Summary

Différenciation des cellules souches nerveuses par un traitement d’un Plasma atmosphérique froid en une seule étape d' In Vitro

Published: January 11, 2019
doi:

Summary

Ce protocole vise à fournir une procédure expérimentale détaillée d’un traitement plasma atmosphérique froid sur les cellules souches neurales et détection par immunofluorescence pour l’amélioration de la différenciation.

Abstract

Comme le développement de la technologie plasma physique, plasmas atmosphériques froids (CAPs) ont été largement étudiées dans la décontamination, le traitement du cancer, la cicatrisation des plaies, traitement de canal, etc., formant un nouveau champ de recherche nommé plasma médecine. Est un mélange d’espèces réactives électriques, chimiques et biologiques, casquettes ont montré leurs capacités à améliorer la différenciation des cellules souches nerveuses les deux in vitro et in vivo et sont devenant une voie prometteuse pour le traitement des maladies neurologiques dans l’avenir. Les nouvelles beaucoup plus excitants sont qu’utilisant des amorces à peut réaliser en une seule étape et en toute sécurité réalisé, différenciation des cellules souches neurales (CNS) pour le transport du tissu. Nous montrons ici le protocole expérimental détaillé d’utilisant un dispositif de CAP jet fait par soi-même afin d’améliorer la différenciation NSC C17.2-CNS et primaires de rats des cellules souches neurales, ainsi qu’observant le sort de la cellule par inversé et microscopie de fluorescence. Avec l’aide d’immunofluorescence souillant la technologie, nous avons trouvé les deux les CNS ont montré un taux de prime accéléré que le groupe non traité, et ~ 75 % des CNS sélectivement différencient en neurones, qui sont principalement des adultes, cholinergiques et moteur neurones.

Introduction

La différenciation dirigée des CNS en une certaine lignée pour le transport de tissus est considérée comme une des thérapies plus prometteuses de maladies neurodégénératives et Alhzeimer1. Par exemple, les neurones dopaminergiques catécholaminergiques sont particulièrement souhaitées dans le traitement de la maladie de Parkinson (MP). Cependant, les méthodes traditionnelles pour préparer les cellules souhaitées pour le transport ont beaucoup d’inconvénients, tels que la toxicité chimique, la formation de cicatrices ou autres, qui empêche en grande partie les demandes des CNS en médecine régénérative2. Par conséquent, il est très nécessaire de trouver un roman et un moyen sûr pour la différentiation de la NSC.

Le plasma est le quatrième état de la matière, suivant solides, liquides et gaz, et elle constitue plus de 95 % des affaires dans l’univers tout entier. Plasma est électriquement neutre avec non consolidé positif/négatif et de particules neutres et est généralement générée par une décharge haute tension en laboratoire. Dans les deux dernières décennies, l’application du plasma en biomédecine a attiré l’attention énorme dans le monde entier comme le développement de la technologie du plasma froid la pression atmosphérique. Grâce à cette technique, plasma à basse température stable peut être générée dans l’air ambiant à l’atmosphère sans formation de l’arc et se compose de diverses espèces réactives, comme les espèces réactives de l’azote (RNS), espèces réactives de l’oxygène (ROS), aux ultraviolets (UV) rayonnement, électrons, ions et champ électrique3. Casquettes ont des avantages uniques pour l’inactivation des micro-organismes, le traitement du cancer, la cicatrisation, traitement des maladies de la peau, la prolifération cellulaire et cellules différenciation4,5,6,7. Dans un travail antérieur, nous avons démontré que jet de plasma atmosphérique froid peut améliorer la différenciation des CNS dans les cellules souches neurales murin C17.2 (C17.2-CNS) tant primaires de rats des cellules souches neurales, présentant un grand potentiel pour devenir un outil puissant pour le réalisé différenciation des CNS8. Bien que le mécanisme de mise en valeur de CAP de la différenciation du NSC n’est pas entièrement compris encore, NO généré par CAPs a été prouvé d’être un facteur clé dans le processus. Dans ce travail, nous visons à fournir un plan expérimental détaillé de l’utilisation d’un plasma d’hélium/oxygène pression atmosphérique jet pour le traitement des CNS en vitro, préparation de cellules et prétraitement, observation de la morphologie par microscope inversé, et observation de microscopie par fluorescence d’immunofluorescence souillant.

Protocol

1. cell Cultures et Predifferentiation Predifferentiation et la culture de cellules souches neurales Préparer les lamelles de poly-D-lysine-enduit. Mettre une lamelle stérile (20 mm de diamètre) dans une plaque de 12 puits. Recouvrir le couvercle en verre avec poly-D-lysine, 0,1 % p/v, dans l’eau (Table des matières) pour une meilleure adhérence de la cellule sur le couvre-objet en suivant les étapes suivantes.Remarque : Des conditions optimales doivent …

Representative Results

La morphologie cellulaire a été observée au microscope inversé tous les jours après le traitement de la CAP. Figure 2 montre les images de microscopie ordinaire inversé à contraste de phase de la différenciation cellulaire dans les deux lignées cellulaires. Le groupe imprégnées de plasma expose un taux de différentiation accélérée et un taux élevé de différenciation comparée au groupe contrôle et gaz flux. <p class="j…

Discussion

C17.2-CNS est une sorte de ligne immortalisé les cellules souches neurales de cellules de souris néonatales couche granuleuse cérébelleuse, développé par Snyder et d’autres10,11. C17.2-CNS peuvent se différencier en neurones, astrocytes et oligodendrocytes et sont largement utilisés dans les neurosciences12. Dans notre étude précédente, casquettes pourraient favoriser la différenciation des C17.2-CNS en neurones. Une étude d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par la Huazhong Scholar Program, le fonds d’Innovation indépendante de l’Université Huazhong des sciences et de technologie (n° 2018KFYYXJJ071) et la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (nos 31501099 et 51707012).

Materials

Coverslip NEST 801008
Poly-D-lysine Beyotime P0128
DMEM medium HyClone SH30022.01B stored at 4 °C
DMEM/F12 medium HyClone SH30023.01B stored at 4 °C
N2 supplement Gibco 17502048 stored at -20 °C and protect from light
B27 supplement Gibco 17504044 stored at -20 °C and protect from light
Fetal bovine serum HyClone SH30084.03 stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Donor Horse serum HyClone SH30074.03 tored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Penicillin/Streptomycin HyClone SV30010 stored at 4 °C
Trypsin HyClone 25300054 stored at 4 °C
PBS solution HyClone SH30256.01B stored at 4 °C
4% paraformaldehyde Beyotime P0098 stored at -20 °C
TritonX-100 Sigma T8787
Normal Goat Serum Blocking Solution Vector Laboratories S-1000-20 stored at 4 °C
anti-Nestin Beyotime AF2215 stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-β-Tubulin III Sigma Aldrich T2200 stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-O4 R&D Systems MAB1326 stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-NF200 Sigma stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-ChAT Sigma stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti- LHX3 Sigma stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-GABA Sigma stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-Serotonin Abcam, Cambridge, MA stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-TH Abcam, Cambridge, MA stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Immunol Staining Primary Antibody Dilution Buffer Beyotime P0103 stored at 4 °C
Cy3 Labeled Goat Anti-Rabbit IgG Beyotime A0516 stored at -20 °C and protect from light
Alexa Fluor 488- Labeled Goat Beyotime A0428 stored at -20 °C and protect from light
Anti-Mouse IgG 
12-well plate corning 3512
25 cm2 flask corning 430639
Hoechst 33258 Beyotime C1018 stored at -20 °C and protect from light
Mounting medium Beyotime P0128 stored at -20 °C and protect from light
Light microscope Nanjing Jiangnan Novel Optics Company XD-202
Fluorescence microscopy Nikon 80i
High – voltage Power Amplifier Directed Energy PVX-4110
DC power supply Spellman SL1200
Function Generator Aligent  33521A
Oscilloscope Tektronix DPO3034
High voltage probe Tektronix P6015A

References

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Cite This Article
Xiong, Z., Zhao, S., Yan, X. Nerve Stem Cell Differentiation by a One-step Cold Atmospheric Plasma Treatment In Vitro. J. Vis. Exp. (143), e58663, doi:10.3791/58663 (2019).

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