Visualisierung zellulären Gibberellin-Ebenen mit NlsGPS1 Förster Resonance Energy Transfer (FRET) Biosensor

1. Vorbereitungen Bereiten Sie ½ Murashige und Skoog Agar pH 5,7 mit keine Saccharose (1 L). 2,2 g Murashige und Skoog (MS) basale Medium in 950 mL hochreines Wasser auflösen. PH-Wert bis 5,7 mit 5 M KOH anpassen. Die Lösung zu einem Endvolumen von 1 L mit Reinstwasser bilden. Teilen sie in zwei 500 mL Flaschen, jede mit 1 % pflanzlichen Agar. Autoklaven bei 121 ° C für 20 Minuten. Bereiten Sie ¼ MS Flüssigkeit bei pH 5,7 mit keine Saccharose (1 L). 1,1 g von MS in 950 mL hochreines Wasser auflösen. PH-Wert bis 5,7 mit 5 M KOH anpassen. Die Lösung zu einem Endvolumen von 1 L mit Reinstwasser bilden. Teilen sie in zwei 500 mL Flaschen. Autoklaven bei 121 ° C für 20 Minuten. GA4vorbereiten. Lösen Sie die GA4 in Ethanol 70 %, eine Endkonzentration von 100 mM GA4 Lager zu machen. Um funktionierende Lösung vorzubereiten, verdünnen Sie die GA4 Lager auf 0,1 – 1 µM in ¼ MS flüssigen pH 5,7. (2) Pflanzenwachstum Sterilisieren Sie die Arabidopsis -Samen. Arbeiten Sie mit einem chemischen Haube. Aliquoten Saatgut (ca. 200) in 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen. Verwenden Sie einen Stift mit Chlor-resistenten Tinte und legen Sie die Rohre mit offenen Deckel im Innern des Behälters Sterilisation (eine große Kiste, die versiegelt werden kann). Legen Sie eine 250 mL-Becherglas mit 50 mL Reinstwasser und 50 mL Natriumhypochlorit-Lösung im Innern des Behälters Sterilisation. Das Becherglas 3 mL konzentrierte Salzsäure (HCl) hinzufügen. Sofort das Gefäß verschließen und Sterilisation von Chlorgas für 6 – 16 h ermöglichen. Schließen Sie nach Entsiegelung des Schiffes die Abdeckungen der alle Mikrozentrifugenröhrchen im Samen Rack. Sterilisierte Samen können bis zum Zeitpunkt der Beschichtung trocken gelagert werden. Säen Sie ca. 20 sterilisierte Arabidopsis auf ½ MS Agar quadratischen Platten. Versiegeln Sie die Platten mit porösen chirurgische Klebeband und wickeln Sie sie mit Alufolie. Lang 1 – 3 Tage für Schichtung bei 4 ° C inkubieren. Für die Wurzel Bildgebung, übertragen die Platten der Wachstum Kammer in einer vertikalen Position für 3 Tage mit den folgenden Wachstumsbedingungen: langen Tage Bedingungen (LD, 16 h Licht/8 h der Dunkelheit); 120 µmol⋅m-2s-1 Lichtintensität; Temperatur von 22 ° C (während der Licht-Zyklus) oder 18 ° C (während des dunklen Zyklus), 65 % Relative Luftfeuchtigkeit (RH). Für Dunkelheit gewachsen Keimachse: übertragen Sie die Platten auf Wachstum Kammer für einen Lichtimpuls von 1 – 4 h um die Keimung zu synchronisieren. Wickeln Sie die Platten mit Alu-Folie und legen Sie sie in die Kammer Wachstum in einer vertikalen Position für 3 Tage. 3. die Probenvorbereitung Stationäre Messungen (Abbildung 1A() Fügen Sie auf einen sauberen Objektträger 50 µL ¼ MS Flüssigkeit (von nun an als mock Lösung bezeichnet). Übertragen Sie sanft zu Sämlinge mit dem Ausdruck nlsGPS1 von der Platte auf die Folie. Nehmen Sie ein sauberes Deckglas und vor Ort einen Tropfen Vakuum Fett an jeder Ecke das Deckglas. Sanft lege das Deckglas über die Sämlinge und sorgfältig fügen Sie zusätzliche Pseudo-Lösung um Luftblasen zu entfernen. GA4 Behandlung: chemische Exchange Experiment (Abbildung 1 b). Vor der GA4 Behandlung, verwenden Sie eine 20 mL Spritze gefüllt mit Vakuum Fett (verbunden mit einem Pipettieren Tipp) um ein Rechteck zu zeichnen (Länge: 3,5 cm, Höhe: 2,5 cm) mit einer gleichmäßigen Schicht Vakuum Fett auf einem sauberen Objektträger (Abbildung 1 b). Um eine feine Linie von Vakuum Fett zu ermöglichen, sollte die Pipettieren Spitze geschnitten werden, um eine Öffnung von 1 mm Durchmesser haben. Die Objektträger 50 µL mock-Lösung hinzufügen. Wählen Sie mit sauberen Pinzette die nlsGPS1 Sämlinge und legen Sie sie sanft auf die mock Lösung. Um Schäden zu vermeiden, übertragen Sie die Keimlinge von den Unterseiten der Keimblätter zu unterstützen, ohne den Keimling mit der Pinzette greifen. Nehmen Sie ein sauberes Deckglas und vor Ort einen Tropfen Vakuum Fett an jeder Ecke das Deckglas. Mit der Pinzette, legen Sie das Deckglas in der Mitte des Rechtecks Vakuum Fett. Jetzt ist das Deckglas auf beiden Seiten entsprechend den langen Kanten des Rechtecks Vakuum Fett versiegelt. Fügen Sie sorgfältig extra mock Lösung füllen Sie das Reservoir und eventuelle Luftblasen innerhalb des Reservoirs zu entfernen, ohne störende Seedling(s) im Inneren. Erwerben Sie die Bilder vor der GA4 Behandlung mit einem konfokalen Mikroskop. Folgen Sie den Anweisungen, wie in Abschnitt 4 dieses Protokolls beschrieben. Entfernen Sie für die GA4 Behandlung den Mikroskop-Objektträger von der konfokalen Bühne. Stellen Sie einen Timer für 20 Minuten. Nach dem Start des Timers, tauschen Sie die Pufferlösung mit ¼ MS Flüssigkeit mit 1 µM GA4 aus. Fügen Sie GA-4 -Lösung (ca. 50 µL hinzu) von der linken Seite das Deckglas und entfernen Sie die vorherigen (mock) Lösung von der rechten Seite. Austausch zu halten auf die Lösung, die mock Lösung vollständig zu ersetzen, die dauert ca. 10 Minuten (Abbildung 1 b). Setzen Sie den Objektträger wieder auf den Mikroskoptisch. Warten Sie weitere 10 min vor dem Erwerb der nach GA-Bild. Einrichten von einem zeitlichen Verlauf für das Gewebe von InteresseHinweis: Das Gewebe von Interesse könnte zum Beispiel Hypocotyle oder Wurzeln sein. Routinemäßig führen wir Zeit Kurse für nlsGPS1 Biosensor mit einem kommerziellen Perfusion imaging (Abbildung 1, siehe Tabelle der Materialien) oder ein RootChip7,10,11. Der Mitte des Kanals Perfusion der klebrig-Folie 200 µL mock-Lösung hinzufügen (siehe Tabelle der Materialien). Sanft wählen Sie nlsGPS1 Sämlinge und legen Sie sie auf die mock-Lösung in die klebrige Folie. Mit Pinzette, sanft die Glas-Deckglas bringen und mit der Rückseite der Zange, drücken Sie vorsichtig an den äußeren Rändern der Deckglas so dass es eine starke Bindung mit dem klebrigen Material an der Peripherie der klebrig-Folie bildet. Mit beiden Ellenbogen Luer verbinden Steckverbinder (mit einem Innendurchmesser [ID] von 0,8 mm) und der Silikonschlauch (mit einer Kennung von 0,8 mm), die klebrige Folie um eine 20 mL Spritze und einem Auslass Behälter sammeln die Abfluss-Lösung. Verwenden Sie den Luer Lock Anschluss (mit einer Kennung von 0,8 mm) Verbindung die Spritze zu den Silikonschlauch. Drücken Sie vorsichtig die Spritze mit der mock Lösung manuell um lassen genug Lösung durch die Kammer weiterleiten, damit keine Luftblasen in der Kammer Links vorhanden sind. Legen Sie und halten Sie die Spritze auf die programmierbare Spritzenpumpe. Stellen Sie die Pumpe Parameter bestimmte an der Spritze verwendet (dh., Durchmesser und Volumen) zusammen mit der Durchfluss entsprechend der Bedienungsanleitung mit der Pumpe zur Verfügung gestellt.Hinweis: In diesem Protokoll ein Durchfluss von 1 – 3 mL/h diente, und dies kann nach den experimentellen Anforderungen geändert werden. Starten Sie den zeitlichen Verlauf durch Starten der Pumpe. Stoppen Sie für GA4 Behandlung während einer zeitlichen Verlauf (Abbildung 1) die Durchblutung durch Anhalten der Pumpe zu und ändern Sie die Spritze mit einer neuen ein mit ¼ MS Flüssigkeit mit GA4ergänzt. Gehen Sie mit konfokale Bildgebung, wie im nächsten Abschnitt gezeigt. (4) Mikroskopie Hinweis: Wir führen konfokale Lasermikroskopie. Abrufen von Bildern mit einem konfokalen Mikroskop ausgestattet mit Lasern Bund Bildgebung durchführen.Hinweis: Für nlsGPS1 sind Varianten von Cyan fluoreszierenden Proteins (GFP) und gelb fluoreszierenden Proteins (YFP) abgebildet. In diesem Protokoll werden kommerzielle Mikroskope (siehe Tabelle der Materialien, als Mikroskop 1 und 2) mit 10 X oder 20 X trocken 0,70 harmonische Verbindung PLAN APO Ziele verwendet. Für Mikroskop 1, Verwendung 448 nm und 514 nm Wellenlänge Laser CFP und YFP, bzw. zu begeistern. Sequenzielle Scans zu erwerben. Setzen Sie Detektoren (z. B. HyD SMD), um 460-500 nm für GFP (Spender Emission) und 525-560 nm für YFP (Bund Emission) nach der Anregung der GFP zu erkennen. Legen Sie mithilfe einer zweiten Sequenz eines Detektors, 525-560 nm für YFP (YFP Emission) zu erkennen nach der Anregung von YFP.Hinweis: Diese YFP Fluoreszenz wird als Ausdruck Kontrolle sowie Segmentierung Kerne, Oberflächen mit einem kommerziellen Schliffbild 3-d-Visualisierung und Analyse-Software generiert. Für Mikroskop 2, Verwendung 440 nm und 514 nm Wellenlänge Laserlinien CFP und YFP, bzw. zu begeistern. Zwei Tracks zu erwerben. Für Spur 1 Detektoren (z. B.., ChS) zur Erkennung von 464 – 500 nm für GFP (Spender Emission) und 526 – 562 nm für YFP (Bund Emission) nach der Anregung von GFP festgelegt. Für track 2, einen Detektor zu erkennen 526 – 562 nm für YFP (YFP Emission) nach der Anregung von YFP gesetzt.Hinweis: Diese YFP Fluoreszenz wird als Ausdruck Kontrolle sowie Segmentierung Kerne, verwendet, um Oberflächen in der 3-d-Visualisierung und Analyse-Software zu erzeugen. Abrufen von Bildern mit einem Format von 512 x 512 Pixel und einer Auflösung von 12 Bit. Der Gewinn muss auf einen empirisch ermittelten Wert eingestellt werden, die für ein gutes Signal ermöglicht, während die Pixel nicht zu sättigen. Der Gewinn sollte zwischen GFP und Bund über das Experiment nicht geändert werden. Legen Sie das Loch auf 1 luftig Einheit (AU). Legen Sie die IBIDI klebrig-Folie auf der Stufe der confocal Mikroskop, und fahren Sie mit Bildgebung wie zuvor gezeigt. Im Mikroskop 1 Software in der eine aktive live-Bild nutzen Sie Glühen über/unter befindet sich auf der oberen linken Seite des Bildschirms Bild, um die Unterbelichtung und Sättigung des relevanten Bereichs bestimmen. Nutzen Sie in das Mikroskop 2 Software Range Indikator befindet sich auf der Unterseite des Bildschirms Bild zur Ermittlung der Unterbelichtung und Sättigung der Region von Interesse. Für eine quantitative Bildanalyse sollte keine Pixel-Sättigung. Legen Sie die Z-Stapel mit einer Schrittweite von 1 μm. Die Schrittgröße kann für eine höhere Z-Auflösung reduziert oder erhöht für eine erhöhte Geschwindigkeit der Erwerb oder die Anzahl der Positionen/Samples zu erhöhen, die abgebildet werden können. Stellen Sie für den automatisierten zeitlichen Verlauf die Zeit zusammen mit der Z-Stapel (Xyzt-Modus von der Registerkarte “Übernahme-Modus”), um die Bilder in bestimmten Zeitabständen zu erwerben. (5) Bildanalyse mit Fidschi Hinweis: Mit ImageJ (Fidschi) ist es möglich, Bilddaten verarbeiten und zweidimensionale (2D)-Bilder der nlsGPS1 Emission Ratio in Arabidopsis Sämlinge zu erzeugen. Beispiele für Bilder siehe Abbildung 2A, 2 C, 2E, 2 Gund 3A. In ImageJ ist es möglich, jedem Befehl dieses Protokolls über die Suchfunktion zu finden. Drücken Sie die Leertaste und L auf der Computertastatur. Es öffnet sich ein neues Fenster; Geben Sie den gewünschten Befehl in das Suchfeld ein. Ziehen Sie die Datei (entweder .lif oder .lsm-Dateien) in Fidschi (Bild J) und öffnen Sie die Bilder als hyper-Stack. Aus dem Hauptmenü wählen Sie Bild > Stack > Z-Projekt und wählen Sie Summe Scheiben alle Pixel anstatt nur die hellsten Pixel wie Max Projektionzu erfassen. Wählen Sie aus dem Hauptmenü Prozess > Subtract Hintergrund und Satz der rollenden Kugel Radius 50 Pixel. Alle anderen Optionen deaktivieren und alle drei Bilder zu verarbeiten. Diese Schritt entfernt Hintergrund mit dem “rollenden Ball”-Algorithmus.Hinweis: 50 Pixel wurde empirisch bestimmt, Kerne als Vordergrund aufzunehmen. Aus dem Hauptmenü wählen Sie Bild > Farbe > Kanäle teilen. Drei neue Fenster öffnet sich: C1-Summe (GFP Kanal); C2-Summe (Bund Kanal) und C3-Summe (YFP Kanal). Wählen Sie das C3-SUM -Fenster und wählen Sie aus dem Hauptmenü Prozess > Filter > Gaußscher Weichzeichner und wenden Sie einen Gaußschen Weichzeichner 1 um das Bildrauschen zu reduzieren. Aus dem Hauptmenü wählen Sie Bild > anpassen > Helligkeit/Kontrast und wählen Sie Auto. Wählen Sie aus dem Hauptmenü Prozess > Kontrast verbessernund Set gesättigten = 0.35. Aus dem Hauptmenü wählen Sie Bild > Art > 8-Bit und die Stapel in einem 8-Bit-Bild umwandeln. Aus dem Hauptmenü wählen Sie Bild > anpassen > Auto-Local-Schwelle. Wählen Sie in der Auto-Local-Schwelle, die folgenden Parameter: Phansalkar Methode, Radius = 15, Parameter 1 = 0, Parameter 2 = 0und weiße Stapel. In diesem Schritt werden YFP Stapel verwendet, um eine binäre Maske machen. Wählen Sie das C2-SUM -Fenster und wählen Sie aus dem Hauptmenü Prozess > Filter > Gaußscher Weichzeichner und wenden Sie einen Gaußschen Weichzeichner 1. Wählen Sie das C1-SUM -Fenster und wählen Sie aus dem Hauptmenü Prozess > Filter > Gaußscher Weichzeichner und wenden Sie einen Gaußschen Weichzeichner 1. Erstelle ich die Emission Verhältnis Stapel aus den zwei Kanälen aus dem Hauptmenü wählen Sie Prozess > Bildrechner. In dem neuen Fenster, das angezeigt wird, wählen Sie C2-Summe als Bild 1, wählen Sie Teilen als Betreiber und C1 Summe als Bild 2. Achten Sie darauf, wählen erstellen ein neues Fenster “und” die 32-Bit-Format. Ein neues Fenster erscheint benannte Ergebnis der C2-Summe. Aus dem Hauptmenü wählen Sie Bild > Lookup-Tabelle > LUT 16_colors. Wählen Sie aus dem Hauptmenü Prozess > Bildrechner. In dem neuen Fenster, das angezeigt wird, wählen Sie Ergebnis der C2-Summe als Bild 1, wählen Sie multiplizieren Sie als Betreiber und C3-Summe als Bild 2. In diesem Schritt wird die YFP binäre Maske mit dem YFP/GFP-Stack nur Pixel in der Steuerkanal YFP präsent zeigen multipliziert. Wählen Sie aus dem Hauptmenü Prozess > Mathematik > Teilen und weisen ihr den Wert 255. Wählen Sie in dem neuen Fenster, das geöffnet wird Ja , alle Bilder im Stapel zu analysieren. Ein neues Bild erscheint benannte Ergebnis des Ergebnis der C2-Summe. Aus dem Hauptmenü wählen Sie Bild > anpassen > Helligkeit/Kontrast und wählen Sie Auto. Wählen Sie aus dem Hauptmenü Prozess > Kontrast zu erhöhen, und wählen Sie Typ gesättigt = 0.35. Aus dem Hauptmenü wählen Sie Bild > anpassen > Helligkeit/Kontrastund eingestellten minimalen und maximalen Werte die GA-Verteilung zu erfassen. Optionaler Schritt: Wählen Sie im Hauptmenü von Analyze > Tools > Kalibrierung Bar und Bar Show LUT-Kalibrierung, und das Ergebnis des Ergebnis der C2-Summe als eine TIFF-Datei speichern. Werte der Emission Verhältnisse, aus dem Hauptmenü wählen Sie Analyze > Messung festlegen und wählen Sie graue Mittelwert und Standardabweichung. Wählen Sie das Rechteck-Shape aus der Symbolleiste und ziehen einer Region of Interest (ROI). Wählen Sie im Hauptmenü von Analyze > messen. Ein neues Fenster wird den Mittelwert aus den ausgewählten ROI berichten. Kopieren und fügen Sie die erhaltenen Werte in Tabellenkalkulations-Software (z. B. Excel oder OriginPro) und machen ein Histogramm für ein vorher-nachher-GA4 Behandlung zu experimentieren oder ein Liniendiagramm für einen zeitlichen Verlauf zu experimentieren. (6) Bildanalyse mit 3-d-Visualisierung und Analyse-Software Hinweis: Der Vorteil der Verwendung der ausgewählten Software (siehe Tabelle der Materialien) ist zu segmentieren Objekte (z. B. Kerne) und 3-d-Bilder aus einem konfokalen Z-Stapel zu erstellen. Beispiele für Bilder siehe Abb. 2 b, 2D, 2F, 2 Hund 3 b. Öffnen Sie die Software und importieren Sie die Datei (entweder .lif oder .lsm-Dateien). Segment Kerne anhand der YFP Emission Steuerkanal mit dem Oberflächen-Assistenten. Die segmentierte Objekte sind “Oberflächen” bezeichnet. Diese Segmentierung Schritt erlaubt die Analyse von allen Voxel im Kern als ein Objekt ohne Hintergrund aus Voxeln außerhalb der Kern. Hintergrundabzug (lokaler Kontrast) soll in der Oberflächen-Assistenten3 µm und die Schwellwerte auf Standard. Maskieren Sie die GFP Emission (Spender Erregung Spender Emission [DxDm]) und Bund Emission (Spender Erregung Akzeptor Emission [DxAm]) Kanäle anhand der Oberflächen mit den YFP Emission (Akzeptor Erregung Akzeptor Emission [AxAm]) Kanal erstellt. Verwenden Sie die Erweiterung XT bedeuten Intensitätsverhältnis , um ein Verhältnis von Spender Erregung Akzeptor Emission geteilt durch Spender Erregung Spender Emission (DxAm/DxDm) zwischen den Intensitätswerten der mittlere der einzelnen Flächen in den beiden Kanälen zu berechnen.Hinweis: Diese Erweiterung ist online zum Download verfügbar. Um die einzelnen Oberflächen mit dem nlsGPS1-Emission-Verhältnis Farbe, wählen Sie Farbcodierung mit Statistiken, die als Farbe Rad-Symbol dargestellt wird. Wählen Sie als Statistik Intensitätsverhältnis bedeuten . Exportieren Sie die Verhältnisse der einzelnen Werte aus der Tabelle, die unter dem Statistik -Symbol zu finden ist. Kopieren und fügen Sie die Werte in eine Tabelle und ein Histogramm für vorher-nachher-GA4 Behandlung Experimente oder ein lineares Diagramm Mal Kurs Experimente zu machen. 7. statistische Analyse Hinweis: Siehe Abbildung 3D für einen Beeswarm und Box Plot nlsGPS1 Emission Verhältnisse. Öffnen Sie die Software und fügen Sie das Verhältnis der Emission der Kerne Oberflächen als Y-Spalten ein. Wählen Sie die Spalten von Interesse und Statistik > Statistik Beschreibung > Normalität zu testen , zu wissen, ob die Stichproben normalverteilt sind. Führen Sie den Test von Normalität und ein neues Fenster öffnet und die Ergebnisse zu melden. Wenn die Stichproben normalverteilt sind, verwenden Sie den t-test als statistische Test. Wählen Sie Statistik > Hypothesentests > zwei Stichproben t-Test auf Zeilen und Lauf der t-test. Wenn die Proben nicht normalverteilt sind, wählen Sie Statistik > Statistik Hypothesentests > zwei-Stichproben für die Varianz zu testen , zu wissen, ob die Varianz zwischen den Beispielen nicht wesentlich unterscheidet. Wenn die Abweichung nicht wesentlich unterscheidet, verwenden Sie die Mann-Whitney U test als statistischen Test. Wählen Sie Statistik > Nichtparametrische Test > Mann-Whitney test und führen Sie den Test. Wenn die Varianz deutlich abweicht, verwenden Sie Kruskal-Wallis ANOVA testen als statistische Test. Wählen Sie Statistik > Nichtparametrische Test > Kruskal-Wallis ANOVA testen und führen Sie den Test.