Дифференциация стволовых клеток нерва по одношаговый атмосферной плазмы лечение в пробирке
Summary
Этот протокол направлен на обеспечение подробные экспериментальные шаги для лечения холодной плазмы атмосферного нервных стволовых клеток и обнаружение иммунофлюоресценции для дифференциации повышение.
Abstract
Как развитие физической плазменной технологии, холодный атмосферной плазмы (CAPs) широко исследованы в дезактивации, лечение рака, заживление ран, лечение корневых каналов, и т.д., формируя новое поле исследований имени плазмы медицины. Будучи смесью электрические, химические и биологические реактивных видов, шапки показали свои способности активизировать дифференцировки стволовых клеток нерва как в пробирке и в естественных условиях и являются становится перспективным способом для лечения неврологических заболеваний в будущем. Гораздо более интересные новости, что с помощью шапки может реализовать один шаг и безопасно направлены, дифференцировка нервных стволовых клеток (NSCs) для перевозки ткани. Мы демонстрируем здесь подробный экспериментальный протокол с помощью самодельное устройство CAP струи для повышения НСК дифференциации в C17.2-NSCs и первичных крыса нервные стволовые клетки, а также наблюдения за судьбу клеток, Перевернутый и микроскопии флуоресцирования. С помощью иммунофлюоресценции, окрашивание технологии мы обнаружили, как NSCs, показал ускоренными темпами дифференциальных чем группе необработанных и ~ 75% NSCs выборочно дифференцированной в нейроны, которые в основном пожилые, холинэргические и мотор нейроны.
Introduction
Направленного дифференцирования NSCs в определенной линии для транспортировки ткани считается одним из самых перспективных терапии нейродегенеративных и neurotraumatic заболеваний1. К примеру catecholaminergic дофаминергические нейроны особенно желательны в лечении болезни Паркинсона (PD). Однако традиционные методы подготовить нужные ячейки для перевозки имеют много недостатков, таких как химическая токсичность, рубцов или другие, которые во многом препятствует приложения NSCs в регенеративной медицине2. Таким образом это очень необходимо найти Роман и безопасный способ для дифференциации НСК.
Плазма это четвертый состояние вопросы, следующие твердых, жидких и газовых, и он составляет более 95% вопросов во всей Вселенной. Плазмы электрически нейтрален с несвязанных позитивных/негативных и нейтральных частиц и обычно генерируется высоковольтного разряда в лаборатории. В последние два десятилетия применение плазмы в биомедицине привлекает огромное внимание во всем мире как развития технологии холодного атмосферного давления, плазмы. Благодаря этой технике стабильной низкотемпературной плазмы могут создаваться в окружающий воздух в атмосферу без образования дуги и состоит из различных реактивных видов, таких как химически активные разновидности азота (RNS), реактивнооксигенных видов (ров), ультрафиолетового (УФ) излучения, электроны, ионы и электрическое поле3. Кепки имеют уникальные преимущества для инактивации микроорганизмов, лечение рака, ранозаживляющее, лечение кожных заболеваний, пролиферации и дифференцировки клеток4,5,6,7. В предыдущей работе мы продемонстрировали, что холодной атмосферы плазменной струи может повысить дифференциация NSCs в мышиных нервных стволовых клеток C17.2 (C17.2-NSCs) и первичной крыса нервные стволовые клетки, выставке большой потенциал, чтобы стать мощным инструментом для направленного дифференциация NSCs8. Хотя механизм повышения CAP НСК дифференциации полностью не поняли еще, NO, порожденных шапки доказано, чтобы быть ключевым фактором в процессе. В этой работе, мы стремимся предоставить подробный экспериментальный протокол использования атмосферное давление гелиево кислородную плазменной струи для лечения NSCs в пробирке, подготовка клетки и предварительной обработки, морфология наблюдение с помощью инвертированного микроскопа, и флуоресценции наблюдение микроскопии иммунофлуоресценции пятнать.
Protocol
Representative Results
Discussion
C17.2-NSCs является своего рода увековечен нервных стволовых клеток линии от новорожденных мыши мозжечковой зернистый слой клеток, разработанный Снайдер и другие10,11. C17.2-NSCs могут дифференцироваться в нейронах, астроциты и Олигодендроциты и широко использую?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Хуажонге ученый программы, независимые инновационный фонд Huazhong университета науки и технологии (№ 2018KFYYXJJ071) и Фонд национального естественных наук Китая (№ 31501099 и 51707012).
Materials
| Coverslip | NEST | 801008 | |
| Poly-D-lysine | Beyotime | P0128 | |
| DMEM medium | HyClone | SH30022.01B | stored at 4 °C |
| DMEM/F12 medium | HyClone | SH30023.01B | stored at 4 °C |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | stored at -20 °C and protect from light |
| B27 supplement | Gibco | 17504044 | stored at -20 °C and protect from light |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30084.03 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Donor Horse serum | HyClone | SH30074.03 | tored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Penicillin/Streptomycin | HyClone | SV30010 | stored at 4 °C |
| Trypsin | HyClone | 25300054 | stored at 4 °C |
| PBS solution | HyClone | SH30256.01B | stored at 4 °C |
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0098 | stored at -20 °C |
| TritonX-100 | Sigma | T8787 | |
| Normal Goat Serum Blocking Solution | Vector Laboratories | S-1000-20 | stored at 4 °C |
| anti-Nestin | Beyotime | AF2215 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| anti-β-Tubulin III | Sigma Aldrich | T2200 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| anti-O4 | R&D Systems | MAB1326 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| anti-NF200 | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-ChAT | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti- LHX3 | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-GABA | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-Serotonin | Abcam, Cambridge, MA | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-TH | Abcam, Cambridge, MA | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| Immunol Staining Primary Antibody Dilution Buffer | Beyotime | P0103 | stored at 4 °C |
| Cy3 Labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0516 | stored at -20 °C and protect from light |
| Alexa Fluor 488- Labeled Goat | Beyotime | A0428 | stored at -20 °C and protect from light |
| Anti-Mouse IgG | |||
| 12-well plate | corning | 3512 | |
| 25 cm2 flask | corning | 430639 | |
| Hoechst 33258 | Beyotime | C1018 | stored at -20 °C and protect from light |
| Mounting medium | Beyotime | P0128 | stored at -20 °C and protect from light |
| Light microscope | Nanjing Jiangnan Novel Optics Company | XD-202 | |
| Fluorescence microscopy | Nikon | 80i | |
| High – voltage Power Amplifier | Directed Energy | PVX-4110 | |
| DC power supply | Spellman | SL1200 | |
| Function Generator | Aligent | 33521A | |
| Oscilloscope | Tektronix | DPO3034 | |
| High voltage probe | Tektronix | P6015A |
References
- Temple, S. The development of neural stem cells. Nature. 414 (6859), 112-117 (2001).
- Rossi, F., Cattaneo, E. Neural stem cell therapy for neurological diseases: dreams and reality. Nature Reviews Neuroscience. 3 (5), 401-409 (2002).
- Graves, D. B. The emerging role of reactive oxygen and nitrogen species in redox biology and some implications for plasma applications to medicine and biology. Journal of Physics D: Applied Physics. 45 (26), 263001 (2012).
- Weltmann, K. D., von Woedtke, T. Plasma medicine-current state of research and medical application. Plasma Physics and Controlled Fusion. 59 (1), 014031 (2017).
- Lloyd, G., et al. Gas Plasma: Medical Uses and Developments in Wound Care. Plasma Processes and Polymers. 7 (3-4), 194-211 (2010).
- Yousfi, M., Merbahi, N., Pathak, A., Eichwald, O. Low-temperature plasmas at atmospheric pressure: toward new pharmaceutical treatments in medicine. Fundamental & Clinical Pharmacology. 28 (2), 123-135 (2014).
- Xiong, Z., Roe, J., Grammer, T. C., Graves, D. B. Plasma Treatment of Onychomycosis. Plasma Processes and Polymers. 13 (6), 588-597 (2016).
- Xiong, Z., et al. Selective neuronal differentiation of neural stem cells induced by nanosecond microplasma agitation. Stem Cell Research. 12 (2), 387-399 (2014).
- Xie, Z., Zheng, Q., Guo, X., Yi, C., Wu, Y. Isolation, Culture and Identification of Neural Stem Cells in New-born Rats. Journal of Huazhong University of Science and Technology. [Med Sci]. 23 (2), 75-78 (2003).
- Ryder, E. F., Snyder, E. Y., Cepko, C. L. Establishment and characterization of multipotent neural cell lines using retrovirus vector-mediated oncogene transfer. Journal of Neurobiology. 21 (2), 356-375 (1990).
- Snyder, E. Y., Taylor, R. M., Wolfe, J. H. Neural progenitor cell engraftment corrects lysosomal storage throughout the MRS VII mouse brain. Nature. 374 (6520), 367-370 (1995).
- Snyder, E. Y., Yoon, C., Flax, J. D., Macklis, J. D. Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (21), 11663-11668 (1997).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Cell Fixatives for Immunostaining. Methods in Molecular Biology. 588, 55-61 (2010).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of Cell Membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
