ג'יברלין הסלולר להמחיש רמות שימוש באנרגיה תהודה פורסטר NlsGPS1 העברה (סריג) ביוסנסור
Summary
ג’יברלין תפיסה חיישן 1 (GPS1) הוא הראשון פורסטר תהודה אנרגיה מבוססת על העברת החיישן למדידת רמות הסלולר של ג’יברלין phytohormones עם רזולוציה גבוהה ייתכן. פרוטוקול זה מדווח על השיטה כדי להמחיש ולכמת רמות ג’יברלין הסלולר באמצעות את החיישן nlsGPS1 גנטית מקודד ב hypocotyls תודרנית וטיפים שורש.
Abstract
ג’יברלין phytohormone (ג’י אי) הוא מולקולה איתות קטן, נייד זה ממלא תפקיד מפתח נביטת הזרעים, התארכות הסלולר ומעברים התפתחותית בצמחים. ג’יברלין תפיסה חיישן 1 (GPS1) הוא הראשון פורסטר תהודה אנרגיה ההעברה (סריג)-מבוסס ביוסנסור המאפשר ניטור של רמות GA הסלולר ויוו. על ידי מדידת פליטת קרינה פלואורסצנטית יחס של גרעיני מקומי-GPS1 (nlsGPS1), ייתכן מיפוי של מעברי צבע endogenously, exogenously שסופקו GA בסוגי רקמות שונות הוא ריאלי בקנה מידה הסלולר. פרוטוקול זה יתאר כיצד תמונה nlsGPS1 יחסי פליטה בניסויים דוגמה 3: מצב יציב, לפני ואחרי אקסוגני ג’יברלין א4 (GA4) טיפולי, ושוב פעם-קורס טיפול. כמו כן, אנו מספקים שיטות לנתח יחסי פליטה nlsGPS1 באמצעות תוכנת הדמיה וניתוח micrograph (תלת-ממדי) תלת ממדי מסחרי והן פיג’י ולהסביר את המגבלות ואת החסרונות סביר של שימוש nlsGPS1 כדי לכמת את רמות ג’יברלין.
Introduction
הורמונים צמחיים תפקיד מהותי צימוח ופיתוח. אלו מולקולות איתות קטן, נייד מוסדרים בדרך כלל במספר רמות, כגון ביוסינטזה, קטבוליזם distance קצר וארוך תחבורה1,2,3,4. ההבנה של הורמון איתות המסלולים ותגובות תעתיק במורד הזרם חידדה לאורך השנים. עם זאת, כדי לקשר את התגובות הסלולר מגוונות של המסלולים איתות הורמון עם הקלט רגולטוריות בימוי הורמון הפצות, אנחנו דורשים כימות ייתכן של רמות ההורמונים בקנה מידה הסלולר. ביולוגיים מבוסס סריג שיכול לזהות phytohormones יכול לקדם את היכולת המדענים לכמת את רמת ההורמונים בקנה מידה הסלולר. מבוסס סריג ביולוגיים מורכבים של זוג קשת/קשתית (התורם ואת מקבל פלורסנט חלבונים) קשורים לתחום החישה נקשר ליגנד מסוים או מגיב לגירוי ביולוגי. עבור מולקולה קטנה ביולוגיים, איגוד ליגנד מפעיל לשינוי הסתגלותי של התחום החושי המביא שינוי מרחק ו/או התמצאות בין שני סוגי החלבונים פלורסנט של זוג סריג. ניתוח רציומטרי של ביוסנסור סריג מושגת על ידי מדידת פליטת קרינה פלואורסצנטית יחס מקבל מעל5,תורם6ומרגש התורם. ליגנד איגוד הוא לזיהוי בשינוי היחס הזה פליטה7.
לאחרונה פיתחנו ביוסנסור מבוסס סריג של ההורמון צמח גז GA. הם קבוצה של הורמונים זה יכול לקדם את נביטת הזרעים, התארכות הסלולר ואת המעבר התפתחותית של צמח פורח שלבים. החיישן nlsGPS1 הוא הגרעין לשפות אחרות, מספק תובנות ייתכן GA dynamics ברקמות הצמח מגוונות. תודרנית תאים, GA נקשר לקולטנים מסיסים, גמד ג’יברלין-רגישות (GID), ומשרה המתחם ההשפלה של חלבונים דלה לשמש הרגולטורים שלילי של GA איתות2. התחום החושי GA של nlsGPS1 מורכב של הקולטן תודרנית GA (AtGID1C) קשורה לחיתוך חומצה אמינו 74 של חלבון דלה (AtGAI), זוג סריג המורכב משופרות dimerization וריאציות של Cerulean כמו החלבון הניאון תורם, אפרודיטה (המגוון codon ונוס) כמו חלבון פלואורסצנטי מקבל8. החיישן nlsGPS1 הוא חיישן זיקה גבוהה עבור GA ביואקטיביות4 (Kd = 24 nM עבור GA4), זה יכול להיות מנוצל בסוגים מגוונים רקמות-כדי למפות ולכמת GA מעברי צבע. כדי להימנע פירוש מוטעה של רמות תודרנית GA ויוו, פיתחנו גם משתנה מצבו של nlsGPS1 (nlsGPS1-NR) להשתמש כפקד שלילי. החלבון nlsGPS1-NR נושא מוטציות בכיס GA מחייב כי לשבש את הכריכה של GA, מוטציות החלבון דלה לשבש את האינטראקציה עם GID קולטן חלבוני7,9. תבניות פליטת יחס או השינויים בקווים הן nlsGPS1 והן nlsGPS1-NR יכול להיחשב חפצים הקשורים ישירות לא מחייב GA אירועים. חשוב גם לציין כי איגוד nlsGPS1 GA4 הוא בלתי הפיך במהירות, לכן, יש לפרש nlsGPS1 הסלולר פליטה יחסי כמייצג את הריכוז האחרונות הגבוהה של GA גרעין נתון יותר מאשר את בזמן אמת רמות מצב יציב. כתוצאה מכך, ניתוח של רמות GA נופלים אינה אפשרית עם nlsGPS1.
כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט של ביוסנסור nlsGPS1 בתאים של הצמח דגם תודרנית, שימוש בגישות קונאפוקלית מבוססת הדמיה ברזולוציה ניצול. הפרוטוקול מספקת מידע על שורשי צמחים הדמיה ו- hypocotyls-מצב יציב וגם לאורך זמן-קורסים. באופן פוטנציאלי יכול להיות מנוצל החיישן nlsGPS1 סוגי רקמות מגוונות, כמו גם בכל מיני צמחים, כדי למפות ולכמת הפצות GA.
Protocol
Representative Results
Discussion
NlsGPS1 ביוסנסור GA מבוסס סריג מספק שיטה כמותית כדי לדווח ולמדוד את מעברי צבע הורמון GA multicellular צמחים. מבוסס סריג ביולוגיים יכולים לכמת דינאמיקה של פתרון ייתכן משופרת על זיהוי ישיר באמצעות ספקטרומטר מסה ומדידה עקיף על-ידי כתבים תעתיק או איתות חלבון-השפלה-המבוסס על שיטות12, 13. דימות ברזולוציה סלולר רקמות מגוונות-סוגי יכולות להניב תובנות משמעותיות GA ביולוגיה, ניצוץ חדש וההשערות לגבי תקנה והתפקוד של GA הצטברויות בהקשר multicellular. לדוגמה, מעקב אחר שינויים החיישן nlsGPS1 GA ספציפי biosynthetic הוחלף נגזר, קטבולי, תחבורה מוטציות, וכן במהלך spatiotemporally המושרה לפליטת, יכול להיות מאוד אינפורמטיבי כדי לבדוק באופן ספציפי איך GA מעברי צבע הוקם בשנת שורש ושורש כתובת התא התגובות GA מעברי צבע. החיישן יכול לשמש מינים אחרים מודל, חיתוך כדי לבדוק את השימור של מנגנוני בקרה הפקד בתיווך GA של נביטת הזרעים, התארכות הסלולר פורח.
בשלבים קריטיים דימות מבוסס סריג של החיישן nlsGPS1 הם, לא צריך להיות רווי 1) את הפיקסלים במהלך ניתוח כמותי של סריג, הדמיה 2) פרמטרים כגון “גלאי רווח” צריך להישמר קבועה עבור התורם הפליטה (DxDm), מקבל פליטה (DxAm) רכישות, 3) בקרת nlsGPS1-NR קווי אמור לשמש כדי לשלול את חפצי אמנות ו- 4) דוגמאות צריך להיות מוכן כדי למזער את הסחף ובעיות מוקד-שינוי. בנוסף, לתנאי הסביבה בה גדלים דוגמאות חשובות לשלוט מאז רמות GA רגישים תנאים סביבתיים כגון משך אור ועוצמת האור14,15,16 ,17. מגבלה מפתח של סוג זה של ניתוח הוא יחס אות לרעש גבוה הוא נדרש עבור הדמיה לנוכח העלייה רעש הטמונה רציומטרי הדמיה. לפיכך, nlsGPS1 הדמיה לא יהיה שימושי בשביל לרקמות ואיברים לא נתונות רציומטרי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ באמצעות חלבונים פלורסנט ציאן וצהוב — לדוגמה, לרקמות העמוקות איפה פלורסנט חלבונים מזוהים בצורה גרועה. מצד שני, רציומטרי המפרט עדיפות לעיתים קרובות על קריאות intensiometric, כי פקד פנימי הוא מועיל כדי לשלול חפצי הנובעים משינויים ביוסנסור ביטוי, יציבות, בהירות או detectability בתא נתון, רקמה , או תנאי. לדוגמה, תדאג ביוסנסור הדמיה, ניתוח התמונה גם שימשו ללמוד מגוון רחב של ליגנדים במגוון רקמות5,6,18,19,20,. ניסויים הדמיה וניתוחים התמונה דיווחו כאן יכול להיות שונה כדי להתאים את שיטות הדמיה חדשות, כגון מיקרוסקופ אור גיליון, אשר יכולה להניב תובנות הרומן בסוגי, לדוגמה, עמוק שורש רקמות.
החיישן nlsGPS1 דור ראשון הוא חיישן גבוהה-זיקה מספקת מפה ברזולוציה גבוהה של מעברי צבע GA גם ידווח על עליות תאיים GA בעקבות טיפולים GA אקסוגני. אחת המגבלות הנוכחי של nlsGPS1 היא כי החיישן הוא בלתי הפיך במהירות, לכן, דוחות לא על מצב יציב GA רמות אלא, סביר, על מרבי האחרונות GA הריכוז בפתרון של ריבית. שיעור תחלופה מדויק עבור החיישן הוא גם לא ידוע, זה, בשילוב עם הפיכות נמוך, מונע זיהוי של אנדוגני depletions GA זה קורה בטווח דקות עד כמה שעות בסוגים מסוימים רקמות. חשוב גם לציין כי nlsGPS1 יש זיקה גבוהה עבור GA4 (Kd = 24 ננומטר) בהשוואה לצורות אחרות GA (GA3 Kd= 240 nM, GA1Kd = 110 ננומטר) כאשר הדמיה אחרים ביו גז 7. ניתן לתכנן עתיד דורות של GA ביולוגיים להגדיל הפיכות תוך שמירה על זיקה גבוהה או להפגין specificities שונים של קודמן, ביו, שונים או catabolite גז.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו קיבלה מימון מן האירופית מחקר המועצה (ERC) תחת של האיחוד האירופי אופק 2020 מחקר וחדשנות התוכנית (גרנט הסכם n ° 759282).
Materials
| nlsGPS1 Col0 Arabidopsis seeds | NASC | N2107734 | |
| nlsGPS-NR Col0 Arabidopsis seeds | NASC | N2107735 | |
| Gibberellin A4 (GA4) | Sigma | G7276 | dissolve in EtH70 % , and keep at -20°C |
| sodium hypochlorite solution (Bleach) | Fisher S/5040 | HSRA 064 | |
| Hydrogen cloride HCl | Sigma | 31434 | |
| Micropore tape | 3M | 1530-1 | |
| ibidi sticky-slide | Ibidi | 81128 | Luer 0.1 for root imaging |
| ibidi sticky-slide | Ibidi | 80168 | Luer 0.2 for hypocotyl imaging |
| glass coverslip for sticky slides | Ibidi | 10812 | |
| Elbow Luer Connectors | Ibidi | 10802 | |
| silicone tubing | Ibidi | 108401 | |
| Luer Lock Connector | Ibidi | 10826 | |
| programmable syringe pump | World Precision Instruments | AL-1000 | |
| Vacuum grease | Sigma | 18405 | |
| Murashige and Skoog Basal Salts | Duchefa | M0221 | |
| Agar plant, 1kg | Melford | P1001 | |
| Microscope slide ground edges, 76mm x 26mm, 1.0mm to 1.2mm thick | Fisher Scientific | 12383118 | |
| Cover slip No.1 1/2 glass 22mm x 22mm | Fisher Scientific | 12363138 | |
| Luer-slip Syringe 2o ml | Fisher Scientific | 10785126 | |
| 3M Micropor Surgical Paper Tape | Fisher Scientific | 12787597 | |
| Potassium Hydroxide, 500g | Sigma Aldrich | 221473-500G-D | |
| Absolute Ethanol | Fisher Scientific | 10428671 | |
| Forceps Watchmaker 5 StSteel | Scientific Laboratory Supplies | INS4340 | |
| Scissors, 125mm, stainless steel | Fisher Scientific | 12338099 | |
| Fitting reducer 0.5 to 1.6 | Ibidi | 10829 | |
| Leica SP8 | Confocal laser microscope 1 | ||
| Zeiss LSM 780 | Confocal laser microscope 2 | ||
| Imaris | Bitplane | 3D visualization and Analysis software | |
| Fiji | image analysis software | ||
| OriginPro | Origin Lab | Statistical Analysis Software |
References
- Binenbaum, J., Weinstain, R., Shani, E. Gibberellin Localization and Transport in Plants. Trends in Plant Science. 23 (5), 410-421 (2018).
- Sun, T. Gibberellin Metabolism, Perception and Signaling Pathways in Arabidopsis. The Arabidopsis Book. 6, 0103 (2008).
- Rieu, I., et al. Genetic Analysis Reveals That C19-GA 2-Oxidation Is a Major Gibberellin Inactivation Pathway in Arabidopsis. The Plant Cell Online. 20 (9), 2420-2436 (2008).
- Regnault, T., et al. The gibberellin precursor GA12 acts as a long-distance growth signal in Arabidopsis. Nature Plants. 1, 15073 (2015).
- Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. Quantitative Imaging with Fluorescent Biosensors. Annual Review of Plant Biology. 63 (1), 663-706 (2012).
- Walia, A., Waadt, R., Jones, A. M. Genetically Encoded Biosensors in Plants: Pathways to Discovery. Annual Review of Plant Biology. 69 (1), 497-524 (2018).
- Rizza, A., Walia, A., Lanquar, V., Frommer, W. B., Jones, A. M. In vivo gibberellin gradients visualized in rapidly elongating tissues. Nature Plants. 3 (10), 803-813 (2017).
- Rizzo, M. A., Springer, G., Segawa, K., Zipfel, W. R., Piston, D. W. Optimization of pairings and detection conditions for measurement of FRET between cyan and yellow fluorescent proteins. Microscopy and Microanalysis. 12 (3), 238-254 (2006).
- Ueguchi-Tanaka, M., et al. GIBBERELLIN INSENSITIVE DWARF1 encodes a soluble receptor for gibberellin. Nature. 437, 693-698 (2005).
- Grossmann, G., et al. Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip. Journal of Visualized Experiments. (65), 34290 (2012).
- Grossmann, G., et al. The RootChip: an integrated microfluidic chip for plant science. Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).
- Brunoud, G., et al. A novel sensor to map auxin response and distribution at high spatio-temporal resolution. Nature. 482, 103-106 (2012).
- Wang, N. N., Shin, M. C., Li, N. The GUS reporter-aided analysis of the promoter activities of Arabidopsis ACC synthase genes AtACS4, AtACS5, and AtACS7 induced by hormones and stresses. Journal of Experimental Botany. 56 (413), 909-920 (2005).
- Alabadi, D. Gibberellins Repress Photomorphogenesis in Darkness. Plant Physiology. 134 (3), 1050-1057 (2004).
- De Lucas, M., et al. A molecular framework for light and gibberellin control of cell elongation. Nature. 451 (7177), 480-484 (2008).
- Strasser, B., Sanchez-Lamas, M., Yanovsky, M. J., Casal, J. J., Cerdan, P. D. Arabidopsis thaliana life without phytochromes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (10), 4776-4781 (2010).
- Feng, S., et al. Coordinated regulation of Arabidopsis thaliana development by light and gibberellins. Nature. 451, 475-479 (2008).
- Choi, W. G., Swanson, S. J., Gilroy, S. High-resolution imaging of Ca2+, redox status, ROS and pH using GFP biosensors. Plant Journal. 70 (1), 118-128 (2012).
- Lanquar, V., et al. Dynamic imaging of cytosolic zinc in Arabidopsis roots combining FRET sensors and RootChip technology. New Phytologist. 202 (1), 198-208 (2014).
- Krebs, M., Schumacher, K. Live cell imaging of cytoplasmic and nuclear Ca2+ dynamics in Arabidopsis roots. Cold Spring Harbor. 2013 (8), 776-780 (2013).
