Визуализации клеточных гиббереллин уровни, используя энергию резонанса Фёрстер NlsGPS1 передачи биосенсора (ЛАДА)
Summary
Гиббереллин восприятие датчик 1 (GPS1) является первым Фёрстер резонанс энергии на основе передачи биосенсора для измерения клеточном уровнях гиббереллин фитогормонов с высоким разрешением пространственно-временных. Этот протокол сообщает о метод визуализации и количественной оценке клеточных гиббереллин уровней с помощью биосенсора генетически закодированный nlsGPS1 арабидопсиса гипокотиля и корень советы.
Abstract
Гиббереллин фитогормона (GA) является небольшой, мобильные сигнальной молекулы, которая играет ключевую роль в прорастания семян, сотовой удлинение и развития переходы в растениях. Гиббереллин восприятие датчик 1 (GPS1) является первой передачи энергии резонанса Фёрстер (ЛАДА)-на основе биосенсор, что позволяет мониторинг клеточного уровня га в естественных условиях. Путем измерения флуоресценции выбросов соотношение ядерных локализован GPS1 (nlsGPS1), пространственно-временных карт эндогенно и экзогенно предоставленного GA градиентов в различных тканей типа возможна на клеточном уровне. Этот протокол описывает как изображение nlsGPS1 коэффициентов выбросов в три примера экспериментов: стационарном, лечения экзогенных до и после гиббереллин A4 (4га) и через время курс лечения. Мы также предоставляют методы для анализа nlsGPS1 коэффициенты выбросов с использованием коммерческих трехмерной (3-D) Микрофотография визуализации и анализа программного обеспечения и Фиджи и объяснить ограничения и вероятно ловушки с использованием nlsGPS1 для количественного определения уровней гиббереллин.
Introduction
Растительные гормоны играют основополагающую роль в рост и развитие растений. Эти небольшие, мобильные сигнальных молекул, обычно регулируются на нескольких уровнях, например, биосинтез, катаболизм и краткосрочных и долгосрочных междугородной перевозки1,2,3,4. Понимание гормон сигнальные пути и ниже по течению транскрипционный анализ ответов обострило годами. Однако чтобы связать различных клеточных реакций гормон сигнальных путей регулирования материалов, направляя гормон дистрибутивов, мы требуем пространственно-временных количественную оценку уровня гормонов на клеточном уровне. На основе ладу биодатчики, которые может обнаружить фитогормонов могут продвигать ученых возможность количественного определения уровня гормонов на клеточном уровне. На основе ладу биодатчики состоят из ладу пары (доноров и акцепторов флуоресцентные белки) связан с сенсорными домен, связывает конкретные лигандом или реагирует на биологических раздражитель. Для малых молекул биодатчики Связывание лиганда вызывает конформационные изменения сенсорные домена, что приводит к изменению расстояния и/или ориентации между двумя флуоресцентные белки ладу пары. Анализ ratiometric ладу биосенсора достигается путем захватывающие донора и измерения флуоресценции выбросов соотношение акцептора доноров5,6. Связывание лиганда является обнаруживаемой как изменение в этом выбросов соотношение7.
Мы недавно разработал на основе ладу биосенсор для завода гормона GA. газ класса гормонов, которые могут способствовать прорастания семян, сотовой удлинение и развития переход от вегетативной стадии цветения. Биосенсор nlsGPS1 ядерной локализации и обеспечивает пространственно-временных понимание динамики GA в тканях различных растений. В клетках Arabidopsis GA связывается Растворимые рецепторы, зависящие от гиббереллин карлик (GID), и комплекс вызывает деградацию ДЕЛЛА белков, которые действуют как негативные регуляторы сигнализации2га. GA-сенсорные домен nlsGPS1 состоит из Arabidopsis GA рецептора (AtGID1C) связан с 74-амино кислоты усечение ДЕЛЛА белка (AtGAI) и ладу пары, состоящей из более димеризации варианты Cerulean как доноров флуоресцентный белок и Афродита (кодон диверсифицированная Венера) как акцептор флуоресцентный белок8. NlsGPS1 биодатчик является датчик высокоспецифичные биологически GA4 (Kd = 24 Нм для GA4) и он может быть использован в различных тканей типы сопоставить и количественно определить GA градиентов. Чтобы избежать неправильного толкования Arabidopsis GA уровней в естественных условиях, мы разработали также свертывать вариант nlsGPS1 (nlsGPS1-NR) для использования в качестве отрицательного контроля. NlsGPS1-NR белок несет мутации в кармане GA-привязки, которые нарушают связывание GA и мутации в ДЕЛЛА белков, которые нарушают взаимодействие с GID рецептор белков7,9. Шаблоны коэффициент выбросов или изменения наблюдаются в nlsGPS1 и nlsGPS1-NR линии можно считать артефакты, непосредственно не связанные с событиями GA-привязки. Важно также отметить, что быстро nlsGPS1 привязки для GA4 не обратима, и поэтому, сотовой nlsGPS1 коэффициенты выбросов следует толковать как представляющие самую высокую концентрацию последние GA данного ядра, а не в реальном времени стационарном уровнях. Как следствие снижение уровней GA возможен анализ не с nlsGPS1.
Здесь мы предоставляем подробный протокол для использования nlsGPS1 биосенсор в клетках модели растение Arabidopsis, используя конфокальный подходы на основе изображений в высоком разрешении. Протокол предоставляет информацию о тепловизионных корни растений и гипокотиля как в стационарном, так и через время курсы. NlsGPS1 датчик потенциально могут быть использованы различные типы тканей, а также различных видов растений, чтобы сопоставить и количественно определить GA дистрибутивов.
Protocol
Representative Results
Discussion
NlsGPS1 биосенсор на основе ладу GA обеспечивает количественный метод сообщать и измерить GA гормон градиенты в многоклеточные растения. На основе ладу Биодатчики можно количественно динамика с улучшенным разрешением пространственно-временных через прямое обнаружение по масс-спектрометрии и косвенные измерения transcriptional Репортеры или сигнализации белка деградация-методы на основе12, 13. Высоким разрешением сотовой изображений в различные типы тканей может дать значимые идеи в GA биологии и искры новых гипотез относительно регулирования и функции GA накоплений в рамках многоклеточных. Например мониторинг изменений в nlsGPS1 биосенсор конкретных GA биосинтетических, катаболических и мутанты транспорта, а также во время spatiotemporally индуцированных возмущений, может быть очень информативным для тестирования специально как GA градиенты, установлены в корень и корневой адрес ячейки ответы на GA градиентов. Датчик может использоваться в других видов модели и сельскохозяйственных культур для проверки сохранения механизмов, которые управляют GA-опосредованный контроль прорастания семян, сотовой удлинение и цветения.
Важнейшие шаги в ладу на основе изображений биосенсора nlsGPS1, что, 1 пикселей не должно быть насыщенным в ходе количественного анализа ладу, 2) визуализации параметров, таких как «детектор выгоды» должен оставаться постоянным для доноров выбросов (DxDm) и Акцептор поглощения выбросов (DxAm), 3) nlsGPS1-NR линии контроля должны использоваться для исключает артефактов и 4) образцы должны быть готовы к минимуму смещения фокуса-вопросам и изменения. Кроме того экологические условия, в которых выращиваются образцы имеют важное значение для управления, поскольку уровни GA чувствительны к условиям окружающей среды как свет продолжительность и интенсивность света14,,1516 ,17. Основным ограничением этого типа анализа является, что для изображения за счет увеличения шума, присущие ratiometric изображений требуется высокое соотношение сигнал шум. Таким образом, nlsGPS1 изображений не будет полезным для тканей и органов, которые не поддаются ratiometric микроскопии флуоресцирования с использованием голубой и желтый флуоресцентные белки — например, глубокие ткани, где плохо обнаруживаются флуоресцентные белки. С другой стороны ratiometric отсчетов предпочтительней часто intensiometric показаний, поскольку внутренний контроль является полезным правилом, артефакты, вытекающие из изменений в биосенсор выражение, стабильности, яркость или обнаруживаемости в данной ячейке, ткани , или условие. Например, ладу биосенсор томографии и анализа изображений также были использованы для изучения различных лигандов в различных тканях5,6,18,19,20,. Визуализации экспериментов и анализа изображений, сообщили здесь могут быть изменены с учетом новых изображений методов, таких как свет лист микроскопии, что может принести новые идеи в, например, более глубокие ткани типов корня.
Первого поколения nlsGPS1 биодатчик является высокоспецифичные датчик, который обеспечивает высоким разрешением карта GA градиентов, которые также могут сообщать о внутриклеточной увеличение после лечения экзогенных GA GA. Один из текущих ограничений nlsGPS1 является, что датчик не быстро обратимых и, таким образом, доклады не на стационарном уровнях га, но, вероятно, на последних GA ПДК в решении интерес. Точное текучести для датчика является также не известно и это, в сочетании с низкой обратимости, исключает возможность обнаружения эндогенного напевала га, которые, возможно, происходит в течение нескольких минут до нескольких часов в некоторые типы тканей. Важно также отметить, что nlsGPS1 имеет высокое сродство для GA4 (Kd = 24 Нм) по сравнению с другими формами GA (GA3 Kd= 240 Нм, GA1Kd = 110 Нм) при визуализации другие биоактивные газовые 7. будущих поколений биодатчиков GA могут быть спроектированы для повышения обратимость при сохранении высоким сродством или выставлять различные особенности различных прекурсоров, биоактивных, или catabolite газа.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа получила финансирование от Европейского Совета исследований (ERC) под исследовательской и инновационной программы Европейского союза по Horizon 2020 (Грант соглашение n ° 759282).
Materials
| nlsGPS1 Col0 Arabidopsis seeds | NASC | N2107734 | |
| nlsGPS-NR Col0 Arabidopsis seeds | NASC | N2107735 | |
| Gibberellin A4 (GA4) | Sigma | G7276 | dissolve in EtH70 % , and keep at -20°C |
| sodium hypochlorite solution (Bleach) | Fisher S/5040 | HSRA 064 | |
| Hydrogen cloride HCl | Sigma | 31434 | |
| Micropore tape | 3M | 1530-1 | |
| ibidi sticky-slide | Ibidi | 81128 | Luer 0.1 for root imaging |
| ibidi sticky-slide | Ibidi | 80168 | Luer 0.2 for hypocotyl imaging |
| glass coverslip for sticky slides | Ibidi | 10812 | |
| Elbow Luer Connectors | Ibidi | 10802 | |
| silicone tubing | Ibidi | 108401 | |
| Luer Lock Connector | Ibidi | 10826 | |
| programmable syringe pump | World Precision Instruments | AL-1000 | |
| Vacuum grease | Sigma | 18405 | |
| Murashige and Skoog Basal Salts | Duchefa | M0221 | |
| Agar plant, 1kg | Melford | P1001 | |
| Microscope slide ground edges, 76mm x 26mm, 1.0mm to 1.2mm thick | Fisher Scientific | 12383118 | |
| Cover slip No.1 1/2 glass 22mm x 22mm | Fisher Scientific | 12363138 | |
| Luer-slip Syringe 2o ml | Fisher Scientific | 10785126 | |
| 3M Micropor Surgical Paper Tape | Fisher Scientific | 12787597 | |
| Potassium Hydroxide, 500g | Sigma Aldrich | 221473-500G-D | |
| Absolute Ethanol | Fisher Scientific | 10428671 | |
| Forceps Watchmaker 5 StSteel | Scientific Laboratory Supplies | INS4340 | |
| Scissors, 125mm, stainless steel | Fisher Scientific | 12338099 | |
| Fitting reducer 0.5 to 1.6 | Ibidi | 10829 | |
| Leica SP8 | Confocal laser microscope 1 | ||
| Zeiss LSM 780 | Confocal laser microscope 2 | ||
| Imaris | Bitplane | 3D visualization and Analysis software | |
| Fiji | image analysis software | ||
| OriginPro | Origin Lab | Statistical Analysis Software |
References
- Binenbaum, J., Weinstain, R., Shani, E. Gibberellin Localization and Transport in Plants. Trends in Plant Science. 23 (5), 410-421 (2018).
- Sun, T. Gibberellin Metabolism, Perception and Signaling Pathways in Arabidopsis. The Arabidopsis Book. 6, 0103 (2008).
- Rieu, I., et al. Genetic Analysis Reveals That C19-GA 2-Oxidation Is a Major Gibberellin Inactivation Pathway in Arabidopsis. The Plant Cell Online. 20 (9), 2420-2436 (2008).
- Regnault, T., et al. The gibberellin precursor GA12 acts as a long-distance growth signal in Arabidopsis. Nature Plants. 1, 15073 (2015).
- Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. Quantitative Imaging with Fluorescent Biosensors. Annual Review of Plant Biology. 63 (1), 663-706 (2012).
- Walia, A., Waadt, R., Jones, A. M. Genetically Encoded Biosensors in Plants: Pathways to Discovery. Annual Review of Plant Biology. 69 (1), 497-524 (2018).
- Rizza, A., Walia, A., Lanquar, V., Frommer, W. B., Jones, A. M. In vivo gibberellin gradients visualized in rapidly elongating tissues. Nature Plants. 3 (10), 803-813 (2017).
- Rizzo, M. A., Springer, G., Segawa, K., Zipfel, W. R., Piston, D. W. Optimization of pairings and detection conditions for measurement of FRET between cyan and yellow fluorescent proteins. Microscopy and Microanalysis. 12 (3), 238-254 (2006).
- Ueguchi-Tanaka, M., et al. GIBBERELLIN INSENSITIVE DWARF1 encodes a soluble receptor for gibberellin. Nature. 437, 693-698 (2005).
- Grossmann, G., et al. Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip. Journal of Visualized Experiments. (65), 34290 (2012).
- Grossmann, G., et al. The RootChip: an integrated microfluidic chip for plant science. Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).
- Brunoud, G., et al. A novel sensor to map auxin response and distribution at high spatio-temporal resolution. Nature. 482, 103-106 (2012).
- Wang, N. N., Shin, M. C., Li, N. The GUS reporter-aided analysis of the promoter activities of Arabidopsis ACC synthase genes AtACS4, AtACS5, and AtACS7 induced by hormones and stresses. Journal of Experimental Botany. 56 (413), 909-920 (2005).
- Alabadi, D. Gibberellins Repress Photomorphogenesis in Darkness. Plant Physiology. 134 (3), 1050-1057 (2004).
- De Lucas, M., et al. A molecular framework for light and gibberellin control of cell elongation. Nature. 451 (7177), 480-484 (2008).
- Strasser, B., Sanchez-Lamas, M., Yanovsky, M. J., Casal, J. J., Cerdan, P. D. Arabidopsis thaliana life without phytochromes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (10), 4776-4781 (2010).
- Feng, S., et al. Coordinated regulation of Arabidopsis thaliana development by light and gibberellins. Nature. 451, 475-479 (2008).
- Choi, W. G., Swanson, S. J., Gilroy, S. High-resolution imaging of Ca2+, redox status, ROS and pH using GFP biosensors. Plant Journal. 70 (1), 118-128 (2012).
- Lanquar, V., et al. Dynamic imaging of cytosolic zinc in Arabidopsis roots combining FRET sensors and RootChip technology. New Phytologist. 202 (1), 198-208 (2014).
- Krebs, M., Schumacher, K. Live cell imaging of cytoplasmic and nuclear Ca2+ dynamics in Arabidopsis roots. Cold Spring Harbor. 2013 (8), 776-780 (2013).
