تمايز الخلايا الجذعية العصب خطوة واحدة بلازما باردة الغلاف الجوي علاج في المختبر
Summary
هذا البروتوكول يهدف إلى توفير خطوات تفصيلية تجريبية لعلاج البلازما الباردة الغلاف الجوي على الخلايا الجذعية العصبية، وكشف الفلورة لتعزيز التمايز.
Abstract
كما تم تطوير تكنولوجيا البلازما الفيزيائية، البلازما الباردة الغلاف الجوي (CAPs) التحقيق على نطاق واسع في إزالة التلوث، علاج السرطان، والتئام الجروح، وعلاج قناة الجذر، إلخ، تشكل حقل بحث جديد يدعى الطب البلازما. يجري خليط أنواع المتفاعلة الكهربائية والكيميائية، والبيولوجية، أظهرت قبعات قدراتهم لزيادة تمييز الخلايا الجذعية العصبية على حد سواء في المختبر و في فيفو ، وهي أن تصبح وسيلة واعدة لعلاج الأمراض العصبية في المستقبل. أخبار مثيرة أكثر بكثير هو أن استخدام قبعات يمكن تحقيق خطوة واحدة، وأمان الموجهة، تمايز الخلايا الجذعية العصبية (الود) لنقل الأنسجة. هنا علينا أن نظهر البروتوكول تجريبية مفصلة لاستخدام جهاز كاب نفاثة عصامي تعزيز التمايز مجلس الأمن القومي في C17.2-الود والخلايا الجذعية العصبية، والفئران الأولية، فضلا عن مراقبة مصير الخلية المقلوب والفحص المجهري الأسفار. مع مساعدة الفلورة تلطيخ التكنولوجيا، وجدنا كل الود أظهرت معدل التفاضلية المعجل من المجموعة غير المعالجة، و ~ 75 ٪ من الود متباينة بشكل انتقائي في الخلايا العصبية، التي أساسا ناضجة، اتروبين، والسيارات الخلايا العصبية.
Introduction
التفريق بين الود الموجهة إلى نسب معينة لنقل الأنسجة يعتبر واحداً من العلاجات الواعدة ل أمراض الأعصاب ونيوروتروماتيك1. على سبيل المثال، لا سيما المرجوة كاتيتشولامينيرجيك تتميز الخلايا العصبية في علاج مرض باركنسون (PD). ومع ذلك، قد الأساليب التقليدية لإعداد الخلايا المطلوب للنقل الكثير من العيوب، مثل المواد الكيميائية السمية أو تشكيل ندبة الآخرين، مما يعوق إلى حد كبير تطبيقات الود في الطب التجديدي2. ولذلك، من الضروري جداً العثور على الرواية وطريقة آمنة للتمايز القومي.
البلازما هي الدولة الرابعة من المسائل، ويلي الصلبة والسائلة، والغاز، وهو يشكل أكثر من 95% مسائل في الكون كله. بلازما محايدة كهربائياً مع الجسيمات المحايدة وغير منضم إيجابية/سلبية وعادة يتم إنشاؤها بواسطة عملية تفريغ عالية الفلطية في المعمل. في العقدين الأخيرين، تطبيق البلازما في الطب الحيوي قد اجتذب اهتمام هائل في جميع أنحاء العالم كتطوير تكنولوجيا البلازما الباردة الضغط الجوي. وبفضل هذا تكنيك، يمكن أن تتولد في الهواء المحيط في الغلاف الجوي دون تشكيل قوس مستقرة درجات الحرارة المنخفضة البلازما ويتكون من مختلف الأنواع المتفاعلة، مثل الأنواع النيتروجين التفاعلي (RNS)، والأنواع الأكسجين التفاعلية (روس)، والأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) الإشعاع والإلكترونات والايونات والحقول الكهربائية3. قبعات بمزايا فريدة من نوعها للمنظمة المجهري، وعلاج السرطان، والجرح تضميد الجراح، وعلاج الأمراض الجلدية، وتكاثر الخلايا، والخلية التمايز4،5،،من67. في العمل السابق، أثبتنا أن جت البلازما الباردة الغلاف الجوي يمكن أن يعزز التفريق بين الود في الخلايا الجذعية العصبية موريني C17.2 (C17.2-الود) والخلايا الجذعية العصبية الأولية الفئران، نستعرض إمكانيات كبيرة لتصبح أداة قوية للموجة التفريق بين الود8. على الرغم من أن هذه الآلية لتعزيز عملية النداء الموحد للتمايز القومي ليست مفهومة تماما حتى الآن، لا التي تم إنشاؤها بواسطة قبعات وقد ثبت أن تكون عاملاً رئيسيا في العملية. في هذا العمل، ونحن نهدف إلى توفير بروتوكول تجريبي مفصلة لاستخدام بلازما هليوم/أكسجين ضغط الجوي الطائرات نفاثة لمعاملة الود في المختبروإعداد الخلايا والمعالجة المسبقة، مورفولوجيا الملاحظة بالمجهر المقلوب، و الأسفار مراقبة الفحص المجهري لتلطيخ الفلورة.
Protocol
Representative Results
Discussion
C17.2–الود نوع خط الخلايا الجذعية العصبية مخلدة من خلايا الدماغ الطبقة الحبيبية الماوس الأطفال حديثي الولادة، التي وضعتها سنايدر وغيرها10،11. الود C17.2 يمكن أن تفرق في الخلايا العصبية، وأستروسيتيس، وأوليجوديندروسيتيس، وتستخدم على نطاق واسع في علم الأعصاب<sup cla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل “هوا تشونغ الباحث البرنامج”، صندوق الابتكار المستقل لجامعة هواتشونغ للعلوم والتكنولوجيا (رقم 2018KFYYXJJ071)، ومؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية (رقم 31501099 و 51707012).
Materials
| Coverslip | NEST | 801008 | |
| Poly-D-lysine | Beyotime | P0128 | |
| DMEM medium | HyClone | SH30022.01B | stored at 4 °C |
| DMEM/F12 medium | HyClone | SH30023.01B | stored at 4 °C |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | stored at -20 °C and protect from light |
| B27 supplement | Gibco | 17504044 | stored at -20 °C and protect from light |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30084.03 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Donor Horse serum | HyClone | SH30074.03 | tored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Penicillin/Streptomycin | HyClone | SV30010 | stored at 4 °C |
| Trypsin | HyClone | 25300054 | stored at 4 °C |
| PBS solution | HyClone | SH30256.01B | stored at 4 °C |
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0098 | stored at -20 °C |
| TritonX-100 | Sigma | T8787 | |
| Normal Goat Serum Blocking Solution | Vector Laboratories | S-1000-20 | stored at 4 °C |
| anti-Nestin | Beyotime | AF2215 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| anti-β-Tubulin III | Sigma Aldrich | T2200 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| anti-O4 | R&D Systems | MAB1326 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| anti-NF200 | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-ChAT | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti- LHX3 | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-GABA | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-Serotonin | Abcam, Cambridge, MA | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-TH | Abcam, Cambridge, MA | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| Immunol Staining Primary Antibody Dilution Buffer | Beyotime | P0103 | stored at 4 °C |
| Cy3 Labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0516 | stored at -20 °C and protect from light |
| Alexa Fluor 488- Labeled Goat | Beyotime | A0428 | stored at -20 °C and protect from light |
| Anti-Mouse IgG | |||
| 12-well plate | corning | 3512 | |
| 25 cm2 flask | corning | 430639 | |
| Hoechst 33258 | Beyotime | C1018 | stored at -20 °C and protect from light |
| Mounting medium | Beyotime | P0128 | stored at -20 °C and protect from light |
| Light microscope | Nanjing Jiangnan Novel Optics Company | XD-202 | |
| Fluorescence microscopy | Nikon | 80i | |
| High – voltage Power Amplifier | Directed Energy | PVX-4110 | |
| DC power supply | Spellman | SL1200 | |
| Function Generator | Aligent | 33521A | |
| Oscilloscope | Tektronix | DPO3034 | |
| High voltage probe | Tektronix | P6015A |
References
- Temple, S. The development of neural stem cells. Nature. 414 (6859), 112-117 (2001).
- Rossi, F., Cattaneo, E. Neural stem cell therapy for neurological diseases: dreams and reality. Nature Reviews Neuroscience. 3 (5), 401-409 (2002).
- Graves, D. B. The emerging role of reactive oxygen and nitrogen species in redox biology and some implications for plasma applications to medicine and biology. Journal of Physics D: Applied Physics. 45 (26), 263001 (2012).
- Weltmann, K. D., von Woedtke, T. Plasma medicine-current state of research and medical application. Plasma Physics and Controlled Fusion. 59 (1), 014031 (2017).
- Lloyd, G., et al. Gas Plasma: Medical Uses and Developments in Wound Care. Plasma Processes and Polymers. 7 (3-4), 194-211 (2010).
- Yousfi, M., Merbahi, N., Pathak, A., Eichwald, O. Low-temperature plasmas at atmospheric pressure: toward new pharmaceutical treatments in medicine. Fundamental & Clinical Pharmacology. 28 (2), 123-135 (2014).
- Xiong, Z., Roe, J., Grammer, T. C., Graves, D. B. Plasma Treatment of Onychomycosis. Plasma Processes and Polymers. 13 (6), 588-597 (2016).
- Xiong, Z., et al. Selective neuronal differentiation of neural stem cells induced by nanosecond microplasma agitation. Stem Cell Research. 12 (2), 387-399 (2014).
- Xie, Z., Zheng, Q., Guo, X., Yi, C., Wu, Y. Isolation, Culture and Identification of Neural Stem Cells in New-born Rats. Journal of Huazhong University of Science and Technology. [Med Sci]. 23 (2), 75-78 (2003).
- Ryder, E. F., Snyder, E. Y., Cepko, C. L. Establishment and characterization of multipotent neural cell lines using retrovirus vector-mediated oncogene transfer. Journal of Neurobiology. 21 (2), 356-375 (1990).
- Snyder, E. Y., Taylor, R. M., Wolfe, J. H. Neural progenitor cell engraftment corrects lysosomal storage throughout the MRS VII mouse brain. Nature. 374 (6520), 367-370 (1995).
- Snyder, E. Y., Yoon, C., Flax, J. D., Macklis, J. D. Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (21), 11663-11668 (1997).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Cell Fixatives for Immunostaining. Methods in Molecular Biology. 588, 55-61 (2010).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of Cell Membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
