نقل نحققها جبرلين الخلوية مستويات استخدام الطاقة الرنين فورستر NlsGPS1 بيوسينسور (بكى)
Summary
جبرلين تصور الاستشعار 1 (GPS1) هو الأولى فورستر الرنين الطاقة المستندة إلى نقل بيوسينسور لقياس مستويات الخلوية phytohormones جبرلين مع ارتفاع قرار الزمانية المكانية. هذا البروتوكول تقارير بشأن الطريقة التي تصور وتحديد مستويات جبرلين الخلوية باستخدام بيوسينسور nlsGPS1 وراثيا مرمزة في نبات هيبوكوتيلس وتلميحات الجذر.
Abstract
جبرلين فيتوهورموني (GA) هو جزيء إشارات صغيرة متنقلة، والذي يلعب دوراً رئيسيا في إنبات البذور، والاستطالة الخلوية، والتحولات التنموية في النباتات. جبرلين تصور الاستشعار 1 (GPS1) هو نقل الطاقة الرنين فورستر الأولى (الحنق)-على أساس بيوسينسور التي تتيح رصد مستويات GA الخلوية الحية في. بقياس نسبة انبعاثات fluorescence النووية المترجمة-GPS1 (nlsGPS1)، رسم الخرائط الزمانية المكانية التي تم توفيرها اندوجينوسلي ومناشئ GA التدرجات في أنواع مختلفة من الأنسجة الممكنة على المستوى خلوي. هذا البروتوكول سوف تصف كيفية صورة نسب الانبعاثات nlsGPS1 في ثلاث تجارب مثال: حالة ثابتة، قبل وبعد خارجية جبرلين A4 (GA4) العلاجات، وعلى مر وقت-دورة علاج. نحن نقدم أيضا أساليب تحليل نسب الانبعاثات nlsGPS1 باستخدام كل من فيجي وبرمجيات تجارية صورة مجهرية (ثلاثي الأبعاد) ثلاثية الأبعاد تصور وتحليل وشرح القيود والمزالق المحتملة لاستخدام nlsGPS1 لقياس مستويات جبرلين.
Introduction
الهرمونات النباتية تلعب دوراً أساسيا في نمو النبات والتنمية. وتخضع هذه الجزيئات الصغيرة، والمتنقلة إرسال الإشارات عادة على عدة مستويات، مثل تخليق الحيوي وتقويض والنقل القصيرة والطويلة distance1،2،،من34. وقد شحذ فهم مسارات إشارات هرمون والردود النسخي المصب على مر السنين. ومع ذلك، ربط الاستجابات الخلوية متنوعة من مسارات الإشارات هرمون مع المدخلات التنظيمية توجيه توزيعات هرمون، نطلب إجراء تقييم كمي الزمانية المكانية لمستويات الهرمونات على المستوى خلوي. الحنق على أجهزة استشعار العوامل البيولوجية التي يمكن أن تكشف عن فيتوهورمونيس يمكن النهوض بقدرة العلماء على تحديد مستويات الهرمونات على المستوى خلوي. أجهزة استشعار العوامل البيولوجية على أساس الحنق تتكون من زوج الحنق (المانحين ويقبلون البروتينات الفلورية) مرتبطة بمجال حسية التي تلزم يجند محددة أو يستجيب لحافز بيولوجية. لجزيء صغير أجهزة استشعار العوامل البيولوجية، مشغلات ملزم يجند conformational تغيير المجال الحسي الذي يؤدي إلى تغيير المسافة و/أو الاتجاه بين البروتينات الفلورية اثنين من زوج الحنق. يتم إنجاز إجراء تحليل راتيوميتريك من بيوسينسور الحنق مثيرة الجهة المانحة وقياس نسبة الانبعاثات fluorescence يقبلون على الجهات المانحة5،6. ملزم يجند قابلاً للاكتشاف كتغيير في هذه الانبعاثات نسبة7.
نحن مؤخرا بوضع biosensor المستندة إلى الحنق لهرمون مصنع “الغاز ga.” هي فئة من الهرمونات التي يمكن أن تروج لإنبات البذور، والاستطالة الخلوية، والتحول التنموي من الخضري إلى مراحل المزهرة. بيوسينسور nlsGPS1 النووية المترجمة ويوفر نظرة ثاقبة الزمانية المكانية ديناميات GA في الأنسجة النباتية المختلفة. في خلايا نبات ، يربط GA القابلة للذوبان المستقبلات، قزم جبرلين غير متحسسة (GID)، والمجمع يدفع تدهور ديلا البروتينات التي تعمل المنظمين السلبية للجمعية العامة يشير إلى2. المجال GA الحسية من nlsGPS1 يتكون من مستقبلات نبات GA (AtGID1C) التي ترتبط اقتطاع حمض 74 أمينية بروتين ديلا (أتجاي) وعزز زوج الحنق تتكون من متغيرات ثنائي من أزرق كنيون البروتين المانحة و أفروديت (فينوس تنوعاً كودون جماعي) ك بروتين فلوري يقبلون8. بيوسينسور nlsGPS1 جهاز استشعار عالية تقارب GA النشطة بيولوجيا4 (كد = 24 نانومتر للجمعية العامة4)، وأنها يمكن أن تستخدم في مختلف أنواع الأنسجة لتعيين وتحديد التدرجات GA. لتجنب سوء الفهم من نبات GA مستويات المجراة في، وقد وضعنا أيضا البديل nonresponsive من nlsGPS1 (nlsGPS1-NR) لاستخدامها كعنصر سلبي. يحمل البروتين nlsGPS1-NR الطفرات في جيب GA الملزمة التي تعطل الربط من الجمعية العامة والطفرات في البروتين ديلا التي تعطل التفاعل مع دائرة المخابرات العامة مستقبلات بروتينات7،9. يمكن اعتبار أنماط نسبة الانبعاثات أو التغيرات التي لوحظت في خطوط nlsGPS1 و nlsGPS1-NR المصنوعات اليدوية التي لا تتصل مباشرة بأحداث الجمعية العامة ملزمة. من المهم أيضا أن نلاحظ أن nlsGPS1 ملزمة للجمعية العامة4 لا يمكن عكسها سريعاً، وذلك، نسب الانبعاثات nlsGPS1 الخلوية ينبغي إلا يفسر يمثلون أعلى تركيز الأخيرة للجمعية العامة في نواة معينة بدلاً من الوقت الحقيقي مستويات مستقرة. نتيجة لذلك، تحليلاً لتراجع مستويات ألجأ غير ممكن مع nlsGPS1.
هنا نقدم بروتوكول مفصل للاستفادة من بيوسينسور nlsGPS1 في خلايا المصنع النموذجي نبات، باستخدام النهج القائم على تصوير [كنفوكل] في الاستبانة. ينص البروتوكول على المعلومات على جذور النباتات التصوير وهيبوكوتيلس في حالة ثابتة، وعلى مر الوقت-الدورات. يمكن أن تستخدم أجهزة الاستشعار nlsGPS1 يحتمل أن تكون في مختلف أنواع الأنسجة، وكذلك عبر الأنواع النباتية، لتعيين وتحديد توزيعات GA.
Protocol
Representative Results
Discussion
NlsGPS1 بيوسينسور GA المستندة إلى الحنق يوفر طريقة كمية للتقرير وقياس GA هرمون التدرجات في محطات متعددة الخلايا. أجهزة استشعار العوامل البيولوجية على أساس الحنق يمكن قياس ديناميات مع قرار الزمانية المكانية محسنة عبر الكشف المباشر الكتلي والقياس غير المباشر بالصحافيين النسخي أو إشارات البروتين-تدهور-المستندة إلى أساليب12، 13. يمكن أن يؤدي تصوير الخلوية ذات الدقة العالية في مختلف أنواع الأنسجة ثاقبة ذات معنى ألجأ البيولوجيا وشرارة فرضيات جديدة فيما يتعلق بتنظيم ودالة من تراكمات GA في سياق متعددة الخلايا. على سبيل المثال، رصد التغيرات في بيوسينسور nlsGPS1 في GA محددة السكروز، تقويضي، وطفرات النقل، وكذلك أثناء اضطرابات المستحث سباتيوتيمبورالي، يمكن أن تكون مفيدة للغاية لاختبار على وجه التحديد كيف يتم إنشاء التدرجات ألجأ في الجذر، والجذر عنوان الخلية الردود على التدرجات GA. يمكن استخدام أجهزة الاستشعار في الأنواع النموذجية والمحاصيل الأخرى لاختبار الحفاظ على الآليات التي تتحكم في عنصر التحكم بوساطة GA إنبات البذور، والاستطالة الخلوية، وازدهار.
الخطوات الحاسمة في تصوير المستندة إلى الحنق بيوسينسور nlsGPS1 هي أنه ينبغي عدم المشبعة 1) بكسل أثناء التحليل الكمي الحنق، معلمات 2) التصوير مثل “الكشف عن كسب” ينبغي أن تظل ثابتة لانبعاث المانحين (دكسدم) و يقبلون المشتريات من الانبعاثات (دكسام)، 3) ينبغي أن تستخدم خطوط nlsGPS1-NR التحكم ليستبعد المصنوعات اليدوية، و 4) ينبغي إعداد العينات للتقليل من الانجراف والقضايا المحورية التغيير. بالإضافة إلى ذلك، الظروف البيئية التي تزرع العينات مهمان للتحكم نظراً لمستويات GA حساسة للظروف البيئية مثل مدة الخفيفة وكثافة الضوء14،،من1516 ،17. القيد رئيسي لهذا النوع من التحليل أن نسبة الإشارة إلى الضوضاء عالية مطلوب للتصوير نظراً لزيادة الضجيج الكامنة في تصوير راتيوميتريك. وهكذا، تصوير nlsGPS1 لن يكون مفيداً للأنسجة والأعضاء التي ليست قابلة راتيوميتريك fluorescence مجهرية باستخدام البروتينات الفلورية السماوي والأصفر – الأنسجة العميقة وعلى سبيل المثال، حيث تم اكتشاف البروتينات الفلورية سيئة. من ناحية أخرى، قراءات راتيوميتريك غالباً ما يفضل على قراءات إينتينسيوميتريك، لأن عنصر تحكم داخلي مفيدة لاستبعاد الآثار الناجمة عن التغيرات في التعبير biosensor، والاستقرار، والسطوع، أو الكشف في خلية معينة، الأنسجة ، أو الشرط. على سبيل المثال، تآكل تصوير biosensor وتحليلات الصورة قد استخدمت أيضا لدراسة مجموعة متنوعة من يغاندس في مجموعة متنوعة من الأنسجة5،،من618،،من1920،. تجارب التصوير وتحليلات الصورة التي ذكرت هنا يمكن تعديلها لتناسب أساليب التصوير الجديدة، مثل الفحص المجهري الورقة الخفيفة، التي يمكن أن تسفر عن رؤى جديدة في، على سبيل المثال، أعمق جذور الأنسجة-أنواع.
بيوسينسور nlsGPS1 من الجيل الأول من جهاز استشعار عالية تقارب يوفر خريطة عالية الدقة للتدرجات GA التي يمكن أيضا تقريرا عن الزيادات داخل الخلايا في الجمعية العامة عقب خارجية GA العلاجات. واحد أوجه القصور الحالية في nlsGPS1 هو أن أجهزة الاستشعار لا يمكن عكسها سريعاً، وهكذا، تقارير ليس على مستويات مستقرة GA، لكن من المحتمل على تركيز GA الأخيرة الحد الأقصى في الحل من الفائدة. معدل الدوران الدقيق للاستشعار أيضا غير معروف وهذا، جنبا إلى جنب مع إمكانية الرجوع منخفضة، يحول دون الكشف عن عمليات الاستنفاد GA الذاتية التي يمكن أن يحدث خلال دقائق إلى بضع ساعات في بعض أنواع الأنسجة. من المهم أيضا أن نلاحظ أن nlsGPS1 لها صلة عالية للجمعية العامة4 (كد = 24 نانومتر) مقارنة بسائر أشكال ألجأ (GA3 كد= 240 نانومتر، GA1كد = 110 نيوتن متر) عند التصوير الأخرى الغاز النشطة بيولوجيا 7-يمكن هندستها أجيال المستقبل من أجهزة استشعار العوامل البيولوجية ألجأ إلى زيادة إمكانية الرجوع مع الحفاظ على النسب العالية أو يحمل خصائص مختلفة لمختلف السلائف، النشطة بيولوجيا، أو كاتابوليتي غاز.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل قد تلقت تمويلاً من مجلس البحوث الأوروبي (المنسق) ضمن أفق 2020 البحث والابتكار في البرنامج الاتحاد الأوروبي في (منحة اتفاق n ° 759282).
Materials
| nlsGPS1 Col0 Arabidopsis seeds | NASC | N2107734 | |
| nlsGPS-NR Col0 Arabidopsis seeds | NASC | N2107735 | |
| Gibberellin A4 (GA4) | Sigma | G7276 | dissolve in EtH70 % , and keep at -20°C |
| sodium hypochlorite solution (Bleach) | Fisher S/5040 | HSRA 064 | |
| Hydrogen cloride HCl | Sigma | 31434 | |
| Micropore tape | 3M | 1530-1 | |
| ibidi sticky-slide | Ibidi | 81128 | Luer 0.1 for root imaging |
| ibidi sticky-slide | Ibidi | 80168 | Luer 0.2 for hypocotyl imaging |
| glass coverslip for sticky slides | Ibidi | 10812 | |
| Elbow Luer Connectors | Ibidi | 10802 | |
| silicone tubing | Ibidi | 108401 | |
| Luer Lock Connector | Ibidi | 10826 | |
| programmable syringe pump | World Precision Instruments | AL-1000 | |
| Vacuum grease | Sigma | 18405 | |
| Murashige and Skoog Basal Salts | Duchefa | M0221 | |
| Agar plant, 1kg | Melford | P1001 | |
| Microscope slide ground edges, 76mm x 26mm, 1.0mm to 1.2mm thick | Fisher Scientific | 12383118 | |
| Cover slip No.1 1/2 glass 22mm x 22mm | Fisher Scientific | 12363138 | |
| Luer-slip Syringe 2o ml | Fisher Scientific | 10785126 | |
| 3M Micropor Surgical Paper Tape | Fisher Scientific | 12787597 | |
| Potassium Hydroxide, 500g | Sigma Aldrich | 221473-500G-D | |
| Absolute Ethanol | Fisher Scientific | 10428671 | |
| Forceps Watchmaker 5 StSteel | Scientific Laboratory Supplies | INS4340 | |
| Scissors, 125mm, stainless steel | Fisher Scientific | 12338099 | |
| Fitting reducer 0.5 to 1.6 | Ibidi | 10829 | |
| Leica SP8 | Confocal laser microscope 1 | ||
| Zeiss LSM 780 | Confocal laser microscope 2 | ||
| Imaris | Bitplane | 3D visualization and Analysis software | |
| Fiji | image analysis software | ||
| OriginPro | Origin Lab | Statistical Analysis Software |
References
- Binenbaum, J., Weinstain, R., Shani, E. Gibberellin Localization and Transport in Plants. Trends in Plant Science. 23 (5), 410-421 (2018).
- Sun, T. Gibberellin Metabolism, Perception and Signaling Pathways in Arabidopsis. The Arabidopsis Book. 6, 0103 (2008).
- Rieu, I., et al. Genetic Analysis Reveals That C19-GA 2-Oxidation Is a Major Gibberellin Inactivation Pathway in Arabidopsis. The Plant Cell Online. 20 (9), 2420-2436 (2008).
- Regnault, T., et al. The gibberellin precursor GA12 acts as a long-distance growth signal in Arabidopsis. Nature Plants. 1, 15073 (2015).
- Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. Quantitative Imaging with Fluorescent Biosensors. Annual Review of Plant Biology. 63 (1), 663-706 (2012).
- Walia, A., Waadt, R., Jones, A. M. Genetically Encoded Biosensors in Plants: Pathways to Discovery. Annual Review of Plant Biology. 69 (1), 497-524 (2018).
- Rizza, A., Walia, A., Lanquar, V., Frommer, W. B., Jones, A. M. In vivo gibberellin gradients visualized in rapidly elongating tissues. Nature Plants. 3 (10), 803-813 (2017).
- Rizzo, M. A., Springer, G., Segawa, K., Zipfel, W. R., Piston, D. W. Optimization of pairings and detection conditions for measurement of FRET between cyan and yellow fluorescent proteins. Microscopy and Microanalysis. 12 (3), 238-254 (2006).
- Ueguchi-Tanaka, M., et al. GIBBERELLIN INSENSITIVE DWARF1 encodes a soluble receptor for gibberellin. Nature. 437, 693-698 (2005).
- Grossmann, G., et al. Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip. Journal of Visualized Experiments. (65), 34290 (2012).
- Grossmann, G., et al. The RootChip: an integrated microfluidic chip for plant science. Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).
- Brunoud, G., et al. A novel sensor to map auxin response and distribution at high spatio-temporal resolution. Nature. 482, 103-106 (2012).
- Wang, N. N., Shin, M. C., Li, N. The GUS reporter-aided analysis of the promoter activities of Arabidopsis ACC synthase genes AtACS4, AtACS5, and AtACS7 induced by hormones and stresses. Journal of Experimental Botany. 56 (413), 909-920 (2005).
- Alabadi, D. Gibberellins Repress Photomorphogenesis in Darkness. Plant Physiology. 134 (3), 1050-1057 (2004).
- De Lucas, M., et al. A molecular framework for light and gibberellin control of cell elongation. Nature. 451 (7177), 480-484 (2008).
- Strasser, B., Sanchez-Lamas, M., Yanovsky, M. J., Casal, J. J., Cerdan, P. D. Arabidopsis thaliana life without phytochromes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (10), 4776-4781 (2010).
- Feng, S., et al. Coordinated regulation of Arabidopsis thaliana development by light and gibberellins. Nature. 451, 475-479 (2008).
- Choi, W. G., Swanson, S. J., Gilroy, S. High-resolution imaging of Ca2+, redox status, ROS and pH using GFP biosensors. Plant Journal. 70 (1), 118-128 (2012).
- Lanquar, V., et al. Dynamic imaging of cytosolic zinc in Arabidopsis roots combining FRET sensors and RootChip technology. New Phytologist. 202 (1), 198-208 (2014).
- Krebs, M., Schumacher, K. Live cell imaging of cytoplasmic and nuclear Ca2+ dynamics in Arabidopsis roots. Cold Spring Harbor. 2013 (8), 776-780 (2013).
