Diferenciación de células madre de nervio por un solo Plasma atmosférico frío tratamiento In Vitro
Summary
Este protocolo tiene como objetivo proporcionar pasos experimentales detallados de un tratamiento de plasma atmosférico frío sobre las células madre neurales y detección de inmunofluorescencia para la mejora de la diferenciación.
Abstract
Como el desarrollo de la tecnología de plasma físico, frío atmosféricos plasmas (CAPs) han sido ampliamente investigados en descontaminación, tratamiento contra el cáncer, la cicatrización de heridas, tratamiento de conducto, etc., formando un nuevo campo de investigación llamado medicina del plasma. Siendo una mezcla de especies reactivas eléctricas, químicas y biológicas, casquillos han demostrado sus habilidades para mejorar la diferenciación de las células madre de nervio tanto en vitro y en vivo y se está convirtiendo en un camino prometedor para el tratamiento de la enfermedad neurológica en el futuro. La noticia más emocionante es que usando tapas de puede realizar un solo paso y dirigido con seguridad, diferenciación de las células madre neurales (NSC) para el transporte de tejido. Aquí demostramos el protocolo experimental detallado usando un dispositivo de tapa jet hecho a sí mismo para mejorar la diferenciación de la NSC en C17.2 NSCs y las células madre neurales primarios de rata, así como el destino de la célula por invertida y microscopía de fluorescencia. Con la ayuda de la inmunofluorescencia que manchaba la tecnología, encontramos tanto las NSCs mostró un ritmo acelerado de la diferencia que el grupo no tratado, y ~ 75% de las NSCs selectivamente diferenciado en neuronas, que son principalmente maduros, colinérgicos y motor neuronas.
Introduction
La diferenciación dirigida de NSC en un cierto linaje para el transporte de tejido es considerada uno de los más prometedores tratamientos para enfermedades de neurodegenerative y neurotraumatic1. Por ejemplo, las neuronas dopaminérgicas catecolaminérgica se desean especialmente en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson (EP). Sin embargo, los métodos tradicionales para preparar las células deseadas para el transporte tienen muchos inconvenientes, tales como toxicidad química, formación de la cicatriz u otros, que dificulta en gran medida las aplicaciones de NSCs en medicina regenerativa2. Por lo tanto, es muy necesario encontrar una manera novedosa y segura para la diferenciación de la NSC.
El plasma es el cuarto estado de materia, siguiente sólido, líquido y gas, y constituye más del 95% de casos en todo el universo. Plasma es eléctricamente hilo neutro positivos o negativos y partículas neutras y normalmente es generado por una descarga de alto voltaje en el laboratorio. En las últimas dos décadas, la aplicación de plasma en biomedicina ha atraído gran atención en todo el mundo como el desarrollo de la tecnología de plasma frío la presión atmosférica. Gracias a esta técnica, plasma de baja temperatura estable se puede generar en el aire en la atmósfera sin la formación de arco y consta de diversas especies reactivas, tales como las especies reactivas del nitrógeno (RNS), especies reactivas del oxígeno (ROS), ULTRAVIOLETA (UV) radiación, electrones, iones y campo eléctrico3. Tapas tienen ventajas únicas para la inactivación de microorganismos, terapia del cáncer, de heridas, tratamiento de enfermedades de la piel, la proliferación celular y diferenciación celular4,5,6,7. En trabajos previos, hemos demostrado que chorro de plasma atmosférico frío puede mejorar la diferenciación de NSCs en células neuronales murinas C17.2 (C17.2-NSC) y las células madre neurales primarios de rata, exhibiendo un gran potencial para convertirse en una poderosa herramienta para la dirección diferenciación de NSCs8. Aunque el mecanismo de mejora de la tapa de la diferenciación del NSC no se entiende completamente sin embargo, NO generado por los casquillos ha demostrado para ser un factor clave en el proceso. En este trabajo, nuestro objetivo es proporcionar un protocolo experimental detallado del uso de un plasma de helio/oxígeno de presión atmosférica jet para el tratamiento de NSCs en vitro, preparación de la célula y tratamiento previo, observación de morfología por microscopio invertido, y observación de la microscopia de fluorescencia de la tinción de inmunofluorescencia.
Protocol
Representative Results
Discussion
C17.2-NSC es una especie de línea de células neuronales inmortalizadas de células de la capa granular cerebelosa de ratón neonatal, desarrollado por Snyder y otros10,11. C17.2-NSC puede diferenciarse en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos y es ampliamente utilizado en Neurociencia12. En nuestro estudio anterior, tapas podrían mejorar la diferenciación de NSCs C17.2 en neuronas. Un estudio de prueba de principio también llevó a …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el programa Huazhong, el fondo de innovación independiente de la Universidad Huazhong de ciencia y tecnología (Nº 2018KFYYXJJ071) y la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (núms. 31501099 y 51707012).
Materials
| Coverslip | NEST | 801008 | |
| Poly-D-lysine | Beyotime | P0128 | |
| DMEM medium | HyClone | SH30022.01B | stored at 4 °C |
| DMEM/F12 medium | HyClone | SH30023.01B | stored at 4 °C |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | stored at -20 °C and protect from light |
| B27 supplement | Gibco | 17504044 | stored at -20 °C and protect from light |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30084.03 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Donor Horse serum | HyClone | SH30074.03 | tored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Penicillin/Streptomycin | HyClone | SV30010 | stored at 4 °C |
| Trypsin | HyClone | 25300054 | stored at 4 °C |
| PBS solution | HyClone | SH30256.01B | stored at 4 °C |
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0098 | stored at -20 °C |
| TritonX-100 | Sigma | T8787 | |
| Normal Goat Serum Blocking Solution | Vector Laboratories | S-1000-20 | stored at 4 °C |
| anti-Nestin | Beyotime | AF2215 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| anti-β-Tubulin III | Sigma Aldrich | T2200 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| anti-O4 | R&D Systems | MAB1326 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| anti-NF200 | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-ChAT | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti- LHX3 | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-GABA | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-Serotonin | Abcam, Cambridge, MA | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-TH | Abcam, Cambridge, MA | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| Immunol Staining Primary Antibody Dilution Buffer | Beyotime | P0103 | stored at 4 °C |
| Cy3 Labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0516 | stored at -20 °C and protect from light |
| Alexa Fluor 488- Labeled Goat | Beyotime | A0428 | stored at -20 °C and protect from light |
| Anti-Mouse IgG | |||
| 12-well plate | corning | 3512 | |
| 25 cm2 flask | corning | 430639 | |
| Hoechst 33258 | Beyotime | C1018 | stored at -20 °C and protect from light |
| Mounting medium | Beyotime | P0128 | stored at -20 °C and protect from light |
| Light microscope | Nanjing Jiangnan Novel Optics Company | XD-202 | |
| Fluorescence microscopy | Nikon | 80i | |
| High – voltage Power Amplifier | Directed Energy | PVX-4110 | |
| DC power supply | Spellman | SL1200 | |
| Function Generator | Aligent | 33521A | |
| Oscilloscope | Tektronix | DPO3034 | |
| High voltage probe | Tektronix | P6015A |
References
- Temple, S. The development of neural stem cells. Nature. 414 (6859), 112-117 (2001).
- Rossi, F., Cattaneo, E. Neural stem cell therapy for neurological diseases: dreams and reality. Nature Reviews Neuroscience. 3 (5), 401-409 (2002).
- Graves, D. B. The emerging role of reactive oxygen and nitrogen species in redox biology and some implications for plasma applications to medicine and biology. Journal of Physics D: Applied Physics. 45 (26), 263001 (2012).
- Weltmann, K. D., von Woedtke, T. Plasma medicine-current state of research and medical application. Plasma Physics and Controlled Fusion. 59 (1), 014031 (2017).
- Lloyd, G., et al. Gas Plasma: Medical Uses and Developments in Wound Care. Plasma Processes and Polymers. 7 (3-4), 194-211 (2010).
- Yousfi, M., Merbahi, N., Pathak, A., Eichwald, O. Low-temperature plasmas at atmospheric pressure: toward new pharmaceutical treatments in medicine. Fundamental & Clinical Pharmacology. 28 (2), 123-135 (2014).
- Xiong, Z., Roe, J., Grammer, T. C., Graves, D. B. Plasma Treatment of Onychomycosis. Plasma Processes and Polymers. 13 (6), 588-597 (2016).
- Xiong, Z., et al. Selective neuronal differentiation of neural stem cells induced by nanosecond microplasma agitation. Stem Cell Research. 12 (2), 387-399 (2014).
- Xie, Z., Zheng, Q., Guo, X., Yi, C., Wu, Y. Isolation, Culture and Identification of Neural Stem Cells in New-born Rats. Journal of Huazhong University of Science and Technology. [Med Sci]. 23 (2), 75-78 (2003).
- Ryder, E. F., Snyder, E. Y., Cepko, C. L. Establishment and characterization of multipotent neural cell lines using retrovirus vector-mediated oncogene transfer. Journal of Neurobiology. 21 (2), 356-375 (1990).
- Snyder, E. Y., Taylor, R. M., Wolfe, J. H. Neural progenitor cell engraftment corrects lysosomal storage throughout the MRS VII mouse brain. Nature. 374 (6520), 367-370 (1995).
- Snyder, E. Y., Yoon, C., Flax, J. D., Macklis, J. D. Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (21), 11663-11668 (1997).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Cell Fixatives for Immunostaining. Methods in Molecular Biology. 588, 55-61 (2010).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of Cell Membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
