בידול תאי עצב באמצעות צעד אחד קר פלזמה אטמוספרי טיפול במבחנה
Summary
פרוטוקול זה שואפת לספק שלבים מפורטים ניסיוני של טיפול פלזמה אטמוספרי קר על תאי גזע עצביים וזיהוי immunofluorescence עבור שיפור בידול.
Abstract
כמו התפתחות הטכנולוגיה פלזמה הפיזי, פלזמות אטמוספרי קר (כמוסות) נחקרו באופן נרחב בטיהור, טיפול בסרטן, ריפוי פצעים, טיפול שורש, וכו ‘, יוצרים שדה מחקר חדש בשם פלזמה רפואה. להיות תערובת של מינים תגובתי חשמלית, כימית וביולוגית, כמוסות הראו את היכולות שלהם כדי לשפר עצב תאי גזע בידול בשני במבחנה והופך ויוו ואינם ניתנים דרך מבטיחה לטיפול מחלה נוירולוגית בעתיד. בחדשות הרבה יותר מרגשת היא באמצעות כמוסות עשויים להבין בשלב אחד, בבטחה ביים, התמיינות של תאי גזע עצביים (NSCs) בשביל לרקמות תחבורה. נדגים כאן הפרוטוקול ניסיוני מפורט של שימוש בהתקן שווי מטוס מתוצרת עצמית לשיפור לבטחון לאומי בידול C17.2-NSCs, תאי גזע עצביים החולדה הראשית, וכן התבוננות גורל התא על ידי הפוכה של קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. עם העזרה של immunofluorescence מכתים טכנולוגיה, מצאנו שני NSCs את הראה שיעור דיפרנציאלית מואצת יותר בקבוצה ללא טיפול, ~ 75% NSCs מובחן באופן סלקטיבי נוירונים, אשר הינם בעיקר בוגרים, שימוש, מנוע נוירונים.
Introduction
הבידול בבימויו של NSCs לתוך שושלת מסוימים לתחבורה רקמות נחשב של טיפולים המבטיחים ביותר עבור מחלות ניווניות, neurotraumatic1. לדוגמה, נוירונים דופאמין catecholaminergic הם בעיקר הרצוי לטיפול מחלת פרקינסון (PD). עם זאת, שיטות מסורתיות כדי להכין את התאים הרצויים עבור תחבורה יש חסרונות רבים, כגון כמות רעילה, היווצרות צלקת או אחרים, ומחבלים במידה רבה את היישומים של NSCs רפואה רגנרטיבית2. לכן, זה ממש הכרחי למצוא הרומן דרך בטוחה עבור בידול לבטחון לאומי.
פלזמה היא המדינה הרביעית של עניינים, הבאים מוצק, נוזל וגז, היא מהווה יותר מ 95% של נושאים בעולם כולו. פלזמה חשמלית ניטרליים עם חיובי/שלילי לא מאוגד וחלקיקים נייטרלי, מופק בדרך כלל על ידי הפרשות מתח גבוה במעבדה. בשני העשורים האחרונים, היישום של פלזמה ב וההתערבות משכה תשומת לב אדירה ברחבי העולם וכן פיתוח טכנולוגי פלזמה קר לחץ אטמוספירי. בזכות זה פירות טכני, יציב בטמפרטורה נמוכה פלזמה יכול להיווצר באוויר הסובב על האווירה מבלי במערך קשת ומורכבת ממינים שונים תגובתי, כגון חנקן ונבדקים מינים (האחיות המוסמכות), מינים חמצן תגובתי (ROS), אולטרה סגול (UV) קרינה, אלקטרונים, יונים ושדה חשמלי3. כמוסות יש יתרונות ייחודיים עבור מיקרו-אורגניזם איון, טיפול בסרטן, פצע מרפא, טיפול של מחלות עור, התפשטות תאים תאים בידול4,5,6,7. בעבודה הקודמת, הפגנו פלזמה אטמוספרי קר jet יכול לשפר את הבידול של NSCs תאי גזע עצביים מאתר C17.2 (C17.2-NSCs) והן תאי גזע עצביים החולדה הראשית, מפגין פוטנציאל גדול להפוך לכלי רב עוצמה בוים הבידול של NSCs8. למרות המנגנון של שיפור שווי של בידול לבטחון לאומי אינה מובנת במלואה, שנוצר על ידי אותיות לא הוכח להיות גורם מפתח בתהליך. בעבודה זו, אנו שואפים לספק פרוטוקול נסיוני מפורט של השימוש של פלזמה הליום/חמצן אטמוספרי סילון לטיפול NSCs במבחנה, הכנה תא, רעלני, מורפולוגיה תצפית על ידי מיקרוסקופ הפוכה, ו קרינה פלואורסצנטית התבוננות מיקרוסקופית של immunofluorescence מכתים.
Protocol
Representative Results
Discussion
C17.2-NSCs הוא סוג של קו מונצחים תאי גזע עצביים מתאי שכבת פרטנית אסטרוציטומה העכבר neonatal, שפותחה על ידי שניידר ואחרים10,11. C17.2-NSCs יכולים להתמיין נוירונים, האסטרוציטים, ו אוליגודנדרוציטים, נמצאים בשימוש נרחב במדעי המוח12. במחקר הקודם שלנו, כמוסות יכול לש…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על-ידי התוכנית מלומד Huazhong, הקרן חדשנות עצמאית של אוניברסיטת Huazhong של המדע, הטכנולוגיה (מספר 2018KFYYXJJ071), את נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (‘ קט ‘ 31501099 ו- 51707012).
Materials
| Coverslip | NEST | 801008 | |
| Poly-D-lysine | Beyotime | P0128 | |
| DMEM medium | HyClone | SH30022.01B | stored at 4 °C |
| DMEM/F12 medium | HyClone | SH30023.01B | stored at 4 °C |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | stored at -20 °C and protect from light |
| B27 supplement | Gibco | 17504044 | stored at -20 °C and protect from light |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30084.03 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Donor Horse serum | HyClone | SH30074.03 | tored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Penicillin/Streptomycin | HyClone | SV30010 | stored at 4 °C |
| Trypsin | HyClone | 25300054 | stored at 4 °C |
| PBS solution | HyClone | SH30256.01B | stored at 4 °C |
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0098 | stored at -20 °C |
| TritonX-100 | Sigma | T8787 | |
| Normal Goat Serum Blocking Solution | Vector Laboratories | S-1000-20 | stored at 4 °C |
| anti-Nestin | Beyotime | AF2215 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| anti-β-Tubulin III | Sigma Aldrich | T2200 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| anti-O4 | R&D Systems | MAB1326 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| anti-NF200 | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-ChAT | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti- LHX3 | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-GABA | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-Serotonin | Abcam, Cambridge, MA | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-TH | Abcam, Cambridge, MA | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| Immunol Staining Primary Antibody Dilution Buffer | Beyotime | P0103 | stored at 4 °C |
| Cy3 Labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0516 | stored at -20 °C and protect from light |
| Alexa Fluor 488- Labeled Goat | Beyotime | A0428 | stored at -20 °C and protect from light |
| Anti-Mouse IgG | |||
| 12-well plate | corning | 3512 | |
| 25 cm2 flask | corning | 430639 | |
| Hoechst 33258 | Beyotime | C1018 | stored at -20 °C and protect from light |
| Mounting medium | Beyotime | P0128 | stored at -20 °C and protect from light |
| Light microscope | Nanjing Jiangnan Novel Optics Company | XD-202 | |
| Fluorescence microscopy | Nikon | 80i | |
| High – voltage Power Amplifier | Directed Energy | PVX-4110 | |
| DC power supply | Spellman | SL1200 | |
| Function Generator | Aligent | 33521A | |
| Oscilloscope | Tektronix | DPO3034 | |
| High voltage probe | Tektronix | P6015A |
References
- Temple, S. The development of neural stem cells. Nature. 414 (6859), 112-117 (2001).
- Rossi, F., Cattaneo, E. Neural stem cell therapy for neurological diseases: dreams and reality. Nature Reviews Neuroscience. 3 (5), 401-409 (2002).
- Graves, D. B. The emerging role of reactive oxygen and nitrogen species in redox biology and some implications for plasma applications to medicine and biology. Journal of Physics D: Applied Physics. 45 (26), 263001 (2012).
- Weltmann, K. D., von Woedtke, T. Plasma medicine-current state of research and medical application. Plasma Physics and Controlled Fusion. 59 (1), 014031 (2017).
- Lloyd, G., et al. Gas Plasma: Medical Uses and Developments in Wound Care. Plasma Processes and Polymers. 7 (3-4), 194-211 (2010).
- Yousfi, M., Merbahi, N., Pathak, A., Eichwald, O. Low-temperature plasmas at atmospheric pressure: toward new pharmaceutical treatments in medicine. Fundamental & Clinical Pharmacology. 28 (2), 123-135 (2014).
- Xiong, Z., Roe, J., Grammer, T. C., Graves, D. B. Plasma Treatment of Onychomycosis. Plasma Processes and Polymers. 13 (6), 588-597 (2016).
- Xiong, Z., et al. Selective neuronal differentiation of neural stem cells induced by nanosecond microplasma agitation. Stem Cell Research. 12 (2), 387-399 (2014).
- Xie, Z., Zheng, Q., Guo, X., Yi, C., Wu, Y. Isolation, Culture and Identification of Neural Stem Cells in New-born Rats. Journal of Huazhong University of Science and Technology. [Med Sci]. 23 (2), 75-78 (2003).
- Ryder, E. F., Snyder, E. Y., Cepko, C. L. Establishment and characterization of multipotent neural cell lines using retrovirus vector-mediated oncogene transfer. Journal of Neurobiology. 21 (2), 356-375 (1990).
- Snyder, E. Y., Taylor, R. M., Wolfe, J. H. Neural progenitor cell engraftment corrects lysosomal storage throughout the MRS VII mouse brain. Nature. 374 (6520), 367-370 (1995).
- Snyder, E. Y., Yoon, C., Flax, J. D., Macklis, J. D. Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (21), 11663-11668 (1997).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Cell Fixatives for Immunostaining. Methods in Molecular Biology. 588, 55-61 (2010).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of Cell Membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
