インクジェットプリンター支援によってテスト自動チェッカー ボード配列および手動で時間を殺す方法抗菌の相乗効果

注意:細菌を操作するときは、適切な安全手順を使用します。すべての回で、手袋、白衣を着用します。バイオ セーフティ キャビネット エアロゾルが生成される場合や危険度の高い病原体での作業を実行します。 注:実験を開始する前に 20 に 24 h、血液寒天培地プレート (50% のグリセロール ストックとトリプシンの醤油スープで-80 ° C で凍結植民地精製、最小限代継在庫) からテストする細菌の isolate(s) を連勝。周囲の空気に 35 ° C でプレートを孵化させなさい。 1. インク ジェット プリンターによる自動チェッカー ボード配列の相乗効果 抗菌溶液 (コリスチンとミノサイクリン) を作る。 抗生物質原液濃度抗生物質の溶解性に基づくし、市松模様配列の最終濃度を必要に応じて決定します。コリスチンとこの例でミノサイクリンの 10 mg/mL 株を作る。CLSI M100 ドキュメントを使用して、各抗生物質25適切な溶剤を決定します。コリスチンとミノサイクリンの両方は、水溶性。D300 のインク ジェット プリンターは、適切な水性流体の界面活性剤の添加を必要とするため、0.3% ポリソルベート 20 を超高純度の脱イオン水に抗生物質を溶解します。 分析用天秤を用いた抗生物質の粉末を量りし、目標株価濃度を得るために必要な溶媒の量を計算します。 抗生物質が水和した形 (例えばメロペネム三水和物)、塩 (コリスチン硫酸、塩酸ミノサイクリンなど) として指定される場合、またはそれが少ないを持っている製造業者によって報告された場合 100% の純度よりも実行する力計算26必要な溶媒の量を決定します。 900 mg/mg の記載されている純度塩酸ミノサイクリンのこの例に従ってください。アッセイの純度: 900 mg/mg水分: どれも活性分画: 0.926 (ミノサイクリン塩酸塩 (493.94 Da) の分子量でミノサイクリン (457.48 Da) の分子量で除して得た)。効力 (試金純度) を = * (1-含水率) * (活性分画)(900 mg/mg) を = * (1) * (0.926) = 833.4 mg/mg または 83.34%次のように必要な溶媒の量を決定します。ボリューム (mL) = [重量 (mg) * 効力 (mg)] ÷ [濃度 (mg/mL)]だから、たとえば場合 34.7 mg ミノサイクリン塩酸塩パウダーを計り、使用して次の計算 10 mg/mL の溶液を作るために必要な溶媒の量を決定します。ボリューム = (34.7 mg) * (833.4 mg/mg) = 2.89 mL10,000 mg/mL 15 mL の円錐管に抗生物質の粉末を注ぐし、水プラス 0.3% ポリソルベート 20 の適切なボリュームを追加します。渦溶解するまで。 0.5 mL 遠心管との使用のための準備ができるまで-80 ° C でストアに、分注の抗生物質の原液。 相乗試験 QC 結果は相乗効果をテストするため、在庫を使用する前に評価できるようにする前に、少なくとも 1 日市松模様配列実験で使用するため抗菌薬の在庫の品質管理 (QC) を実行します。メモ:ここで説明した QC 手法は各薬剤の最小発育阻止濃度 (MIC) をテストするために使用するだろう、そのよう捜査官に関心の任意の系統で使える技法と同じです。細菌懸濁液を準備します。 細菌懸濁液を準備している間融解を開始する-80 ° C のフリーザーの各抗生物質株式の因数を取り出してください。渦に確実にソリューションで抗生物質一度融解したもの。 適切な QC ひずみを選択し、CLSI M10025表 5A 1に基づいてテスト対象薬の MIC 範囲を決定します。薬はここで,用大腸菌ATCC 25922;この株の MIC 範囲は 0.25-1 mg/mL ミノサイクリンと 0.25 2 mg/コリスチンの mL。 QC 範囲全体を含むテストする抗生物質の濃度の範囲を選択します。ATCC 25922 のミノサイクリンおよびコリスチン 0.0156 mg/mL を 8 mg/mL の範囲を使用します。 12 mm x 75 mm 底部ガラス文化チューブ ラウンド 0.9% 塩化ナトリウムの 1 つの mL を追加します。ATCC 25922 と渦穏やかで中断の一晩プレートから 1 つまたは 2 つのコロニーを選択します。 マクファーランド リーダーを使用して細菌の濃度を確認してください。読んで 0.5 マクファーランド濁度を達成するためにより多くの 0.9% 塩化ナトリウムまたはより多くの細菌を追加して必要に応じて調整します。 CLSI27の推奨どおり 5 x 105 CFU/mL の最終的な細胞密度に到達する 50 mL のコニカル チューブに陽イオン調整ミューラー ・ ヒントン スープ (CAMHB) を 30 mL に懸濁液を 100 mL を追加することによって 0.5 マクファーランド懸濁液の 1: 300 希釈を行います。 滅菌接種ループ分離連勝開始腐生菌純度を確認し, 大気中の 35 ° C で血液寒天培地プレート上にドロップを使用してください。 D300 を使用して底が抜けた、井戸、明確な未処理の 384 ウェル プレートに抗菌剤を追加します。プレート準備26の 15 分以内に懸濁液を追加できるように細菌懸濁液を準備した直後に、この手順を実行します。 D300 のインクジェットプリンターと関連付けられたコンピューターを入れます。ソフトウェア プログラムを開きます。 新しいファイルを開始します。上記プレート グリッドの画像、板 1を右クリックし、プレートを編集を選択します。適切なプレート型 (384 の井戸) と追加ボリューム (50 mL) を選択します。 プロトコルに流体 (すなわち、抗生物質株式) を追加するには、左側のパネルに流体の横にあるプラス記号をクリックします。2 つの流体 (コリスチン、ミノサイクリン) を追加します。 編集する鉛筆をクリックして、流体 1 に登場したパネルの上に合わせます。流体「コリスチン」の名、クラスへの変更は「水 + トゥイーン 20″10,000、濃度を変更と濃度の単位を mg/mL (ストック濃度は 10 mg/mL、すなわち、10,000 mg/mL) に変更。濃度でディスペンス by を残し、彼らのデフォルトの設定でフィールドの残りの部分を残します。[Ok]をクリックします。 液 2 (ミノサイクリン) に上記の手順を繰り返します。 画面の上部に現在のプロトコルタブをクリックし、最終も抗生物質濃度に使用する単位を決定するmグラム/mL の濃度 (質量)に変更します。 10 井戸をクリックしてドラッグすると、グリッドで選択をクリックし、画面の上部に滴定。最高濃度の液の滴定を使用して指定選択最高濃度、コリスチンを選択、 8を入力 (単位は mg/mL を確認してください)、および配布1:2 (50%)を選択します。ウィンドウの残りの部分のための場所し、 [ok]をクリックして値をデフォルトをまま。 ミノサイクリン滴定を生成するミノサイクリンの上記手順を繰り返します。 プロトコルを保存し、左上の [実行] ボタンをクリックします。 [スタート] ボタンをクリックします。プレート ホルダー (ふた削除) で 384 ウェル プレートに読み込むし、プロンプトロード「ロード プレート 1-シナジー」の下を押します。注:このプロンプトは、ソフトウェアによって選択され、相乗効果テストが行われていることを示しません。カセット スロットに T8 + カセットを置き、 T8 + カセットの負荷の下でロードのプロンプトを押します。 プロンプトが表示されたら、カセットに示された貯水池に抗生物質の原液を追加します。適切な読み込みの画面指示に従い、ソリューションの任意の気泡を避けるために慎重に調剤。各ソリューションを追加すると後、は、充填ボタンを押します。 抗生物質入荷各ウェルと実行完了ボックスに適切なボリュームが表示されますインク ジェット プリンターが追加される、[閉じる] をクリックして、プレートを取り外します、D300 をオフにします。 384 ウェル プレートに細菌懸濁液を追加し、プレートをインキュベートします。 事前に準備された細菌懸濁液を滅菌試薬槽に注ぐ。 マルチ チャンネル ピペットを使用して、すべての抗生物質を含む井戸に細菌懸濁液 50 mL を追加します。空のよく; 細菌なし CAMHB の 50 mL を追加します。ネガティブ コントロールになりますこれもメディアの不稔を確認します。 35 ° C 周囲の空気のインキュベーターでプレートを置き、16-20 h26間インキュベートします。注:腸内細菌科以外の生物がテストされている; 場合、インキュベーションの別の有効期間が必要生物固有の推奨事項の CLSI M10025を参照してください。 600 (外径600) の光学密度のマイクロ プレート リーダーのプレートを読むし、結果を分析します。 ≥0.07 緑色の成長との値を持つセルの OD600値を持つセルをシェード スプレッドシート プログラムを使用すると、< 0.07 赤、成長がないことを示します。注: これらの値は、ない成長と OD 測定のためのこれらの実験との相関関係対成長の目視検査に基づいて決定されますメディアだけを含む井戸から OD600測定値は 0.07 以下一貫していた。適切なヒューズは、異なるプレート リーダーと細菌と異なる場合があります。 各薬剤の MIC を決定します。マイクは、細菌の増殖を抑制する薬の最小濃度です。マイクは、CLSI M100 文書25によると予想される QC の範囲内は、原液は使用のために適切です。 市松模様配列の細菌懸濁液を準備します。 細菌懸濁液を準備している間融解を開始する-80 ° C のフリーザーの各抗生物質株式の因数を取り出してください。抗生物質を確保するため一度融解したもの渦ソリューションは。 12 mm x 75 mm 底部ガラス文化チューブ ラウンド 0.9% 塩化ナトリウムの 〜 1 mL を追加します。(この場合、エシェリヒア属大腸菌の緊張で FDA CDC 0494) 細菌および 0.9% の塩化ナトリウムで、これらを中断する優しく渦の一晩プレートから 1 つまたは 2 つのコロニーを選択します。 マクファーランド リーダーを使用して細菌の濃度を確認してください。読んで 0.5 マクファーランド濁度を達成するためにより多くの 0.9% 塩化ナトリウムまたはより多くの細菌を追加して必要に応じて調整します。 5 x 105 CFU/mL27の最終的な細胞密度に到達する 50 mL のコニカル チューブに CAMHB 30 mL に懸濁液を 100 mL を追加して 0.5 マクファーランド懸濁液の 1: 300 希釈を行います。 D300 を使用して底が抜けた、井戸、明確な未処理の 384 ウェル プレートに抗菌剤を追加します。注:準備26の 15 分以内懸濁液をプレートに追加できるように細菌懸濁液を準備した直後にこの手順を実行します。 インク ジェット プリンターの電源を新しいファイルを起動し、流体を手順 1.2.2.1-1.2.2.3 のようにプロトコルに追加します。 シナジーのグリッドが生成されます。 画面の上部に相乗効果アイコンをクリックし、手順を続行します。タイプ一緒に因数分解 2 つまたはより多くの流体を選択します。プレート、必ずしもすべての井戸を除外する必要はありません。この手順の変更を加えずに次へをクリックします。 滴定] タブで抗生物質濃度と配置を入力します。 0.031 mg/mL、 y軸をない抗生物質で否定的な井戸のほかに 32 から 2 倍希釈の増減ミノサイクリンを追加するために、滴定レベルの左側のパネルで 12 を入力します。滴定を使用して指定すると、最も高い濃度を選択します。流体ミノサイクリン; を選択します。最高濃度32 (単位 mg/mL に設定されます; それがにない場合相乗効果] ダイアログ ボックスを閉じ、現在のプロトコル] タブで変更を確認してください) を入力します。0 は、値のボックスがチェックされていることを確認します。分布を 1:2 (50%) に変更します。 コリスチン 12 滴レベルおよび 16 の最高濃度を使用して、右側のパネルでこれらの手順を繰り返します。[次へ] をクリックします。 [レイアウト] タブで、最初 2 液の滴定レベル決定レイアウト グリッドの行と列の数を選択します。[次へ] をクリックします。期待どおりに、グリッドが表示されている場合は、完了をクリックします。 プロトコルを保存し、左上の [実行] ボタンをクリックします。 [スタート] ボタンをクリックします。(蓋をはずさない) と 384 ウェル プレートをプレート ホルダーに読み込むし、プロンプトロードロード プレート 1-シナジーの下を押します。カセット スロットに T8 + カセットを置き、 T8 + カセットの負荷の下でロードのプロンプトを押します。 プロンプトが表示されたら、カセットに示された貯水池に抗生物質の原液を追加します。適切な読み込みの画面指示に従い、ソリューションの任意の気泡を避けるために慎重に調剤。各ソリューションを追加すると後、は、充填ボタンを押します。 D300 ディスペンサーの抗生物質入荷各ウェルと実行完了ボックスに適切なボリュームが表示されます追加が終了をクリックして、プレートを取り外します、D300 をオフにします。 384 ウェル プレートに細菌懸濁液を追加し、プレートをインキュベートします。 事前に準備された細菌懸濁液を滅菌試薬槽に注ぐ。 マルチ チャンネル ピペットを使用して、市松模様配列のすべての井戸に懸濁液 50 mL を追加します。空のよく; 細菌なし CAMHB の 50 mL を追加します。ネガティブ コントロールになりますこれもメディアの不稔を確認します。16-20 h2635 ° C 周囲の空気のインキュベーターで孵化させなさい。 外径600マイクロ プレート リーダーのプレートを読み、市松模様の配列結果を分析します。 まず、純度プレートを確認し、隔離されたコロニーがテストされている生物の予想される形態との一貫性のある単一の形態であることを確認します。 スプレッドシート プログラムを使用すると、成長やステップ 1.2.4.1 のように成長を示すセルに網かけ。 各薬剤の MIC を決定します。最高濃度テストで細菌の増殖を阻害しない薬物、マイクは、スケールをオフにすると見なされます。 各成長が阻害されるとその抗生物質の MIC に基づいて各抗生物質のため (FIC) 小数の発育阻止濃度を決定 (図 1 bと2 b 図参照)。注:ラフィックがそのマイク; ために成長を阻害、よく抗生物質の濃度の比だから 8 mg/mL のマイクを持つ薬剤、その薬のも含む 8 mg/mL はよく含む 4 mg/mL は 0.5 の FIC の 1、FIC にしています。 よくで薬のそれぞれの FICs の合計としての成長が阻害される各ウェルの小数の発育阻止濃度 (FIC私) インデックス値を計算します。 最低 FIC は私成長が抑制 (最小 FIC私) を決定します。£0.5、最小 FIC私場合検討組み合わせ相乗効果。場合は 0.5-4、無関心、組み合わせを検討そして、もし > 4、組み合わせを敵対的検討してください。組み合わせは他で拮抗が、いくつかの濃度の組み合わせで相乗効果、この結果に注意してくださいが、拮抗の全体的な組み合わせを考慮します。 2. 時間を殺す相乗試験 抗菌溶液を作る。実験前にこの手順を実行すると、使用する準備ができるまで-80 ° C で株を凍結します。 抗生物質原液濃度抗生物質の溶解性に基づくし、時間を殺す研究の最終濃度を必要に応じて決定します。この例では、1 Mg/ml の濃度でコリスチンとミノサイクリンの株を作る。CLSI M100 ドキュメントを使用して、各抗生物質25適切な溶剤を決定します。コリスチンとミノサイクリンの両方を推奨されているように、水を使用します。 分析用天秤を用いた抗生物質の粉末を量りし、目標株価濃度を得るために必要な溶媒の量を計算します。必要な場合は、1.1.2.1 上記の手順で説明するように、必要な溶媒の量を決定する前に力の計算を行います。 円錐管 15 mL に抗生物質のパウダーを注ぐし、水の適切な量を追加します。渦溶解するまで。 CLSI M0726で説明している手動スープ微量液体希釈法を使用して抗菌の QC を実行時間で使用するため株式を殺す相乗効果実験。シナジー株式を使用する前に QC 結果を確認できるようにするをテストする前に、少なくとも 1 日この手順を実行します。 適切な QC ひずみを選択し、CLSI M10025表 5A 1に基づいてテスト対象薬の MIC 範囲を決定します。薬はここで,用大腸菌ATCC 25922;この株の MIC 範囲は 0.25-1 mg/mL ミノサイクリンと 0.25 2 mg/コリスチンの mL。 抗生物質を含むスープの希釈プレートを準備します。 QC 範囲全体を含めることができるようにテストする抗生物質の最高濃度を選択します。ATCC 25922 のミノサイクリンとコリスチンの 0.016 に 8 mg/mL の範囲を使用します。 2 回(細菌の懸濁液と希釈 1:1 であろう) ために必要な最高の濃度で CAMHB で実用的なソリューションに抗生物質の株式を希釈します。この例では、16 mg/mL に 10 mg/mL から両方の株式を希釈します。 マルチ チャンネル ピペットを使用して、明確な丸底、未処理の 96 ウェル プレートの最初の列には井戸に抗生物質懸濁液 x 2 のそれぞれの 100 mL を追加し、列目以降の各ウェルに (すなわち、抗生物質) なしプレーン スープ 50 mL を追加します。 抗生物質を含む 50 mL を削除それぞれからスープも最初の列と 2 列目のウェルに追加。ピペットを上下に数回半分抗生物質濃度を生成するコンテンツを混在させることの最初の列に集中します。 2.2.2.4 各列でのステップを繰り返して、シリアルの 2 倍希釈をそれぞれ 50 mL の量のシリーズを用意しています。抗生物質の持ち越しの可能性を排除するために必要な場合は、各希釈段階間ヒントを変更ピペット。その後細菌懸濁液を希釈 1:1 となります結果濃度が最終濃度 x すべてのまだ 2 であることに注意してください。 負と成長コントロール列になります、最終的な 2 つの列に任意の抗生物質を追加しないでください。 細菌懸濁液を準備します。 手順 1.2.1.5-1.2.1.6 で説明したようにエシェリヒア属大腸菌ATCC 25922 で 0.9% の塩化ナトリウムの一晩板から 0.5 マクファーランド懸濁液を準備します。 CAMHB 7.5 mL を 50 mL の懸濁液を追加することによって 0.5 マクファーランド懸濁液の 1: 150 希釈を行います。注:最終の細菌懸濁液希釈 1: 300 となりますそれは 5 x 105 CFU/mL27CLSI 推奨細胞密度に到達、抗生物質溶液を 1:1 の混合)。 マイクロ プレートに細菌を加えて孵化させなさい。 11th列の各ウェルに以外の細菌懸濁液 50 mL を追加します。CAMHB の 50 mL を 11番目列 (ネガティブ コントロール列) に追加します。 16-20 h 35 ° C でプレートを孵化させなさい。注:腸内細菌科以外の生物がテストされている; 場合、インキュベーションの別の有効期間が必要生物固有の推奨事項の CLSI M10025を参照してください。 視覚的に透過光を用いた成長用プレートを読むし、各抗生物質のため成長はありません最低濃度を決定します。これは、マイクです。マイク26の視覚的な解釈の詳細については、CLSI M07 ドキュメントを参照してください。マイクが予想される QC の範囲内にある場合、原液は使用適しています。 初期培養を開始します。 0.5 を作る生殖不能の 0.9% で試験生物のマクファーランドを懸濁液として塩化ナトリウムは上記します。 マクファーランド懸濁液 5 ml CAMHB の 25 × 150 mm のガラスにラウンド ステンレス鋼の閉鎖とミックスに優しく渦下培養管 0.5 100 mL を追加します。 滅菌接種ループ分離連勝して接種純度を確認し、, 大気中の 35 ° C で血液寒天培地プレート上に希薄懸濁液のドロップを使用してください。 閉鎖チューブを交換し、(手順 2.6.1 参照) 対数相成長に到達するまで、少なくとも 3 時間の周囲の空気の 35 ° C でシェーカーで試験管ラックで孵化させなさい。文化のインキュベーター中 2.4 の手順に進みます。 ガラス培養管 25 mm × 150 mm で抗菌ソリューションを準備します。 雪解けに-80 ° C のフリーザーから抗菌株式因数を取り出します。抗生物質を確保するため一度融解したもの渦ソリューションは。 初期文化が培養中 5 オートクレーブ 25 × 150 mm のガラス文化のチューブに CAMHB 10 mL を追加し、抗菌溶液を次のように追加します。注:必要があります相乗効果の研究では、少なくとも 1 つの薬剤、成長に影響しない濃度で個別にカーブ28これは、相乗効果の研究の前に個々 の薬剤濃度に及ぼす影響を評価することによって決定できます。 チューブ 1: ターゲットの最終的な抗菌薬濃度を取得抗生物質 #1 の適切な量を追加します。この場合、これはこの例で使用するひずみに対して効果的ではない濃度として 10 mL、1 Mg/ml の濃度が最終コリスチン 1 mg/mL コリスチン株式を追加します。 チューブ 2: テストする最後の抗生の集中を取得する抗生物質の #2 の適切な量を追加します。この場合、この例で使用されているひずみに対して効果的です濃度 1 mg/mL の濃度が最後に 1 mg/mL ミノサイクリン株式の 10 mL を追加します。 チューブ 3: 抗生物質 #1 、抗生物質 #2 チューブ 1 と 2 で使用されるのと同じ量を追加します。この場合、1 mg/mL ミノサイクリン株式の 10 mL と 1 mg/mL コリスチン株式の 10 mL を追加します。 チューブ 4: を追加しない抗生物質;これは成長制御管になります。 チューブ 5: を追加しない抗生物質;これは否定的な制御管になります。 シリアル希薄の 2 mL 井戸 96 ウェルマイクロプレート ポリプロピレン板を準備するには、行 B H 列 1-5 のマルチ チャンネル ピペットに 900 μ L の滅菌 0.9% 塩化ナトリウムを追加します。 開始接種材料を準備し、チューブに追加します。 初期の文化は、対数増殖期 (肺炎桿菌、この例で使用されている生物の ~ 3 h) に達したら、培養管を削除、シェーカーから渦優しく、〜 1 mL の懸濁液の管に転送 12 × 75 mm ガラス文化とマクファーランド リーダーと密度を確認します。 場合未満 1.0 マクファーランドは、シェーカーにリターン チューブとより長く孵化します。マクファーランド 1.0 より大きい場合は、チューブに CAMHB を追加渦優しく、再サンプル、懸濁液が 1.0 マクファーランドになるまで繰り返します。 チューブ 1 4 1.0 マクファーランド懸濁液 100 mL と渦をそっと追加します。 それぞれの文化から因数をサンプルし、シリアルの 10 倍希釈を行います。 (管に細菌を追加) した直後に時間 0、1、2、4、6、24 h で、滅菌ピペット チップだけ割り切れる撤退中にチューブと無菌ではない pipettor シャフトではありませんが入力されるように、管を傾けることによって各カルチャ チューブから 150 mL 分注を削除します。事前に準備された 96 ディープウェル プレートの最初の行に連続して井戸にそれぞれ因数を追加します。各時点での因数を削除した直後に 35 ° C 周囲の空気のインキュベーターでシェーカーで試験管ラックにチューブを返します。 マルチ チャンネル ピペットを使用して、行 A から 100 mL を削除、行 (0.9% 塩化ナトリウムの 900 mL を含む) の B に追加し、上下に 4-5 回をピペット、1:10 を作成するミックス希釈。虚偽の高コロニー数につながることができる細菌のキャリー オーバーを防ぐために各希釈段階を次のヒントを破棄します。 行 B H 行ごとに新しいピペット チップの 2.7.2 のステップを繰り返します。 プレートは、コロニー カウント ドロップ プレート法29,30を使用してサンプルを希釈しました。 ミューラー ・ ヒントン寒天抗生物質条件とめっきされる希釈ラベル マルチ チャンネル ピペットと長めのヒント (ヒントが懸濁液に達することを確認) を使用して、1 列の各ウェルから 10 mL を削除し、適切にラベル付けされたプレートの上に連続で慎重に調剤します。小さな (直径 100 mm) 板を使用する場合プレートあたり 3 行 (それぞれ単一列の行 A H から滴から成る) を分配します。(150 φ) 大皿プレートあたりの 8 行を調剤します。 完全に乾燥するが値下がりしましたを許可する (~ 15 分)。 24 h で、無菌試験にプレートの 1 つの指定された領域のネガティブ コントロール チューブから直接撮影した 10 mL のドロップを配置します。板を反転し、周囲の空気に 35 ° C で一晩インキュベートします。 コロニーをカウントし、細胞密度を計算します。ダブル カウントまたは不足している植民地を避けるためにプレートの裏面にファイン ・ チップの永久的なマーカーと植民地をマークします。 まず、純度プレートを確認し、隔離されたコロニーがテストされている生物の予想される形態との一貫性のある単一の形態であることを確認します。 各希釈系列 3-30 植民地 (通常希釈系列ごとに 1 つのドロップ) で滴を特定します。これらの低下のコロニーをカウントし、希釈倍率と一緒にカウントを記録します。 3 30 植民地で希釈系列の低下しない場合、カウントの最後の一滴の植民地 > 30 の植民地との最初のドロップ < 3 植民地 (これらは隣接する低下する必要があります)。 各希釈系列のサンプルでは次の数式を使用してドロップでコロニー数に基づくコロニー (CFU/mL) の 1 ミリリットルあたりの単位数を計算: CFU/mL = n(1/d) (100) nは、コロニーの数dは希釈倍率 (原液サンプル (A 行) の 1、0.1 または 10-1最初 1:10 の希釈 (列 B)、0.01 または 10-2第二 1:10 の希釈 (C の行) と、実際の定数 100 アカウントをドロップ量私s 10 mL、最終値 CFU/mL、すなわち、CFU/1,000 mL の中。このプロセスを簡素化するコロニー カウントから CFU/mL を計算する数式を含むワークシートを使用します。 希釈系列どこよりも 1 つのドロップは数えられる (または 2 滴いたためにカウントされるドロップ落ちない範囲で)、すべてカウント低下の最終的な CFU/mL 数の平均値します。 検出下限値は 300 CFU/mL (原液ドロップ 3 植民地)、レコードとプロット コロニー カウント £300 CFU/mL の希釈系列があるので < 原液ドロップ 3 植民地。 検査時間 24; から不妊コントロール ドロップこのドロップで任意の成長を観察すると、実験の結果は使用しないでください。 グラフし、結果の分析します。 3 つの抗生物質を含む文化と同じグラフで成長制御から成長曲線をプロットします。X軸とy軸に対数目盛を使用して CFU/mL に時間をプロットします。 24 時組み合わせチューブと 24 時間で最もアクティブな単一エージェント CFU/mL の差を計算します。違いは ≥2 ログ10場合の組み合わせは相乗効果の検討してください。24 時と時間 0 の組み合わせのチューブの CFU/mL の違いを計算すること。違いが 3 ログ10の場合の組み合わせは殺菌の検討してください。