. 8 (10), 1076-1085 (2007).
- Cinamon, G., et al. Sphingosine 1-phosphate receptor 1 promotes B cell localization in the splenic marginal zone. Nature Immunology. 5 (7), 713-720 (2004).
- Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W., Cyster, J. G. Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport. Nature Immunology. 9 (1), 54-62 (2008).
- Cyster, J. G., Schwab, S. R. Sphingosine-1-phosphate and lymphocyte egress from lymphoid organs. Annual Reviews in Immunology. 30, 69-94 (2012).
- Schwab, S. R., Cyster, J. G. Finding a way out: lymphocyte egress from lymphoid organs. Nature Immunology. 8 (12), 1295-1301 (2007).
- Cerutti, A., Cols, M., Puga, I. Marginal zone B cells: virtues of innate-like antibody-producing lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 13 (2), 118-132 (2013).
- Mebius, R. E., Kraal, G. Structure and function of the spleen. Nature Reviews Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).
- Tedford, K., et al. The opposing forces of shear flow and sphingosine-1-phosphate control marginal zone B cell shuttling. Nature Communications. 8 (1), 2261 (2017).
- ImageJ. MTrack2 Available from: https://imagej.net/MTrack2 (2018)
- . MTrack2 Available from: https://valelab4.ucsf.edu/~nstuurman/IJplugins/MTrack2.html (2018)
- . Chemotaxis and Migration Tool Available from: https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html (2018)
- Reeves, J. P., Reeves, P. A. Removal of lymphoid organs. Current Protocols in Immunology. , (2001).
- . Manual Tracking Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/manual-tracking.html (2018)
- . ibidi Pump System Available from: https://ibidi.com/perfusion-system/112-ibidi-pump-system.html (2018)
