Visualizzazione livelli gibberellina cellulare utilizzando l'energia di risonanza di Förster NlsGPS1 Transfer (FRET) biosensore
Summary
Gibberellina percezione sensore 1 (GPS1) è il primo Förster risonanza energia basati su trasferimento biosensore per misurare i livelli cellulari di fitormoni gibberellina con un’alta risoluzione spazio-temporale. Questo protocollo segnala sul metodo per visualizzare e quantificare i livelli cellulari gibberellina utilizzando il biosensore codificato geneticamente nlsGPS1 in Arabidopsis ipocotili e punte delle radici.
Abstract
La gibberellina di fitormoni (GA) è una molecola di segnalazione piccola, mobile che svolge un ruolo chiave nella germinazione dei semi, l’allungamento cellulare e transizioni inerente allo sviluppo in piante. Gibberellina percezione sensore 1 (GPS1) è il primo trasferimento di energia di Förster risonanza (FRET)-base di biosensore che consente il monitoraggio dei livelli cellulari di GA in vivo. Misurando un rapporto di emissione di fluorescenza del nucleare localizzato-GPS1 (nlsGPS1), è fattibile su scala cellulare spatiotemporal mappatura dei gradienti di GA in modo endogeno ed esogenicamente forniti in diversi tipi di tessuto. Questo protocollo descriverà come di immagini nlsGPS1 rapporti di emissione in tre esperimenti di esempio: allo steady-state, prima e dopo esogeno gibberellina A4 (GA4) trattamenti e sopra un corso di tempo di trattamento. Forniamo anche metodi per analizzare i rapporti di emissione nlsGPS1 utilizzando un software di visualizzazione e l’analisi di commerciale Micrografo tridimensionale (3D) e Fiji e spiegare i limiti e le insidie probabile dell’utilizzo di nlsGPS1 per quantificare i livelli gibberellina.
Introduction
Ormoni vegetali svolgono un ruolo fondamentale nella crescita delle piante e lo sviluppo. Queste molecole di segnalazione piccole, mobile in genere sono regolate a livelli diversi, ad esempio trasporto di breve e lunga distanza1,2,3,4biosintesi e catabolismo. La comprensione delle vie di segnalazione dell’ormone e a valle delle risposte trascrizionali ha affinato nel corso degli anni. Tuttavia, per collegare le diverse risposte cellulari delle vie di segnalazione dell’ormone con gli input normativi dirigere distribuzioni di ormone, richiediamo una spatiotemporal quantificazione dei livelli di ormone su scala cellulare. Basato su FRET biosensori in grado di rilevare fitormoni possono avanzare la capacità degli scienziati di quantificare i livelli di ormone su scala cellulare. Basato su FRET biosensori costituiti da una coppia FRET (donatore e accettore proteine fluorescenti) collegata a un dominio sensoriale che lega un ligando specifico o reagisce ad uno stimolo biologico. Per biosensori di piccola molecola, grippaggio del ligand innesca un cambiamento conformazionale del dominio sensoriale che si traduce in un cambiamento della distanza e/o di orientamento tra le due proteine fluorescenti della coppia FRET. Un’analisi di raziometrici di un biosensore FRET avviene emozionante il donatore e misurando il rapporto di emissione di fluorescenza del ricettore sopra donatore5,6. Grippaggio del ligand è rilevabile come un cambiamento in questo rapporto di emissione7.
Recentemente abbiamo sviluppato un biosensore basato su FRET per l’ormone vegetale GA. GAs sono una classe di ormoni che possono promuovere la germinazione del seme, l’allungamento cellulare e la transizione evolutiva da vegetativo alle fasi di fioritura. Il biosensore nlsGPS1 è nucleare localizzata e fornisce approfondimenti spatiotemporal dynamics GA nei tessuti vegetali diversi. In cellule di Arabidopsis , GA si lega ai recettori solubili, gibberellina-insensibile nano (GID), e il complesso induce la degradazione delle proteine DELLA che agiscono come regolatori negativi della GA segnalazione2. Il dominio sensoriale di GA di nlsGPS1 è costituito dal recettore di Arabidopsis GA (AtGID1C) collegato a un troncamento 74-ammino acido DELLA proteina (AtGAI) e una coppia FRET composta enhanced varianti di dimerizzazione di Cerulean come la proteina fluorescente di donatore e Afrodite (una codone-diversificato Venere) come il ricettore della proteina fluorescente8. Il biosensore nlsGPS1 è un sensore ad alta affinità per il bioactive GA4 (Kd = 24 nM per GA4) e può essere utilizzato in diversi tipi di tessuto per mappare e quantificare le sfumature GA. Per evitare errori di interpretazione dei livelli Arabidopsis GA in vivo, abbiamo anche sviluppato una variante nonresponsive del nlsGPS1 (nlsGPS1-NR) da utilizzare come controllo negativo. La proteina nlsGPS1-NR trasporta le mutazioni nella tasca GA-associazione che interrompono l’associazione di GA e mutazioni nella proteina DELLA che disturbare l’interazione con GID del ricevitore proteine7,9. Modelli di rapporto di emissione o cambiamenti osservati nelle linee nlsGPS1 e di nlsGPS1-NR possono essere considerati manufatti non direttamente legate alla GA-associazione di eventi. È anche importante notare che l’associazione nlsGPS1 a GA4 non è rapidamente reversibile, e pertanto, cellulare nlsGPS1 rapporti di emissione devono essere interpretati come che rappresenta la più alta concentrazione di recente di GA in un determinato nucleo piuttosto che in tempo reale livelli allo stato stazionario. Di conseguenza, un’analisi dei livelli di caduta GA non è possibile con nlsGPS1.
Qui forniamo un protocollo dettagliato per l’utilizzo di un biosensore di nlsGPS1 nelle cellule della pianta modello Arabidopsis, utilizzando approcci basati su imaging confocale a una risoluzione elevata. Il protocollo fornisce informazioni su formazione immagine pianta radici e ipocotili sia allo stato stazionario e sopra corsi di time. Il sensore nlsGPS1 potenzialmente poteva essere utilizzato in diversi tipi di tessuto, così come varie specie di pianta, per mappare e quantificare le distribuzioni di GA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il nlsGPS1 di biosensore basato su FRET GA fornisce un metodo quantitativo per segnalare e misurare le pendenze di ormone GA nella piante pluricellulari. Basato su FRET biosensori in grado di quantificare dinamiche con una migliore risoluzione spazio-temporale sulla rilevazione diretta tramite spettrometria di massa e la misura indiretta di reporter trascrizionale o segnalazione proteina-degradazione-metodi basati su12, 13. Imaging ad alta risoluzione cellulare in diversi tipi di tessuto può produrre significativi approfondimenti GA biologia e spark nuove ipotesi per quanto riguarda la regolazione e la funzione delle accumulazioni di GA in un contesto pluricellulare. Ad esempio, monitorare i cambiamenti nei nlsGPS1 biosensore specifico GA biosintetico, catabolico e mutanti di trasporto, così come durante perturbazioni spatiotemporally indotti, potrebbe essere molto informato per testare in modo specifico come gradienti di GA sono stabiliti in la radice e la radice di indirizzo delle cellule risposte a gradienti di GA. Il sensore può essere utilizzato in altre specie modello e raccolto per testare la conservazione dei meccanismi che controllano il controllo GA-mediata di germinazione del seme, l’allungamento cellulare e fioritura.
I passaggi critici nell’imaging del biosensore nlsGPS1 basato su FRET sono che 1) i pixel non dovrebbero essere saturo durante l’analisi quantitativa di FRET, parametri 2) imaging come “rivelatore guadagno” dovrebbero essere mantenuti costanti per l’emissione del donatore (DxDm) e acquisizioni di emissione (DxAm) di accettore, 3) linee nlsGPS1-NR di controllo devono essere utilizzati per escludere artefatti e 4) campioni devono essere preparati per minimizzare drift e problemi di cambiamento focale. Inoltre, le condizioni ambientali in cui sono cresciuti campioni sono importanti per controllare poiché i livelli di GA sono sensibili alle condizioni ambientali come luce durata e intensità della luce14,15,16 ,17. Una limitazione fondamentale di questo tipo di analisi è che un elevato rapporto segnale-rumore è necessario per l’imaging a causa l’aumento della rumorosità insiti nell’imaging raziometrici. Così, nlsGPS1 imaging non sarà utile per i tessuti e gli organi che non sono favorevoli alla microscopia a fluorescenza raziometrici utilizzando proteine fluorescenti ciano e gialle — ad esempio, nei tessuti più profondi dove le proteine fluorescenti sono scarsamente rilevate. D’altra parte, raziometrico letture sono spesso preferite sopra intensiometric letture, perché un controllo interno è utile per escludere manufatti derivanti da cambiamenti nell’espressione di biosensore, stabilità, luminosità o individuabilità in una data cellula, tessuto , o condizione. Ad esempio, FRET imaging biosensore e analisi di immagine inoltre sono stati usati per studiare una varietà di ligandi in una varietà di tessuti5,6,18,19,20,. L’imaging esperimenti e analisi di immagine segnalati qui possono essere modificati per soddisfare i nuovi metodi di imaging, come la microscopia foglio leggero, che potrebbe produrre nuove conoscenze in, ad esempio, più profonda radice-tipi di tessuto.
Il biosensore di prima generazione nlsGPS1 è un sensore di alto-affinità che fornisce una mappa ad alta risoluzione delle pendenze di GA che può anche segnalare sull’aumento intracellulare in seguito Trattamenti esogeni GA GA. Uno dei limiti attuali di nlsGPS1 è che il sensore non è rapidamente reversibile e, così, rapporti non-livelli allo stato stazionario GA ma, probabilmente, la massima concentrazione di GA risale nella soluzione di interesse. Il turnover di preciso per il sensore è anche non conosciuto e questo, combinato con bassa reversibilità, osta ad una rilevazione di svuotamenti GA endogeni che potrebbe accadere in un minuti a un paio d’ore in alcuni tipi di tessuto. È anche importante notare che nlsGPS1 ha un’alta affinità per GA4 (Kd = 24 nM) rispetto ad altre forme di GA (GA3 Kd= 240 nM, GA1Kd = 110 nM) quando altri GAs bioattivi di imaging 7. le generazioni future di biosensori GA possono essere progettate per aumentare la reversibilità mantenendo alta affinità o esibiscono diverse specificità per i vari precursore, bioattivi, o dei cataboliti GAs.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro ha ricevuto finanziamenti dal Consiglio europeo della ricerca (CER) nell’ambito del programma ricerca e innovazione di Horizon 2020 dell’Unione europea (accordo di finanziamento n ° 759282).
Materials
| nlsGPS1 Col0 Arabidopsis seeds | NASC | N2107734 | |
| nlsGPS-NR Col0 Arabidopsis seeds | NASC | N2107735 | |
| Gibberellin A4 (GA4) | Sigma | G7276 | dissolve in EtH70 % , and keep at -20°C |
| sodium hypochlorite solution (Bleach) | Fisher S/5040 | HSRA 064 | |
| Hydrogen cloride HCl | Sigma | 31434 | |
| Micropore tape | 3M | 1530-1 | |
| ibidi sticky-slide | Ibidi | 81128 | Luer 0.1 for root imaging |
| ibidi sticky-slide | Ibidi | 80168 | Luer 0.2 for hypocotyl imaging |
| glass coverslip for sticky slides | Ibidi | 10812 | |
| Elbow Luer Connectors | Ibidi | 10802 | |
| silicone tubing | Ibidi | 108401 | |
| Luer Lock Connector | Ibidi | 10826 | |
| programmable syringe pump | World Precision Instruments | AL-1000 | |
| Vacuum grease | Sigma | 18405 | |
| Murashige and Skoog Basal Salts | Duchefa | M0221 | |
| Agar plant, 1kg | Melford | P1001 | |
| Microscope slide ground edges, 76mm x 26mm, 1.0mm to 1.2mm thick | Fisher Scientific | 12383118 | |
| Cover slip No.1 1/2 glass 22mm x 22mm | Fisher Scientific | 12363138 | |
| Luer-slip Syringe 2o ml | Fisher Scientific | 10785126 | |
| 3M Micropor Surgical Paper Tape | Fisher Scientific | 12787597 | |
| Potassium Hydroxide, 500g | Sigma Aldrich | 221473-500G-D | |
| Absolute Ethanol | Fisher Scientific | 10428671 | |
| Forceps Watchmaker 5 StSteel | Scientific Laboratory Supplies | INS4340 | |
| Scissors, 125mm, stainless steel | Fisher Scientific | 12338099 | |
| Fitting reducer 0.5 to 1.6 | Ibidi | 10829 | |
| Leica SP8 | Confocal laser microscope 1 | ||
| Zeiss LSM 780 | Confocal laser microscope 2 | ||
| Imaris | Bitplane | 3D visualization and Analysis software | |
| Fiji | image analysis software | ||
| OriginPro | Origin Lab | Statistical Analysis Software |
References
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