Summary

Nerv-Stammzell-Differenzierung durch ein einstufiges kalt atmosphärischem Plasma Behandlung In-vitro-

Published: January 11, 2019
doi:

Summary

Dieses Protokoll soll detaillierte experimentelle Schritte von einer kalten atmosphärischen Plasmabehandlung auf neurale Stammzellen und Immunfluoreszenz-Erkennung für Differenzierung Verbesserung zu geben.

Abstract

Da die Entwicklung der physischen Plasmatechnologie, kalte atmosphärische Plasmen (CAPs) in Dekontamination, Krebsbehandlung, Wundheilung, Wurzelbehandlung, etc.weit untersucht wurden, bilden ein neues Forschungsgebiet benannt Plasmamedizin. Als eine Mischung aus elektrischen, chemischen und biologischen reaktiven Spezies, Kappen haben gezeigt, ihre Fähigkeiten, Nerv Stammzellen Differenzierung zu verbessern sowohl in Vitro und in Vivo und sind immer ein vielversprechender Ansatz für die Behandlung von neurologischen Krankheiten in der Zukunft. Die viel spannende Nachricht ist, dass CAPs einstufige erkennen können und sicher geleitet, Differenzierung von neuronalen Stammzellen (NSCs) für den Transport der Gewebe. Wir zeigen hier die detaillierte experimentelle Protokoll mit einem selbstgebauten CAP Jet-Gerät um zu NSC Differenzierung in C17.2-NSCs und primäre Ratte neuronalen Stammzellen zu verbessern sowie Beobachtung durch das Schicksal der Zelle invertiert und Fluoreszenz-Mikroskopie. Mit Hilfe der Immunfluoreszenz-Färbung Technologie wir fanden beide die NSCs Differential beschleunigt als die unbehandelte Gruppe zeigte, und ~ 75 % von den NSCs differenziert selektiv in Neuronen, die vor allem ältere, cholinerge und motor Neuronen.

Introduction

Die gezielte Differenzierung von NSCs in einer bestimmten Linie für den Transport der Gewebe gilt als einer der vielversprechendsten Therapien für Neurodegenerative und Neurotraumatic Krankheiten1. Zum Beispiel sind Catecholaminergic dopaminergen Neuronen vor allem in der Behandlung der Parkinson-Krankheit (PD) erwünscht. Traditionelle Methoden, um die gewünschten Zellen für den Transport vorzubereiten haben jedoch viele Nachteile, wie chemische Toxizität, Narbenbildung oder andere, die vor allem die Anwendungen der NSCs in regenerative Medizin2behindert. Daher ist es sehr notwendig, um eine neue und sichere Methode für NSC Differenzierung zu finden.

Plasma ist der vierte Zustand der Angelegenheiten, folgende Feststoff, Flüssigkeit und Gas und stellt mehr als 95 % der Fragen im ganzen Universum. Plasma ist elektrisch neutral mit ungebundenen positiven/negativen und neutralen Teilchen und wird in der Regel durch eine Hochspannungs-Entladung im Labor erzeugt. In den letzten zwei Jahrzehnten hat die Anwendung von Plasma in der Biomedizin als die Entwicklung der kalten Atmosphärendruck-Plasma-Technologie weltweit große Aufmerksamkeit erregt. Dank dieser Technik stabiles Niedrigtemperatur-Plasma in der umgebenden Luft in der Atmosphäre ohne Bogen Bildung erzeugt werden kann und besteht aus verschiedenen reaktiven Spezies, wie reaktive Stickstoff-Spezies (RNS), reaktive Sauerstoffspezies (ROS), Ultraviolett (UV) Strahlung, Elektronen, Ionen und elektrisches Feld3. Kappen haben einzigartige Vorteile für Mikroorganismen-Inaktivierung, Krebstherapie, Wundheilung, Behandlung von Hautkrankheiten, Zellproliferation und Zelle Differenzierung4,5,6,7. In früheren Arbeiten haben wir bewiesen, dass kalte atmosphärischem Plasma Jet die Differenzierung der NSCs in murinen neurale Stammzellen C17.2 (C17.2-NSCs) und primäre Ratte neuronalen Stammzellen verbessern kann Aussteller ein großes Potenzial zu einem mächtigen Werkzeug für die Regie Differenzierung von NSCs8. Obwohl der Mechanismus der CAP-Verbesserung der NSC Differenzierung noch nicht vollständig verstanden ist durch Kappen können keine erwies sich ein entscheidender Faktor in diesem Prozess sein. In dieser Arbeit wollen wir ein detailliertes experimentelle Protokoll mit einem Helium/Sauerstoff Atmosphärendruckplasma Jet für die Behandlung von NSCs in Vitro, Handy Vorbereitung und Vorbehandlung, Morphologie Beobachtung von inversen Mikroskop und Fluoreszenz-Mikroskopie Beobachtung der Immunfluoreszenz-Färbung.

Protocol

(1) Zell-Kulturen und Predifferentiation Neuronalen Stammzelle-Kultur und predifferentiation Poly-D-Lysin-beschichtete Deckgläsern vorzubereiten. Legen Sie eine sterile Deckglas (20 mm Durchmesser) in ein 12-Well-Platte. Bestreichen Sie das Deckglas mit Poly-D-Lysin, 0,1 % w/V, im Wasser (Table of Materials) für bessere Zelladhäsion auf den Deckgläsern indem Sie die nächsten Schritte.Hinweis: Optimale Bedingungen müssen für jede Zelllinie und Anwendung fes…

Representative Results

Zellmorphologie wurde unter den inversen Mikroskop jeden Tag nach der GAP-Behandlung beobachtet. Abbildung 2 zeigt die gewöhnliche invertierten Phasenkontrast-Lichtmikroskop Bilder von der Zelldifferenzierung in beiden Zelllinien. Die Plasma-behandelten Gruppe weist auf eine beschleunigte Differenzierung-Rate und eine hohe Differenzierung-Verhältnis im Vergleich zu der Kontrolle und Gas Flow-Gruppe. <p class="jove_content" fo:keep-toge…

Discussion

C17.2-NSCs ist eine Art verewigt neurale Stammzellen Linie von Neugeborenen Mauszellen zerebelläre Körnerschicht, entwickelt von Snyder u.a.10,11. C17.2-NSCs können in Neuronen und Astrozyten, Oligodendrozyten und sind weit verbreitet in Neurowissenschaften12. In unseren früheren Studie konnte CAPs die Differenzierung des C17.2-NSCs in Neuronen verbessern. Eine Proof of Principle Studie wurde auch durchgeführt mit primären Ratte NSCs…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von der Huazhong Scholar Program, dem unabhängigen Innovationsfonds der Huazhong University of Science und Technology (Nr. 2018KFYYXJJ071) und die National Natural Science Foundation of China (Nr. 31501099 und 51707012) unterstützt.

Materials

Coverslip NEST 801008
Poly-D-lysine Beyotime P0128
DMEM medium HyClone SH30022.01B stored at 4 °C
DMEM/F12 medium HyClone SH30023.01B stored at 4 °C
N2 supplement Gibco 17502048 stored at -20 °C and protect from light
B27 supplement Gibco 17504044 stored at -20 °C and protect from light
Fetal bovine serum HyClone SH30084.03 stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Donor Horse serum HyClone SH30074.03 tored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Penicillin/Streptomycin HyClone SV30010 stored at 4 °C
Trypsin HyClone 25300054 stored at 4 °C
PBS solution HyClone SH30256.01B stored at 4 °C
4% paraformaldehyde Beyotime P0098 stored at -20 °C
TritonX-100 Sigma T8787
Normal Goat Serum Blocking Solution Vector Laboratories S-1000-20 stored at 4 °C
anti-Nestin Beyotime AF2215 stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-β-Tubulin III Sigma Aldrich T2200 stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-O4 R&D Systems MAB1326 stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-NF200 Sigma stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-ChAT Sigma stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti- LHX3 Sigma stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-GABA Sigma stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-Serotonin Abcam, Cambridge, MA stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-TH Abcam, Cambridge, MA stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Immunol Staining Primary Antibody Dilution Buffer Beyotime P0103 stored at 4 °C
Cy3 Labeled Goat Anti-Rabbit IgG Beyotime A0516 stored at -20 °C and protect from light
Alexa Fluor 488- Labeled Goat Beyotime A0428 stored at -20 °C and protect from light
Anti-Mouse IgG 
12-well plate corning 3512
25 cm2 flask corning 430639
Hoechst 33258 Beyotime C1018 stored at -20 °C and protect from light
Mounting medium Beyotime P0128 stored at -20 °C and protect from light
Light microscope Nanjing Jiangnan Novel Optics Company XD-202
Fluorescence microscopy Nikon 80i
High – voltage Power Amplifier Directed Energy PVX-4110
DC power supply Spellman SL1200
Function Generator Aligent  33521A
Oscilloscope Tektronix DPO3034
High voltage probe Tektronix P6015A

References

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Cite This Article
Xiong, Z., Zhao, S., Yan, X. Nerve Stem Cell Differentiation by a One-step Cold Atmospheric Plasma Treatment In Vitro. J. Vis. Exp. (143), e58663, doi:10.3791/58663 (2019).

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