Niveles de giberelina celular visualizado utilizando la energía de resonancia NlsGPS1 Förster transferencia Biosensor (traste)

1. preparaciones Preparar ½ Murashige y Skoog agar pH 5.7 no sacarosa (1 L). Disolver 2,2 g de medio basal Murashige y Skoog (MS) en 950 mL de agua ultrapura. Ajustar el pH a 5.7 con 5 M de KOH. Conforman la solución hasta un volumen final de 1 L con agua ultrapura. Dividirla en dos botellas de 500 mL, cada que contiene agar 1% planta. Autoclave a 121 ° C durante 20 minutos. Preparar el líquido MS ¼ a pH 5.7 no sacarosa (1 L). Disolver 1,1 g de MS en 950 mL de agua ultrapura. Ajustar el pH a 5.7 con 5 M de KOH. Conforman la solución hasta un volumen final de 1 L con agua ultrapura. Dividirla en dos botellas de 500 mL. Autoclave a 121 ° C durante 20 minutos. Preparar GA4. Disolver el GA4 en etanol 70% para una concentración final de stock de4 100 mM GA. Para preparar la solución de trabajo, diluir el stock de4 GA a 0.1-1 μm en el MS ¼ líquido pH 5.7. 2. crecimiento de la planta Esterilizar las semillas de Arabidopsis . Trabajar con una campana química. Alícuota de las semillas (aproximadamente 200 semillas) en tubos de microcentrífuga de 2 mL. Use un marcador con tinta resistente al cloro y colocar los tubos con las tapas abiertas dentro de la nave de esterilización (una caja grande que puede sellarse). Coloque un vaso de precipitados de 250 mL que contenga 50 mL de agua ultrapura y 50 mL de solución de hipoclorito de sodio dentro de la nave de esterilización. Añadir 3 mL de ácido clorhídrico concentrado (HCl) en el vaso. Inmediatamente sellar el recipiente y permite la esterilización por gas de la clorina para 6-16 h. Después de unsealing el vaso, cerrar las tapas de todos los tubos de microcentrífuga en la canasta de semillas. Semillas esterilizadas pueden conservarse secos hasta el momento de la galjanoplastia. Sembrar aproximadamente esterilizada 20 semillas de Arabidopsis en MS ½ placas cuadradas de agar. Sellar las placas con esparadrapo poroso y envolverlos con papel de aluminio. Incubar a 4 ° C durante 1 – 3 días para la estratificación. Para proyección de imagen de la raíz, la transferencia de las placas a la cámara en posición vertical durante 3 días con las siguientes condiciones de crecimiento: condiciones de día largo (LD, 16 h de luz/8 h oscuridad); µmol⋅m 120-2s-1 intensidad de la luz; temperatura de 22 ° C (durante el ciclo de luz) o 18 ° C (durante el ciclo oscuro), 65% humedad relativa (HR). Para hipocótilo cultivados en oscuridad: transferir las placas de la cámara de crecimiento para un pulso de luz de 1-4 h para sincronizar la germinación. Envuelva las placas con papel de aluminio y coloque la cámara en posición vertical durante 3 días. 3. preparación de la muestra Mediciones de estado estacionario (figura 1A) En un portaobjetos limpio, añadir 50 μl de líquido MS ¼ (en adelante denominado como falsa solución). Suavemente la transferencia de plántulas expresando nlsGPS1 de la placa a la diapositiva. Tomar un cubreobjetos limpio y observar una gota de grasa para vacío en cada esquina del cubreobjetos. Coloque suavemente el cubreobjetos sobre las plantas de semillero y cuidadosamente añada extra falsa solución para eliminar las posibles burbujas de aire. Tratamiento de GA4 : experimento del intercambio químico (figura 1B). Antes del tratamiento de4 GA, use una jeringa de 20 mL llenada de grasa para vacío (unido a una punta de la pipeta) para dibujar un rectángulo (longitud: 3,5 cm, altura: 2,5 cm) con una capa uniforme de grasa para vacío en un portaobjetos limpio de vidrio (figura 1B). Para lograr una línea fina de grasa para vacío, debe cortarse la punta de la pipeta para tener una abertura de 1 mm de diámetro. Añadir 50 μl de solución falsa a la diapositiva de cristal. Con unas pinzas limpias, escoger las plantas de semillero de nlsGPS1 y suavemente en la solución falsa. Para evitar cualquier daño, transferencia de las plantas de semillero apoyando la parte inferior de los cotiledones sin sujetando la plántula con el fórceps. Tomar un cubreobjetos limpio y observar una gota de grasa para vacío en cada esquina del cubreobjetos. Usando las pinzas, coloque el cubreobjetos en el centro del rectángulo vacío grasa. Ahora el cubreobjetos está sellado en los dos lados correspondientes a los bordes largos del rectángulo vacío grasa. Cuidadosamente añadir extra falsa solución para llenar el recipiente y eliminar burbujas de aire en el depósito sin molestar a los seedling(s) dentro. Adquirir las imágenes antes del tratamiento de4 GA utilizando un microscopio confocal. Siga las instrucciones tal como se describe en la sección 4 del presente Protocolo. Para el tratamiento de4 GA, sacar el portaobjetos de la etapa confocal. Ajustar un temporizador de 20 minutos. Después de iniciar el temporizador, intercambio de la solución tampón con MS ¼ líquido que contiene 1 μm GA4. Añadir la solución de4 GA (aproximadamente 50 μL) del lado izquierdo del cubreobjetos y quitar la anterior solución (falsa) del lado derecho. Mantener en el intercambio de la solución para reemplazar la solución falsa totalmente, que tarda aproximadamente 10 minutos (figura 1B). Coloque el portaobjetos de cristal en la platina del microscopio. Esperar otros 10 minutos antes de adquirir la imagen después de GA. Puesta en marcha de un curso de tiempo para el tejido de interésNota: El tejido de interés podría ser, por ejemplo, hipocotilos o raíces. Rutinariamente realizamos cursos de tiempo para nlsGPS1 biosensor utilizando un sistema de perfusión comercial la proyección de imagen (figura 1, véase Tabla de materiales) o una RootChip7,10,11. Añadir 200 μL de solución falsa al centro del canal de la perfusión de la pegajosa-diapositiva (véase Tabla de materiales). Suavemente seleccionar plántulas de nlsGPS1 y en la solución falsa en la pegajosa-diapositiva. Con unas pinzas, suavemente ponga el cubreobjetos de vidrio y, usando la parte trasera de las pinzas, presione suavemente en los bordes del cubreobjetos para que forme un fuerte lazo con el material pegajoso en la periferia de la pegajosa-diapositiva. Usando dos codo Luer conectores (con un diámetro interno [ID] de 0,8 mm) y el tubo de silicona (con un ID de 0,8 mm), conecte la pegajosa-diapositiva a una jeringa de 20 mL y un envase de salida que recoge la solución de salida. Utilice el conector de cierre Luer (con un ID de 0.8 mm) para conectar la jeringa a la tubería del silicón. Presione suavemente la jeringa que contiene la solución falsa manualmente para dejar suficiente solución pasar por la cámara por lo que no hay burbujas de aire en la cámara. Coloque y sostenga la jeringa en la bomba de jeringa programable. Configure los parámetros de la bomba concreta a la jeringa usada (es decir., diámetro y volumen) junto con la velocidad de flujo según el manual suministrado con la bomba.Nota: En este protocolo, se utilizó una tasa de flujo de 1 – 3 mL/h, y esto puede cambiar según las exigencias experimentales. A partir de la bomba para iniciar el curso del tiempo. Para el tratamiento de4 GA durante un transcurso de tiempo (figura 1), detener la perfusión por una pausa de la bomba y cambiar la jeringa con un nuevo uno que contiene ¼ MS líquido suplementado con GA4. Proceder con la proyección de imagen confocal como se muestra en la siguiente sección. 4. microscopía Nota: Realizamos microscopía láser confocal. Adquisición de imágenes mediante un microscopio confocal equipado con rayos láser para realizar proyección de imagen de traste.Nota: Para nlsGPS1, son imágenes de variantes de la proteína fluorescente ciánica (PPC) y proteína fluorescente amarilla (YFP). En este protocolo, se utilizan microscopios comerciales (véase Tabla de materiales, como el microscopio 1 y 2) con 10 x o 20 x seco 0,70 armónico compuesto PLAN APO objetivos. Para microscopio 1, uso 448 nm y 514 láseres nm de longitud de onda para excitar el PPC y YFP, respectivamente. Adquirir las exploraciones secuenciales. Coloque detectores (por ejemplo, HyD SMD) para detectar 460-500 nm para PPC (emisión del donante) y 525 – 560 nm para YFP (emisión de traste) después de la excitación de PPC. Con una segunda secuencia, defina un detector para detectar 525 – 560 nm para YFP (emisión de YFP) después de la excitación de YFP.Nota: Esta fluorescencia YFP se utiliza como un control de la expresión, así como en la segmentación de los núcleos, para generar las superficies usando una micrografía 3D comercial visualización y software de análisis. Para microscopio 2, uso 440 nm y 514 nm longitud de onda láser las líneas para excitar PPC y YFP, respectivamente. Adquirir dos pistas. Para la pista 1, fijado (por ejemplo,., ChS) detectores para detectar 464 – 500 nm para PPC (emisión del donante) y 526 – 562 nm para YFP (emisión de traste) después de la excitación de PPC. Para la pista 2, establecer un detector para detectar 526 – 562 nm de YFP (emisión de YFP) después de la excitación de YFP.Nota: Esta fluorescencia YFP se utiliza como un control de la expresión, así como en la segmentación de los núcleos, para generar las superficies en el software de análisis y visualización 3D. Adquisición de imágenes mediante un formato de 512 x 512 píxeles y una resolución de 12 bits. La ganancia debe ser ajustada a un valor determinado empíricamente que permite una buena señal y no saturando píxeles. La ganancia no se debe cambiar entre PPC y traste la emisión sobre el experimento. Coloque el alfiler 1 unidad aireada (AU). Coloque el IBIDI pegajoso-portaobjetos en la etapa del microscopio confocal y proceder con la proyección de imagen como se muestra. En el software del microscopio 1, mientras que en un escaneado activo, utilizar el resplandor más/menos situado en la parte superior izquierda de la pantalla de imagen para determinar la subexposición y la saturación de la región de interés. En el software del microscopio 2, utilizar el Indicador de rango situado en la parte inferior de la pantalla de imagen para determinar la subexposición y la saturación de la región de interés. Para cualquier análisis de imagen cuantitativo, no debería haber ninguna saturación de píxeles. Coloque las pilas en forma de z con un tamaño de paso de 1 μm. El tamaño de paso puede ser reducido para una mayor resolución de z o aumentado para un aumento de la velocidad de adquisición o a aumentar el número de posiciones y muestras que puede ser reflejada. Para el curso de tiempo automatizados, ajuste la hora junto con el z-pilas (modo xyzt de la ficha de modo de adquisición) para adquirir las imágenes en intervalos de tiempo. 5. imagen análisis con Fiji Nota: Con ImageJ (Fiji) es posible procesar datos de imágenes y producir imágenes bidimensionales (2D) de la relación de emisión nlsGPS1 en plántulas de Arabidopsis . Ejemplos de imágenes, ver figura 2A, 2C, 2E, 2 Gy 3A. En ImageJ, es posible encontrar cada comando del presente Protocolo mediante la función de búsqueda. Presione la barra espaciadora y L en el teclado del ordenador. Se abrirá una nueva ventana; Escriba el comando requerido en el campo de búsqueda. Arrastre el archivo (archivos de LIF o .lsm) Fiji (imagen J) y abra las imágenes como hyper-pila. En el menú principal, seleccione imagen > Stack > proyecto Z y seleccionar segmentos suma para capturar todos los píxeles en lugar de sólo los píxeles más brillantes como en proyección máxima. En el menú principal, seleccione proceso > restar fondo y conjunto el balanceo radio de bola a 50 píxeles. Deseleccionar todas las opciones y las tres imágenes del proceso. Este paso elimina el fondo utilizando el algoritmo de “bola de balanceo”.Nota: 50 píxeles se determinó empíricamente que incluyen núcleos como primer plano. En el menú principal, seleccione imagen > Color > dividir canales. Abrirán tres nuevas ventanas: C1-suma (canal de PPC); C2-suma (Canal de traste) y C3-suma (canal de YFP). Seleccione la ventana C3-suma y, en el menú principal, seleccione proceso > filtros > Desenfoque gaussiano y aplicar un desenfoque gaussiano de 1 para reducir el ruido de la imagen. En el menú principal, seleccione imagen > ajuste > Brillo/contraste y auto select. En el menú principal, seleccione proceso > mejorar el Contrastey conjunto saturado = 0.35. En el menú principal, seleccione imagen > tipo > 8 bits y las pilas a convertir una imagen de 8 bits. En el menú principal, seleccione imagen > ajustar > Umbral de Auto-Local. En el Umbral de Auto-Local, seleccione los siguientes parámetros: método de Phansalkar, radio = 15, parámetro 1 = 0, parámetro 2 = 0y pila blanca. En este paso, pilas de YFP se utilizan para hacer una máscara binaria. Seleccione la ventana Suma C2 y, en el menú principal, seleccione proceso > filtros > Desenfoque gaussiano y aplicar un desenfoque gaussiano de 1. Seleccione la ventana de la Suma de C1 y, desde el menú principal, seleccione proceso > filtros > Desenfoque gaussiano y aplicar un desenfoque gaussiano de 1. Para crear la pila de la relación de emisión de los dos canales desde el menú principal, seleccione proceso > Calculadora de la imagen. En la nueva ventana que aparecerá, seleccione Suma C2 como imagen 1, seleccione dividir como operador y seleccione C1 suma como imagen 2. Asegúrese de que seleccionar crear una nueva ventana y el formato de 32 bits. Aparecerá una nueva ventana nombre Resultado de la suma C2. En el menú principal, seleccione imagen > tabla de búsqueda > LUT 16_colors. En el menú principal, seleccione proceso > Calculadora de la imagen. En la nueva ventana que aparecerá, seleccione Resultado de la suma C2 como imagen 1, seleccione multiplicar como operador y seleccione C3-suma como imagen 2. En este paso, la máscara binaria de YFP se multiplica con la pila de YFP/CFP para mostrar sólo los píxeles en el canal de control YFP. En el menú principal, seleccione proceso > matemáticas > dividir y set el valor 255. En la nueva ventana que se abre, seleccione sí para analizar todas las imágenes de la pila. Una nueva imagen aparecerá nombre Resultado de resultado de C2 suma. En el menú principal, seleccione imagen > ajuste > Brillo/contraste y seleccione Auto. En el menú principal, seleccione proceso > Mejorar el contrastey, a continuación, seleccione tipo saturado = 0.35. En el menú principal, seleccione imagen > ajuste > Brillo/contrastey valores mínimos y máximos para capturar la distribución de GA. Paso opcional: desde el menú principal, seleccione análisis > herramientas > Calibración Bar y bar Show LUT-calibracióny guardar el Resultado de resultado de C2 suma como un archivo TIFF. Para obtener valores de la emisión de razones, desde el menú principal, seleccione analizar > configurar medición y seleccione gris valor medio y desviación estándar. Seleccione la forma de rectángulo de la barra de herramientas y dibuje un área de interés (ROI). En el menú principal, seleccione analizar > medida. Una nueva ventana informará el valor medio de la ROI seleccionada. Copiar y pegar los valores obtenidos en el software de hoja de cálculo (por ejemplo, Excel o OriginPro) y hacer un histograma para un tratamiento antes y después GA4 experimentar o un gráfico de línea para un curso de tiempo experimentar. 6. imagen análisis utilizando Software de análisis y visualización 3D Nota: La ventaja de usar el software seleccionado (véase Tabla de materiales) es segmentar objetos (por ejemplo, núcleos) y crear imágenes 3D de una z-pila confocal. Ejemplos de imágenes, ver figura 2B, 2D, 2F, 2 Hy 3B. Abra el software e importar el archivo (archivos de LIF o .lsm). Segmento basados en el canal de emisión de YFP de control mediante el Asistente para las superficiesde los núcleos. Los objetos segmentados se llaman “superficies”. Este paso de segmentación permite el análisis de todos los vóxeles en un núcleo como un objeto, eliminar fondo de vóxeles fuera del núcleo. En el Asistente de superficies, establecer la sustracción de fondo (contraste local) a 3 μm y el umbral por defecto. Máscara de la CFP emisión (emisión de donantes de excitación de donantes [DxDm]) y canales de emisión (emisión de aceptador de excitación de donantes [DxAm]) traste partiendo de las superficies creadas mediante el canal YFP emisión (emisión de aceptador de excitación de aceptador [AxAm]). Utilizar la extensión XT significa intensidad relación para calcular un cociente de la emisión de aceptador de excitación donantes dividido por la emisión del donador donante excitación (DxAm/DxDm) entre los valores de la intensidad media de las superficies individuales en los dos canales.Nota: Esta extensión está disponible para su descarga. Para las superficies individuales con el cociente de la emisión de nlsGPS1 de color, seleccione Color de codificación con las estadísticas, que se representa como un icono de la rueda de color. Seleccione significa cociente de intensidad como tipo de estadísticas. Exportación de los cocientes de los valores individuales de la tabla, que se encuentra bajo el icono de estadísticas . Copie y pegue los valores en una hoja de cálculo y hacer un histograma para antes y después el GA4 tratamiento experimentos o un gráfico lineal de tiempo curso de experimentos. 7. estadístico análisis Nota: Ver figura 3D para una parcela beeswarm y cuadro de coeficientes de emisión nlsGPS1. Abra el software y pegue el cociente de la emisión de las superficies de los núcleos Y columnas. Seleccione las columnas de interés y estadísticas > Estadísticas Descripción > prueba de normalidad para saber si las muestras se distribuyen normalmente. Ejecutar la prueba de normalidad y una nueva ventana se abrirá y reportar los resultados. Si las muestras se distribuyen normalmente, uso el t-test como prueba estadística. Seleccione estadísticas > comprobación de hipótesis > prueba de t de dos muestras en filas y correr el t-test. Si las muestras no se distribuyen normalmente, seleccione estadísticas > comprobación de hipótesis estadísticas > dos muestras prueba de varianza para conocer si la variación entre las muestras no es significativamente diferente. Si la varianza no es significativamente diferente, use la prueba U de Mann-Whitney como prueba estadística. Seleccionar estadística > Pruebas no paramétricas > prueba de Mann-Whitney y ejecutar la prueba. Si la varianza es significativamente diferente, utilice la prueba ANOVA de Kruskal Wallis como prueba estadística. Seleccione estadísticas > Pruebas no paramétricas > prueba de Kruskal Wallis ANOVA y ejecutar la prueba.