NlsGPS1 Förster rezonans enerji kullanarak görüntülenmesi hücresel Giberellin düzeyleri (FRET) biyoalgılayıcı aktarma
Summary
Giberellin algı sensör 1 (GPS1) Giberellin etki kronolojik zamanmekansal yüksek çözünürlüğe hücresel düzeyde ölçmek için ilk Förster rezonans enerji transferi tabanlı biyoalgılayıcı olduğunu. Bu iletişim kuralı yöntemi görselleştirmek ve genetik olarak kodlanmış nlsGPS1 biyoalgılayıcı Arabidopsis hypocotyls ve kök ipuçlarını kullanarak hücresel Giberellin düzeyleri ölçmek için raporlar.
Abstract
Phytohormone Giberellin (GA) bitkilerde tohum çimlenme, hücresel uzama ve gelişimsel geçişler önemli bir rol oynayan bir küçük, telefon sinyal moleküldür. İlk Förster rezonans enerji transferi (FRET) olan Giberellin algı sensör 1 (GPS1)-hücresel GA düzeyleri içinde vivo izleme sağlar biyoalgılayıcı dayalı. Nükleer lokalize-GPS1 (nlsGPS1) Floresan emisyon oranını ölçerek, endogenously ve exogenously verilen GA degradeler farklı doku türlerine kronolojik zamanmekansal haritalama hücresel bir ölçekte mümkün olabilir. Bu iletişim kuralı nlsGPS1 emisyon oranları üç örnek deneylerde görüntüye nasıl anlatacağım: kararlı durum, öncesi ve sonrası eksojen Giberellin A4 (GA4) tedavi ve bir tedavi zaman-ders bitti. Biz de nlsGPS1 emisyon oranları Fiji ve ticari üç boyutlu (3-b) test görselleştirme ve analiz yazılımı kullanarak analiz ve sınırlamalar ve Giberellin düzeylerini ölçmek için nlsGPS1 kullanarak büyük olasılıkla tuzaklar açıklamak için yöntemler sağlar.
Introduction
Bitki hormonları bitki büyüme ve gelişmesi temel bir rol oynar. Bu küçük, telefon sinyal molekülleri genellikle biyosentezi, katabolizma ve kısa ve uzun mesafeli taşıma1,2,3,4gibi çeşitli düzeylerde düzenlenmektedir. Hormon sinyal yolları ve aşağı akım transkripsiyon yanıt anlayışı yılda bilenmiş. Ancak, çeşitli hücresel yanıt hormon sinyal yollar hormon dağıtımları yönetmenlik düzenleyici girişleri ile bağlamak için biz hormon düzeyleri hücresel bir ölçekte kronolojik zamanmekansal bir miktar gerektirir. Etki tespit edebilirsiniz FRET tabanlı biyosensörler hormon düzeyleri, hücresel bir ölçek ölçmek için bilim adamlarının yetenek ilerletebilirsiniz. Biyosensörler FRET tabanlı belirli bir ligand bağlar veya biyolojik bir uyarana tepki duyusal bir etki alanına bağlı bir perde çift (donör ve alıcısı floresan proteinleri) oluşur. Küçük molekül biyosensörler için mesafe ve/veya yönünü FRET çiftinin iki floresan proteinler arasında bir değişim sonuçlarının duyusal etki alanının konformasyonal değişim ligand bağlayıcı tetikler. PERDE biyoalgılayıcı ratiometric analizini donör heyecan verici ve alıcısı floresans emisyon oranını ölçerek donör5,6gerçekleştirilir. Ligand bağlayıcı bir değişiklik bu emisyon oranı7olarak algılanabilir.
Bitki hormon GA gaz için tohum çimlenme, hücresel uzama ve çiçeklenme aşamaları bitkisel gelişimsel geçiş yükseltebilirsiniz hormonların bir sınıf biz son zamanlarda FRET tabanlı biyoalgılayıcı geliştirilmiştir. NlsGPS1 biyoalgılayıcı nükleer lokalize ve GA dynamics çeşitli bitki dokularında kronolojik zamanmekansal ilgili bilgiler sağlar. Arabidopsis hücrelerdeki GA çözünür reseptörleri, Giberellin-duyarlı cüce (GID), bağlar ve karmaşık GA2sinyal negatif düzenleyiciler hareket DELLA protein bozulması indükler. NlsGPS1 GA duyusal etki alanına bağlanır DELLA protein (AtGAI) 74-amino asit kesilmesi Arabidopsis GA reseptör (AtGID1C) oluşur ve oluşan bir perde çift gelişmiş Cerulean donör floresan protein olarak dimerization türevleri ve Aphrodite (kodon çeşitlendirilmiş Venüs) alıcısı floresan protein8olarak. NlsGPS1 biyoalgılayıcı olan bir yüksek-benzeşme sensör biyoaktif GA4 için (Kd = 24 nM GA4için) ve çeşitli doku-harita ve GA degradeler ölçmek için türlerinde kullanılabilir. İçinde vivo Arabidopsis GA düzeyleri yanlış yorumlanmasına önlemek için Ayrıca nlsGPS1 yanıt vermeyen bir türevi geliştirdik (nlsGPS1-NR) negatif bir denetim olarak kullanmak için. NlsGPS1-NR protein GA bağlama bozabilecek mutasyonlar GA-bağlama cebinde ve GID reseptör proteinler7,9ile etkileşim bozabilir DELLA protein mutasyonların taşır. Emisyon oranı desen veya nlsGPS1 ve nlsGPS1-NR satırlarında gözlenen değişiklikleri doğrudan GA-bağlama olayları ile ilgili eserler olarak kabul edilebilir. NlsGPS1 bağlama GA4 hızla tersinir değildir ve bu nedenle, hücresel nlsGPS1 emisyon oranları GA en son yoğun belirli bir çekirdek yerine gerçek zamanlı temsil olarak yorumlanması gerektiğini unutmamak önemlidir kararlı durum düzeyleri. Sonuç olarak, bir analizini düşen GA düzeyleri ile nlsGPS1 mümkün değildir.
Burada biz bir nlsGPS1 biyoalgılayıcı model bitki Arabidopsisconfocal görüntüleme tabanlı yaklaşımlar yüksek çözünürlüklü kullanarak, hücrelerdeki kullanmak için detaylı bir protokol sağlar. Protokol görüntüleme bitki kökleri ve hypocotyls kararlı duruma hem üzerinde zaman-Dershaneler hakkında bilgi sağlar. NlsGPS1 sensörü çeşitli doku tipleri, hem de harita ve GA dağıtımları ölçmek için bitki türleri arasında potansiyel olarak yararlanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
PERDE tabanlı GA biyoalgılayıcı nlsGPS1 rapor ve GA hormon gradyanlar çok hücreli bitkiler ölçmek için nicel bir yöntem sağlar. Biyosensörler FRET tabanlı dynamics ile geliştirilmiş bir kronolojik zamanmekansal kararlılık kütle spektrometresi ve transkripsiyon gazetecilere veya sinyal-protein yıkımı-tabanlı yöntemleri12tarafından dolaylı ölçüm üzerinde doğrudan algılama ölçmek, 13. Yüksek çözünürlüklü hücresel görüntüleme çeşitli doku tipleri ile ilgili yönetmelik ve GA birikimleri çok hücreli bir bağlamda fonksiyonun biyoloji ve kıvılcım yeni hipotezler GA içine anlamlı yorumlara yol açabilir. Örneğin, nlsGPS1 biyoalgılayıcı belirli GA biyosentetik, katabolik ve taşıma mutantlar yanı sıra spatiotemporally indüklenen tedirginlikler sırasında değişiklikleri izleme özellikle nasıl GA gradyanlar içinde kurulan test etmek için çok bilgilendirici olabilir GA degradeler için yanıt adresi kök ve kök hücre. Sensör diğer modeli ve kırpma türler içinde tohum çimlenme, hücresel uzama ve çiçekli GA-aracılı kontrolü kontrol mekanizmaları korunması test etmek için kullanılabilir.
Kritik nlsGPS1 biyoalgılayıcı perde tabanlı görüntülemede adımlardır, 1) piksel nicel FRET çözümleme sırasında doymuş değil, “Dedektör kazanç” gibi 2) görüntüleme parametreleri tutulan donör emisyon (DxDm) için sabit ve alıcısı emisyon (DxAm) satın almalar, 3) kontrol nlsGPS1-NR şeritleri eserler ve 4 ekarte için kullanılması gereken) örnekleri drift ve Değiştir odak sorunları en aza indirmek için hazır. Ayrıca, çevresel koşullar içinde örnekleri yetiştirilmektedir GA düzeyleri ışık süresi ve ışık şiddeti14,15,16 gibi çevresel koşullara duyarlı olduğundan denetlemek önemlidir ,17. Bir anahtar analiz bu tür sinyal / gürültü oranı yüksek gürültü ratiometric görüntülemede doğasında artış nedeniyle görüntüleme için gerekli olduğunu kısıtlamasıdır. Böylece, nlsGPS1 görüntüleme doku ve organların ratiometric floresan mikroskopi için mavi ve Sarı floresan proteinleri kullanarak mükellef olmayan için yararlı olmayacaktır — örneğin, derin doku nerede floresan proteinler kötü algılanır. Bir iç kontrol biyoalgılayıcı ifadesi, istikrar, parlaklık veya belli bir hücre, doku tespit değişikliklerden kaynaklanan eserler ekarte için yararlıdır çünkü Öte yandan, ratiometric güzel intensiometric çıktıları üzerinde tercih edilen çoğu kez , veya durumu. Örneğin, üzülmek biyoalgılayıcı görüntüleme ve görüntü analizleri de doku5,6,18,19,20,çeşitli ligandlar çeşitli eğitim için kullanılmıştır. Görüntüleme deneyleri ve rapor burada görüntü analizleri gibi türleri’nde, örneğin, daha derin kök doku-roman anlayışlar verim hafif levha mikroskobu, yeni görüntüleme yöntemleri uyacak şekilde değiştirilebilir.
Birinci nesil nlsGPS1 biyoalgılayıcı Ayrıca eksojen GA tedavileri takip GA hücre içi artışlar rapor GA degradeler yüksek çözünürlüklü bir harita sağlar bir yüksek-benzeşme sensör olduğunu. NlsGPS1 geçerli sınırlamaları sensör hızla tersinir değildir ve böylece, kararlı durum GA düzeyde değil ama büyük olasılıkla, en fazla son GA konsantrasyonu çözümdeki faiz üzerinde raporlar, biridir. Sensör için kesin devir hızı da bilinen ve bu, düşük reversibility ile birlikte oluyor endojen GA depletions olarak algılanmasını önleyen bir kaç saat içinde bazı doku türleri için bir dakika içinde. O nlsGPS1 GA4 için yüksek bir yakınlık vardır unutmamak önemlidir (Kd = 24 nM) diğer GA biçimlerine göre (GA3 Kd= 240 nM, GA1Kd 110 = nM) ne zaman diğer biyoaktif gaz görüntüleme 7. GA biyosensörler gelecek nesiller reversibility yüksek afinite koruyarak artırmak veya çeşitli öncü, biyoaktif, veya catabolite gaz için farklı özelliklerine sergi için tasarlanmış.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Avrupa Birliği’nin ufuk 2020 araştırma ve yenilik programı (Hibe Sözleşmesi n ° 759282) kapsamında Avrupa Araştırma Konseyi (ERC) üzerinden fon aldı.
Materials
| nlsGPS1 Col0 Arabidopsis seeds | NASC | N2107734 | |
| nlsGPS-NR Col0 Arabidopsis seeds | NASC | N2107735 | |
| Gibberellin A4 (GA4) | Sigma | G7276 | dissolve in EtH70 % , and keep at -20°C |
| sodium hypochlorite solution (Bleach) | Fisher S/5040 | HSRA 064 | |
| Hydrogen cloride HCl | Sigma | 31434 | |
| Micropore tape | 3M | 1530-1 | |
| ibidi sticky-slide | Ibidi | 81128 | Luer 0.1 for root imaging |
| ibidi sticky-slide | Ibidi | 80168 | Luer 0.2 for hypocotyl imaging |
| glass coverslip for sticky slides | Ibidi | 10812 | |
| Elbow Luer Connectors | Ibidi | 10802 | |
| silicone tubing | Ibidi | 108401 | |
| Luer Lock Connector | Ibidi | 10826 | |
| programmable syringe pump | World Precision Instruments | AL-1000 | |
| Vacuum grease | Sigma | 18405 | |
| Murashige and Skoog Basal Salts | Duchefa | M0221 | |
| Agar plant, 1kg | Melford | P1001 | |
| Microscope slide ground edges, 76mm x 26mm, 1.0mm to 1.2mm thick | Fisher Scientific | 12383118 | |
| Cover slip No.1 1/2 glass 22mm x 22mm | Fisher Scientific | 12363138 | |
| Luer-slip Syringe 2o ml | Fisher Scientific | 10785126 | |
| 3M Micropor Surgical Paper Tape | Fisher Scientific | 12787597 | |
| Potassium Hydroxide, 500g | Sigma Aldrich | 221473-500G-D | |
| Absolute Ethanol | Fisher Scientific | 10428671 | |
| Forceps Watchmaker 5 StSteel | Scientific Laboratory Supplies | INS4340 | |
| Scissors, 125mm, stainless steel | Fisher Scientific | 12338099 | |
| Fitting reducer 0.5 to 1.6 | Ibidi | 10829 | |
| Leica SP8 | Confocal laser microscope 1 | ||
| Zeiss LSM 780 | Confocal laser microscope 2 | ||
| Imaris | Bitplane | 3D visualization and Analysis software | |
| Fiji | image analysis software | ||
| OriginPro | Origin Lab | Statistical Analysis Software |
References
- Binenbaum, J., Weinstain, R., Shani, E. Gibberellin Localization and Transport in Plants. Trends in Plant Science. 23 (5), 410-421 (2018).
- Sun, T. Gibberellin Metabolism, Perception and Signaling Pathways in Arabidopsis. The Arabidopsis Book. 6, 0103 (2008).
- Rieu, I., et al. Genetic Analysis Reveals That C19-GA 2-Oxidation Is a Major Gibberellin Inactivation Pathway in Arabidopsis. The Plant Cell Online. 20 (9), 2420-2436 (2008).
- Regnault, T., et al. The gibberellin precursor GA12 acts as a long-distance growth signal in Arabidopsis. Nature Plants. 1, 15073 (2015).
- Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. Quantitative Imaging with Fluorescent Biosensors. Annual Review of Plant Biology. 63 (1), 663-706 (2012).
- Walia, A., Waadt, R., Jones, A. M. Genetically Encoded Biosensors in Plants: Pathways to Discovery. Annual Review of Plant Biology. 69 (1), 497-524 (2018).
- Rizza, A., Walia, A., Lanquar, V., Frommer, W. B., Jones, A. M. In vivo gibberellin gradients visualized in rapidly elongating tissues. Nature Plants. 3 (10), 803-813 (2017).
- Rizzo, M. A., Springer, G., Segawa, K., Zipfel, W. R., Piston, D. W. Optimization of pairings and detection conditions for measurement of FRET between cyan and yellow fluorescent proteins. Microscopy and Microanalysis. 12 (3), 238-254 (2006).
- Ueguchi-Tanaka, M., et al. GIBBERELLIN INSENSITIVE DWARF1 encodes a soluble receptor for gibberellin. Nature. 437, 693-698 (2005).
- Grossmann, G., et al. Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip. Journal of Visualized Experiments. (65), 34290 (2012).
- Grossmann, G., et al. The RootChip: an integrated microfluidic chip for plant science. Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).
- Brunoud, G., et al. A novel sensor to map auxin response and distribution at high spatio-temporal resolution. Nature. 482, 103-106 (2012).
- Wang, N. N., Shin, M. C., Li, N. The GUS reporter-aided analysis of the promoter activities of Arabidopsis ACC synthase genes AtACS4, AtACS5, and AtACS7 induced by hormones and stresses. Journal of Experimental Botany. 56 (413), 909-920 (2005).
- Alabadi, D. Gibberellins Repress Photomorphogenesis in Darkness. Plant Physiology. 134 (3), 1050-1057 (2004).
- De Lucas, M., et al. A molecular framework for light and gibberellin control of cell elongation. Nature. 451 (7177), 480-484 (2008).
- Strasser, B., Sanchez-Lamas, M., Yanovsky, M. J., Casal, J. J., Cerdan, P. D. Arabidopsis thaliana life without phytochromes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (10), 4776-4781 (2010).
- Feng, S., et al. Coordinated regulation of Arabidopsis thaliana development by light and gibberellins. Nature. 451, 475-479 (2008).
- Choi, W. G., Swanson, S. J., Gilroy, S. High-resolution imaging of Ca2+, redox status, ROS and pH using GFP biosensors. Plant Journal. 70 (1), 118-128 (2012).
- Lanquar, V., et al. Dynamic imaging of cytosolic zinc in Arabidopsis roots combining FRET sensors and RootChip technology. New Phytologist. 202 (1), 198-208 (2014).
- Krebs, M., Schumacher, K. Live cell imaging of cytoplasmic and nuclear Ca2+ dynamics in Arabidopsis roots. Cold Spring Harbor. 2013 (8), 776-780 (2013).
