Summary

ワンステップ低温大気プラズマ治療体外で神経幹細胞の分化

Published: January 11, 2019
doi:

Summary

このプロトコルは、神経幹細胞と分化強化のため蛍光検出に冷たい大気圧プラズマ処理の詳細な実験手順を提供しています。

Abstract

除染、がん治療、創傷治癒、根管治療などの冷たい大気プラズマ (Cap) 物理プラズマ技術の開発が検討されているとはプラズマ医学という新しい研究分野を形成します。電気・化学・生物学的活性種の混合物であること、キャップが両方生体外で神経幹細胞の分化を強化する能力を示していると体内であり、神経疾患治療のための有望な方法になっています。将来的には。多くのエキサイティングなニュースは、キャップを使用してワンステップを実現することが安全に誘導、神経幹細胞 (NSCs) の分化組織輸送のため。ここで NSC C17.2 NSCs と初代ラット神経幹細胞分化を強化する自作ジェット キャップ デバイスを使用と同様、細胞の運命で反転を観察し、蛍光顕微鏡の詳細な実験的プロトコルを示す.蛍光抗体染色技術の助けを借りて、未処理のグループよりも加速の差分率を示したの両方の NSCs がわかったし、NSCs の ~ 75% は選択的に、主に中高年、コリン作動性と運動ニューロンに分化ニューロン。

Introduction

NSCs の分化組織交通機関の特定の系列には、神経変性疾患や neurotraumatic 病1の最も有望な治療の一つと見なされます。たとえば、カテコラミン神経ドーパミン作動性ニューロンがパーキンソン病 (PD) 治療特に所望されます。ただし、交通機関の任意のセルを準備する従来の方法化学的毒性、瘢痕形成、または他の主として再生医療2NSCs のアプリケーションを阻害するなどの多くの欠点があります。したがって、NSC 分化の小説と安全な方法を見つけるために非常に必要です。

プラズマは事項、次の固体、液体、ガスの 4 つめの状態、それは全体の宇宙の問題の 95% 以上を構成します。プラズマは非連結の正/負と中性粒子を電気でニュートラル、ラボで高電圧放電による生成されます。最後の二十年で生物医学におけるプラズマのアプリケーションは冷たい大気圧プラズマ技術の開発として世界的に巨大な注目を集めています。この技術のおかげで安定した低温プラズマ アークの形成を伴わない雰囲気で周囲の空気で生成でき、活性窒素種 (RNS)、活性酸素種 (ROS)、紫外線 (UV) などのさまざまな反応種で構成されています放射線、電子、イオン、電気フィールド3。キャップは、微生物の不活化、がん治療、創傷治癒、皮膚疾患、細胞増殖、細胞分化4,5,67の治療のユニークな利点を持っています。前作でデモンストレーションを行った冷たい大気圧プラズマ ジェットは NSCs マウス神経幹細胞 C17.2 (C17.2-NSCs) で初代ラット神経幹細胞分化を高めることができるの監督のための強力なツールになる大きな可能性を出展NSCs8の分化。キャップによる NSC 分化のメカニズムはまだ明らかでないがないキャップによって生成されたプロセスで重要な要因ことが証明されています。大気圧ヘリウム ・酸素プラズマ ジェットを用いた体外NSCs、セル準備と前処理、倒立顕微鏡による形態観察が治療の詳細な実験的プロトコルの提供を目指してこの作品で、免疫蛍光染色の蛍光顕微鏡観察。

Protocol

1. 細胞文化および Predifferentiation 神経幹細胞文化と predifferentiation ポリ D リジン コーティング coverslips を準備します。12 ウェル プレートに滅菌 coverslip (直径 20 mm) を置きます。次の手順に従って、coverslips に良い細胞接着の水 (材料表) のポリ-D-リジン、0.1 %w/v、カバーガラスをコートします。注: 各セルラインおよびアプリケーションの最適な条件?…

Representative Results

毎日キャップ治療後倒立顕微鏡下で細胞の形態を認めた。図 2は、両方の細胞において細胞分化の普通の倒立位相差顕微鏡画像を示します。プラズマ処理によるグループ展示加速分化率とコントロールとガス流のグループに高分化比。 C17.2 NSCs と初代ラット NSCs 6 d 培養治療はそれぞれ<str…

Discussion

C17.2 NSCs は一種10,11のスナイダーと他の人によって開発された新生児マウス小脳顆粒層細胞の不死化神経幹細胞ラインの。C17.2 NSCs は神経細胞やアストロ サイト、オリゴデンドロ サイトに分化することができ、神経科学12で広く使用されています。以前の研究では、キャップは C17.2 NSCs のニューロンへの分化を高めることができま?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、華中学者プログラム、華中大学の科学・技術 (第 2018KFYYXJJ071)、中国の国家自然科学基金 (31501099, 51707012 番) の独立した技術革新基金によって支えられました。

Materials

Coverslip NEST 801008
Poly-D-lysine Beyotime P0128
DMEM medium HyClone SH30022.01B stored at 4 °C
DMEM/F12 medium HyClone SH30023.01B stored at 4 °C
N2 supplement Gibco 17502048 stored at -20 °C and protect from light
B27 supplement Gibco 17504044 stored at -20 °C and protect from light
Fetal bovine serum HyClone SH30084.03 stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Donor Horse serum HyClone SH30074.03 tored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Penicillin/Streptomycin HyClone SV30010 stored at 4 °C
Trypsin HyClone 25300054 stored at 4 °C
PBS solution HyClone SH30256.01B stored at 4 °C
4% paraformaldehyde Beyotime P0098 stored at -20 °C
TritonX-100 Sigma T8787
Normal Goat Serum Blocking Solution Vector Laboratories S-1000-20 stored at 4 °C
anti-Nestin Beyotime AF2215 stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-β-Tubulin III Sigma Aldrich T2200 stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-O4 R&D Systems MAB1326 stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-NF200 Sigma stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-ChAT Sigma stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti- LHX3 Sigma stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-GABA Sigma stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-Serotonin Abcam, Cambridge, MA stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-TH Abcam, Cambridge, MA stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Immunol Staining Primary Antibody Dilution Buffer Beyotime P0103 stored at 4 °C
Cy3 Labeled Goat Anti-Rabbit IgG Beyotime A0516 stored at -20 °C and protect from light
Alexa Fluor 488- Labeled Goat Beyotime A0428 stored at -20 °C and protect from light
Anti-Mouse IgG 
12-well plate corning 3512
25 cm2 flask corning 430639
Hoechst 33258 Beyotime C1018 stored at -20 °C and protect from light
Mounting medium Beyotime P0128 stored at -20 °C and protect from light
Light microscope Nanjing Jiangnan Novel Optics Company XD-202
Fluorescence microscopy Nikon 80i
High – voltage Power Amplifier Directed Energy PVX-4110
DC power supply Spellman SL1200
Function Generator Aligent  33521A
Oscilloscope Tektronix DPO3034
High voltage probe Tektronix P6015A

References

  1. Temple, S. The development of neural stem cells. Nature. 414 (6859), 112-117 (2001).
  2. Rossi, F., Cattaneo, E. Neural stem cell therapy for neurological diseases: dreams and reality. Nature Reviews Neuroscience. 3 (5), 401-409 (2002).
  3. Graves, D. B. The emerging role of reactive oxygen and nitrogen species in redox biology and some implications for plasma applications to medicine and biology. Journal of Physics D: Applied Physics. 45 (26), 263001 (2012).
  4. Weltmann, K. D., von Woedtke, T. Plasma medicine-current state of research and medical application. Plasma Physics and Controlled Fusion. 59 (1), 014031 (2017).
  5. Lloyd, G., et al. Gas Plasma: Medical Uses and Developments in Wound Care. Plasma Processes and Polymers. 7 (3-4), 194-211 (2010).
  6. Yousfi, M., Merbahi, N., Pathak, A., Eichwald, O. Low-temperature plasmas at atmospheric pressure: toward new pharmaceutical treatments in medicine. Fundamental & Clinical Pharmacology. 28 (2), 123-135 (2014).
  7. Xiong, Z., Roe, J., Grammer, T. C., Graves, D. B. Plasma Treatment of Onychomycosis. Plasma Processes and Polymers. 13 (6), 588-597 (2016).
  8. Xiong, Z., et al. Selective neuronal differentiation of neural stem cells induced by nanosecond microplasma agitation. Stem Cell Research. 12 (2), 387-399 (2014).
  9. Xie, Z., Zheng, Q., Guo, X., Yi, C., Wu, Y. Isolation, Culture and Identification of Neural Stem Cells in New-born Rats. Journal of Huazhong University of Science and Technology. [Med Sci]. 23 (2), 75-78 (2003).
  10. Ryder, E. F., Snyder, E. Y., Cepko, C. L. Establishment and characterization of multipotent neural cell lines using retrovirus vector-mediated oncogene transfer. Journal of Neurobiology. 21 (2), 356-375 (1990).
  11. Snyder, E. Y., Taylor, R. M., Wolfe, J. H. Neural progenitor cell engraftment corrects lysosomal storage throughout the MRS VII mouse brain. Nature. 374 (6520), 367-370 (1995).
  12. Snyder, E. Y., Yoon, C., Flax, J. D., Macklis, J. D. Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (21), 11663-11668 (1997).
  13. Jamur, M. C., Oliver, C. Cell Fixatives for Immunostaining. Methods in Molecular Biology. 588, 55-61 (2010).
  14. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of Cell Membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).

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Cite This Article
Xiong, Z., Zhao, S., Yan, X. Nerve Stem Cell Differentiation by a One-step Cold Atmospheric Plasma Treatment In Vitro. J. Vis. Exp. (143), e58663, doi:10.3791/58663 (2019).

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