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Immunology and Infection

Synergie antimicrobienne essais par le jet d’encre imprimante-assisted damier automatisé Array et la méthode de temps-détruisent manuelle

Published: April 18, 2019
doi:
10.3791/58636
,
1Department of Pathology,Beth Israel Deaconess Medical Center, 2Division of Infectious Diseases,Boston Children’s Hospital, 3Harvard Medical School

Summary

Test de synergie antimicrobiens est utilisée pour évaluer l’effet de deux ou plusieurs antibiotiques utilisés en combinaison et est généralement effectuée par l’une des deux méthodes : le tableau de damier ou l’analyse temps-détruisent. Nous présentons ici une automatisée, technique de jet d’encre imprimante-assisted damier tableau synergie et une étude classique temps-détruisent synergie.

Abstract

Comme le taux de pharmaco-résistante pathogènes (MDR) continuent d’augmenter, dépassant ainsi le développement de nouveaux antimicrobiens, de nouvelles approches pour le traitement des bactéries de TB sont de plus en plus une nécessité. Une telle approche est polythérapie, dans lequel deux ou plusieurs antibiotiques sont utilisés ensemble pour traiter une infection contre qui un ou les deux des médicaments peuvent être inefficaces seul. Quand les deux médicaments, en combinaison, exercent un plus grand que l’effet additif, ils sont considérés comme synergiques. Une étude in vitro des activité synergique est une première étape importante dans l’évaluation de l’efficacité possible de combinaisons de médicaments. Deux méthodes principales de synergie in vitro ont été développés : le tableau de damier et l’étude de temps-détruisent. Dans cet article, nous présentons une méthode de tableau de damier automatisé qui utilise la technologie d’impression jet d’encre pour augmenter l’efficacité et la précision de cette technique, mais aussi une méthode standard manuel temps-détruisent synergie. Le tableau automatisé damier peut servir comme un essai de criblage à haut débit, tandis que l’étude de temps-détruisent manuel fournit des données supplémentaires et complémentaires sur la mise à mort et activité synergique.

Le tableau de damier est une modification du standard concentration minimale inhibitrice (CMI) stable, dans lequel les bactéries sont incubées avec des antibiotiques à des combinaisons de concentration différente et évalués pour l’inhibition de la croissance après une nuit d’incubation. Une performance manuelle du tableau damier exige une série laborieuse et sujette aux erreurs des calculs et des dilutions. Dans la méthode automatisée, présenté ici, le calcul et la distribution de la solution antibiotique nécessaire volumes sont automatisées grâce à la technologie d’imprimante à jet d’encre. Dans l’analyse temps-détruisent synergie, les bactéries sont incubées avec les antibiotiques d’intérêt, ensemble et individuellement et échantillonnées à intervalle régulier au cours des 24 h de culture quantitative. Les résultats peuvent déterminer si une combinaison est synergique et savoir si elle est bactéricide et fournir des données sur l’inhibition et l’assassinat de bactéries au fil du temps.

Introduction

La propagation de pathogènes bactériens de pharmaco-résistante (MDR), en particulier les bactéries gram négatif MDR comme résistant aux carbapénèmes Enterobacteriaceae (CRE), a laissé des cliniciens avec options de plus en plus limitées pour une thérapie réussie anti-infectieux 1, un problème aggravé par le rythme lent de la découverte de nouveaux médicaments antibactériens2,3. Synergie antimicrobienne, dans lequel deux médicaments utilisés en combinaison exercent un effet plus qu’additifs, offre la possibilité de récupération des antibiotiques existants destinés au traitement des bactéries MDR, même lorsque ces bactéries sont résistantes à un ou les deux les antibiotiques individuellement. Les techniques décrites dans cet article fournissent deux méthodes complémentaires de synergie in vitro tests qui, utilisés ensemble, permettre aux enquêteurs d’efficacement écran antimicrobien combinaisons d’intérêt des preuves d’activité synergique (l’automatisé la méthode tableau damier) et ensuite de continuer à évaluer la cinétique de l’inhibition et l’assassinat témoigne des combinaisons prometteurs identifiés dans l’étape de la présélection (la méthode de temps-détruisent manuelle).

Une des méthodes plus couramment utilisés de synergie in vitro test est le test de tableau de damier, une modification de la concentration minimale inhibitrice (CMI) essai dans lequel l’activité inhibitrice des deux antibiotiques différents contre une bactérie isoler sont testés une gamme de concentration combinaisons4,5. Si les deux médicaments exercent une plus grande que l’activité additif utilisés ensemble, la combinaison est considéré comme synergique6. Cependant, la mise en place un tableau de damier manuellement implique une série de calculs et de diluant et de pipetage des étapes laborieuses et vulnérables à l’erreur humaine. Ces contraintes ont eu pour effet de limiter l’utilisation de synergie essais principalement à l’évaluation rétrospective des petits nombres de combinaisons antibiotiques et isolats bactériens, et les résultats n’ont pas toujours été cohérentes entre les études7, 8,9,10,11. En outre, la complexité des tests de synergie a contribué à son indisponibilité dans le laboratoire de microbiologie clinique et à la quasi-absence de données d’essais in vitro synergie provenant d’études cliniques de thérapie de combinaison12, 13.

Afin d’accroître l’efficacité et le débit de la méthode array de damier, nous fait utiliser une technique de test MIC automatisée précédemment développée dans notre laboratoire qui utilise la technologie d’impression à jet d’encre précisément et distribuer toujours petits volumes de solution antibiotique dans les puits dans une plaque de microtitration14. La plate-forme élimine la nécessité pour les calculs complexes et multiples de pipetage. Le logiciel associé calcule et distribue les volumes appropriés d’antibiotiques pour créer un tableau bidimensionnel damier si l’utilisateur entre simplement la gamme de concentration souhaitée et de la concentration de la solution mère des antibiotiques. Nous avons initialement testé cette méthode contre une collection d’ isolats CRE15 et par la suite ont mis l’accent sur les tests de colistine contenant des combinaisons pour activité contre les souches résistantes à la colistine,16. Colistine est un médicament de dernier recours généralement réservé pour une utilisation dans le traitement de la résistance MDR pathogènes Gram-17,18et la colistine rend déjà MDR bactéries presque résistant pan19, ce qui les rend idéales candidats pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques à l’aide de médicaments à laquelle ils sont insensibles individuellement. Nous avons trouvé que la combinaison de la colistine et la synthèse de protéine inhibiteur antibiotique minocycline avait un taux très élevé de synergie, même contre des souches qui résistaient à chacun de ces médicaments individuellement, sans doute parce que la colistine exerce une subinhibitrices perméabiliser effet sur les bactéries même résistantes à la colistine. Nous avons choisi cette combinaison d’utiliser à titre d’exemple dans cet article. De note, synergie tests peuvent aussi servir à évaluer pour une efficacité accrue de deux médicaments qui sont à la fois efficace individuellement.

La méthode array et damier automatisée facilite la synergie rapide et à haut débit stable. Toutefois, la méthode array et damier a des limites. Comme test mis à jour le MIC, il fournit des données uniquement sur l’inhibition de la croissance bactérienne et non sur la mise à mort, et il ne fournit pas de données sur les effets antibiotiques au fil du temps. Par contre, la performance manuel des tests de temps-détruisent synergie est plus beaucoup de travail mais fournit des informations sur l’inhibition et de meurtre sur un temps de 24 h cours20,21. Nous avons utilisé le temps-détruisent l’analyse sur un petit nombre d’isolats à confirmer nos résultats tableau de damier et de déterminer si les combinaisons synergétiques, que nous avons identifié également bactéricides.

Les deux méthodes de synergie damier array et temps-détruisent fournissent des renseignements précieux sur l’activité des associations de médicaments et sont particulièrement utiles pour évaluer les éventuelles nouvelles options thérapeutiques pour hautement résistant aux bactéries pathogènes. Les méthodes ont également des limitations inhérentes. La méthode de dilution MIC standard étaient a une gamme connue erreur attendue de 1 double dilution22, qui est accrue lorsque les deux médicaments sont testés ensemble dans un tableau de damier. Attendus de la définition standard de synergie, qui estime qu’une combinaison synergique, uniquement si les médicaments sont actifs au quart leurs respectifs MICs6, prend en compte cette variabilité, mais cette variabilité (qui est probablement le résultat d’une combinaison de variations biologiques et techniques23) inévitablement génère incertitude quant à la fiabilité des résultats de synergie. L’absence de normes de contrôle de la qualité établies pour le test de synergie est également une limitation de courant. Peut-être la plus importante limitation de toutes les méthodes de test de synergie est l’absence de corrélations établies entre les résultats obtenus in vitro et les résultats cliniques lorsque les combinaisons sont utilisées pour traiter les patients24. Synergie plus simple et plus rapide, tester des méthodes, telles que la méthode array et damier automatisé décrit ici, peut faciliter l’intégration de synergie in vitro test dans des essais cliniques ou autres évaluations portant sur des patients afin de mieux caractériser la relation entre les effets in vitro et in vivo à l’avenir.

La méthode array damier automatisé que nous vous présentons ici vous propose une option pour le criblage à haut débit d’une variété de combinaisons et permet une évaluation rapide des combinaisons inhabituelles, de « haut risque-haute récompense » sans un important investissement de temps et ressources. La méthode de temps-détruisent, qui nous le démontrer par la suite, peut fournir des renseignements supplémentaires à l’appui sur l’activité synergique de l’ensemble et permettre de caractériser son activité bactéricide et antibactérien cinétique.

Protocol

Mise en garde : Utilisez les procédures de sécurité appropriées lorsque vous travaillez avec des bactéries. Porter des gants et une blouse en permanence. Effectuer des travaux dans une biosécurité armoire si aérosols seront générés ou travaille avec des agents pathogènes risque élevé. Remarque : Vingt à 24 h avant de commencer les expériences, le streak sur l’isolate(s) bactérienne à tester sur une gélose au sang (provenant d’un stock de colonie purifié, minimalement subcultures congelé à-80 ° C dans un bouillon trypticase soja avec stock de glycérol à 50 %). Incuber les plaques à 35 ° C dans l’air ambiant. 1. imprimante jet d’encre-assistée automatisé damier tableau synergie Faire des solutions antimicrobiennes stocks (colistine et la minocycline). Déterminer les concentrations de solution stock antibiotique basé sur la solubilité des antibiotiques et souhaité la concentration finale dans le tableau de damier. Faire des stocks de 10 mg/mL de colistine et minocycline pour cet exemple. Utilisez le document CLSI M100 pour déterminer des solvants appropriés pour chaque antibiotique25. La colistine et minocycline sont solubles dans l’eau ; parce que l’imprimante jet d’encre D300 nécessite l’ajout d’agent tensio-actif pour bon fluides aqueux, dissoudre les antibiotiques dans l’eau déionisée ultrapure avec 0,3 % polysorbate 20. Peser poudre antibiotique à l’aide d’une balance analytique et calculer le volume de solvant nécessaire pour obtenir la concentration stock objectif. Si l’antibiotique est fourni sous forme de sel (sulfate de colistine, chlorhydrate de minocycline, etc.) ou sous forme hydratée (p. ex. meropenem trihydrate), ou si elle est déclarée par le fabricant à avoir moins que 100 % de pureté, procèdent à un calcul de puissance26 au déterminer la quantité de solvant nécessaire. Suivez cet exemple du chlorhydrate de minocycline avec une pureté indiquée de 900 mg/mg :Test de pureté : 900 mg/mgLa teneur en eau : aucunFraction active : 0.926 (obtenu en divisant le poids moléculaire de la minocycline (457.48 Da) par le poids moléculaire du chlorhydrate de minocycline (493.94 Da)).Puissance = (test de pureté) * (1 – teneur en eau) * (fraction active)= (900 mg/mg) * (1) * (0,926) = 833,4 mg/mg ou 83,34 %Alors déterminer le volume de solvant nécessaire comme suit :Volume (mL) = [poids (mg) * puissance (mg/mg)] ÷ [Concentration (mg/mL)]Ainsi, par exemple, si 34,7 mg de poudre de chlorhydrate de minocycline est pesé, utiliser le calcul suivant pour déterminer le volume de solvant nécessaire pour faire une solution de 10 mg/mL :Volume = (34,7 mg) * (833.4 mg/mg) = 2,89 mL10 000 mg/mL Verser la poudre antibiotique dans un tube conique de 15 mL et ajouter le volume approprié de l’eau, plus 0,3 % polysorbate 20. Vortex jusqu’à dissolution. Solution stock antibiotique aliquote en tubes de microcentrifuge de 0,5 mL et conserver à-80 ° C jusqu’au moment de l’utilisation. Effectuer des contrôle qualité (CQ) des stocks de l’antimicrobiens pour une utilisation dans des expériences de tableau damier au moins un jour avant le synergie test pour que le QC résultats peuvent être évalués avant d’utiliser le stock pour le test de synergie.REMARQUE :La technique QC décrite ici est identique à la technique qui serait utilisée pour les essais de concentration minimale inhibitrice (CMI) de médicaments individuels et peut être utilisée comme tel avec les souches d’intérêt à l’enquêteur.Préparer une suspension bactérienne. Prélever une partie aliquote de chaque action antibiotique sortis du congélateur-80 ° C pour commencer à décongeler tout en préparant une suspension bactérienne. Vortex après décongélation, pour s’assurer que l’antibiotique est en solution. Sélectionner une souche appropriée de QC et de déterminer la plage acceptable des MIC pour les médicaments mis à l’essai basé sur tableau 5 a-1 à CLSI M10025. Pour les médicaments ici, utiliser e. coli ATCC 25922 ; les intervalles MIC pour cette souche sont 0,25-1 mg/mL pour la minocycline et 0,25-2 mg/mL pour la colistine. Sélectionner une plage de concentrations d’antibiotique à tester qui comprendra toute la gamme QC. Utilisez la gamme de 0,0156 mg/mL à 8 mg/mL pour la minocycline et la colistine pour ATCC 25922. Ajouter 1 mL de chlorure de sodium 0,9 % à un 12 mm x 75 mm rond fond verre tube à culture. Sélectionnez une ou deux colonies dans une assiette pendant la nuit de ATCC 25922 et vortex doucement à suspendre. Vérifier la concentration de bactéries à l’aide d’un lecteur de McFarland. Ajustez au besoin en ajoutant plus de chlorure de sodium 0,9 % ou plus de bactéries d’atteindre une turbidité de McFarland 0,5 lecture. Réaliser une dilution au 1 : 300 de la suspension de McFarland 0,5 en ajoutant 100 mL de la suspension à 30 mL de bouillon Mueller-Hinton ajusté cation (CAMHB) dans un tube conique de 50 mL pour atteindre une densité finale de 5 x 105 UFC/mL, tel que recommandé par CLSI27. En utilisant une boucle inoculation stérile, strie isolement une goutte de l’inoculum de départ sur une gélose au sang pour confirmer la pureté de l’inoculum et incuber à 35 ° C dans l’air ambiant. Antimicrobiens s’ajoute une plaque 384 puits à fond plat, puits carré, claire, non traitée à l’aide de la D300. Effectuez cette étape immédiatement après la préparation de suspension bactérienne permettant la suspension peut être ajoutée aux plaques de moins de 15 min de préparation,26. Allumez l’imprimante jet d’encre D300 et l’ordinateur associé. Ouvrez le logiciel. Commencer un nouveau fichier. Au-dessus de l’image de la grille de la plaque, faites un clic droit sur la plaque 1 , puis choisissez modifier la plaque. Sélectionnez le type de plaque approprié (384 puits) et le volume supplémentaire (50 mL). Ajouter des liquides (p. ex., antibiotiques encours) au protocole en cliquant sur le signe plus en regard de fluides sur le panneau de gauche. Ajouter deux fluides (colistine et la minocycline). Placez le curseur sur le panneau qui est apparu pour fluide 1, puis cliquez sur le crayon pour modifier. Nommez le fluide « Colistine », changer de classe à « aqueuse + Tween 20″, modifier la Concentration de 10 000, puis changez les unités de concentration en mg/mL (note que stock concentration est 10 mg/mL, par exemple, 10 000 mg/mL). Laissez y Dispense bà Concentration et laisser le reste des champs à leurs paramètres par défaut. Cliquez sur OK. Répétez la procédure ci-dessus pour fluide 2 (minocycline). Cliquez sur l’onglet Protocole actuel en haut de l’écran et remplacez Concentration (masse) mg/mL pour déterminer les unités utilisées pour la concentration finale bien aux antibiotiques. Sélectionnez 10 puits dans la grille en cliquant et glissant, puis cliquez sur titrage en haut de l’écran. Pour spécifier à l’aide de la titration sélectionnez concentration la plus élevée, pour fluide choisissez colistine, à Plus forte Concentration entrer 8 (Assurez-vous que les unités sont mg/mL) et pour la Distribution Sélectionnez 1:2 (50 %). Laisser par défaut les valeurs en place pour le reste de la fenêtre et cliquez sur OK. Répétez la procédure ci-dessus pour la minocycline générer le titrage de la minocycline. Enregistrez le protocole et puis cliquez sur le bouton exécuter en haut à gauche. Cliquez sur le bouton Démarrer . Charger une plaque 384 puits (avec couvercle enlevé) dans le support de plaque et appuyez sur Loaded sous la « charge plaque 1 – synergie » rapide.Remarque : Cette invite est choisie par le logiciel et n’indique pas que le test de synergie est en cours. Placer une cassette T8 + dans la fente de la cassette et Loaded sous la charge une cassette T8 + rapide. Lorsque vous êtes invité, ajouter une solution antibiotique stock réservoirs indiquée sur la cassette. Suivez les instructions à l’écran de chargement et répartir avec soin pour éviter les bulles dans la solution. Après que chaque solution est ajoutée, appuyez sur la touche de enfumées . Une fois que l’imprimante jet d’encre a ajouté stock antibiotique dans les volumes appropriés à chaque puits et la boîte exécuter terminé s’affiche, cliquez sur fermer, retirer la plaque et couper le D300. Ajouter des suspensions bactériennes pour plaques 384 puits et incuber la plaque. Versez la suspension bactérienne préalablement préparée dans un réservoir stérile. Utiliser une pipette multicanaux pour ajouter 50 mL de la suspension bactérienne dans tous les puits contenant des antibiotiques. Ajouter 50 mL de CAMHB sans bactéries dans un puits vide ; ce sera le témoin négatif bien à confirmer la stérilité des médias. Placer la plaque dans une étuve à 35 ° C l’air ambiant et incuber pendant 16 à 20 h26.Remarque : Une durée différente d’incubation peut-être être nécessaire si les organismes autres que les entérobactéries sont testés ; consulter CLSI M10025 recommandations par organisme. Lisez la plaque sur un lecteur de microplaques à une densité optique de 600 (OD600) et analyser les résultats. À l’aide d’un tableur, ombrer les cellules avec une valeur de600 OD de ≥0.07 vert, indiquant la croissance et les cellules d’une valeur de < 0,07 rouge, n’indiquant aucune croissance.NOTE : Ces valeurs ont été déterminées en fonction après l’examen visuel de la croissance par rapport à aucune croissance et corrélation avec des lectures d’OD pour ces expériences ; Lectures de600 OD de puits contenant des médias seulement ont été constamment inférieure à 0,07. Les seuils appropriés peuvent différer par des bactéries et des lecteurs de plaques différentes. Déterminer le MIC pour chaque médicament. Le micro est la plus faible concentration de drogue au cours de laquelle la croissance bactérienne est inhibée. Si le micro est dans les limites prévues de QC selon le CLSI M100 document25, la solution est conçue pour fonctionner. Préparer une suspension bactérienne pour tableau de damier. Prélever une partie aliquote de chaque action antibiotique sortis du congélateur-80 ° C pour commencer à décongeler tout en préparant une suspension bactérienne. Vortex après décongelé, afin d’assurer l’antibiotique est en solution. Ajouter environ 1 mL de chlorure de sodium 0,9 % à un 12 mm x 75 mm rond fond verre tube à culture. Sélectionnez une ou deux colonies dans une plaque d’une nuit ou plus de bactéries (dans ce cas, souche d’e. coli FDA-CDC 0494) et vortex doucement à suspendre dans le chlorure de sodium 0,9 %. Vérifier la concentration de bactéries à l’aide d’un lecteur de McFarland. Ajustez au besoin en ajoutant plus de chlorure de sodium 0,9 % ou plus de bactéries d’atteindre une turbidité de McFarland 0,5 lecture. Réaliser une dilution au 1 : 300 de la suspension de McFarland 0,5 en ajoutant 100 mL de la suspension pour 30 mL de CAMHB dans un tube conique de 50 mL pour atteindre une densité finale de 5 x 105 UFC/mL27. Antimicrobiens s’ajoute une plaque 384 puits à fond plat, puits carré, claire, non traitée à l’aide de la D300.Remarque : pour effectuer l’installation immédiatement après la préparation de suspension bactérienne permettant la suspension peut être ajoutée aux plaques en 15 minutes de préparation,26. Allumez l’imprimante jet d’encre, commencer un nouveau fichier et ajouter les liquides au protocole comme étapes 1.2.2.1-1.2.2.3. Générer la grille de synergie. Cliquez sur l’icône de synergie en haut de l’écran et passer à travers les étapes. Pour Type , sélectionnez deux ou plusieurs fluides pris en compte ensemble. Pour la plaque, il n’est pas nécessaire d’exclure n’importe quel puits ; Cliquez sur suivant dans cette étape sans apporter de modifications. Sous l’onglet de titrage , entrez les concentrations d’antibiotique et de placement. Afin d’ajouter la minocycline en diminuant les dilutions doublement de 32 à 0,031 mg/mL, en plus bien négatif avec aucun antibiotique, vers le bas de l’axe des y , entrez 12 niveaux de titrage sur le panneau de gauche. Pour spécifier à l’aide de titrage, sélectionnez la concentration la plus élevée ; pour fluide, sélectionnez Minocycline ; pour la concentration la plus élevée, entrez 32 (Assurez-vous que l’appareil est fixé à mg/mL ; si ce n’est pas, fermez la boîte de dialogue de synergie et modifier sous l’onglet Protocole actuel ). Assurez-vous que la case de valeur comprennent 0 est cochée. Changer Distribution à 1 / 2 (50 %). Répétez ces étapes pour colistine sur le panneau de droite, à l’aide de 12 niveaux de titrage et une plus forte concentration de 16. Cliquez sur suivant. Sous l’onglet disposition , choisissez des niveaux de titrage des 2 premiers fluides déterminant le nombre de lignes et de colonnes dans une grille de mise en page. Cliquez sur suivant. Si la grille s’affiche comme prévu, cliquez sur terminer. Enregistrer le protocole, puis cliquez sur le bouton exécuter en haut à gauche. Cliquez sur le bouton Démarrer . Charger une plaque 384 puits (avec le couvercle enlevé) dans le support de plaque et appuyez sur Loaded sous la plaque de charge 1 – synergie rapide. Placer une cassette T8 + dans la fente de la cassette et Loaded sous la charge une cassette T8 + rapide. Lorsque vous êtes invité, ajouter une solution antibiotique stock réservoirs indiquée sur la cassette. Suivez les instructions à l’écran de chargement et répartir avec soin pour éviter les bulles dans la solution. Après que chaque solution est ajoutée, appuyez sur la touche de enfumées . Une fois que le distributeur D300 a ajouté stock antibiotique dans les volumes appropriés à chaque puits et la boîte exécuter terminé s’affiche, cliquez sur quitter, retirer la plaque et éteindre le D300. Ajouter des suspensions bactériennes pour plaques 384 puits et incuber la plaque. Versez la suspension bactérienne préalablement préparée dans un réservoir stérile. Utiliser une pipette multicanaux pour ajouter 50 mL de la suspension dans tous les puits dans le tableau de damier. Ajouter 50 mL de CAMHB sans bactéries dans un puits vide ; ce sera le témoin négatif bien à confirmer la stérilité des médias. Incuber dans un incubateur de l’air ambiant de 35 ° C pendant 16 à 20 h26. Lire la plaque sur un lecteur de microplaques à OD600 et analyser les résultats du tableau damier. Tout d’abord, vérifiez la plaque de pureté et que les colonies isolées soient d’une morphologie unique qui correspond à la morphologie attendue de l’organisme mis à l’essai. À l’aide d’un tableur, ombrer les cellules pour n’indiquer aucune croissance et comme au point 1.2.4.1. Déterminer le MIC pour chaque médicament. Pour un médicament qui n’inhibe pas la croissance bactérienne à la concentration la plus élevée, la MIC est réputée hors échelle. Pour chaque puits dans lequel la croissance est inhibée, déterminer la concentration inhibitrice fractionnaire (FIC) pour chaque antibiotique issu MIC de cet antibiotique (voir Figure 1 b et 2 b de la Figure).Remarque : La FIC est le rapport entre la concentration d’antibiotique dans un puits dans lequel la croissance est inhibée à son micro ; ainsi, pour un médicament avec un micro de 8 mg/mL, un bien contenant 8 mg/mL de cette drogue a un FIC de 1, alors qu’un bien contenant 4 mg/mL a un FIC de 0,5. Calculer la valeur d’index (FICj’ai) concentration inhibitrice fractionnaire pour chaque puits dans lequel la croissance est inhibée par la somme des FICs de chacun des médicaments dans ce puits. Déterminer la plus faible FICj’ai au cours de laquelle la croissance est inhibée (minimum FICj’ai). Si le minimum FICj’ai £0,5, envisagez la combinaison synergique ; Si 0,5 à 4, considèrent que le jumelage indifférent ; et si > 4, considèrent que le jumelage antagonistes. Si la combinaison est synergique à certaines combinaisons de concentration mais antagonistes à d’autres, note ce résultat, mais considèrent que le jumelage globalement antagonistes. 2. temps-détruisent Synergy test Faire des solutions antimicrobiennes de stock. Si cette étape est effectuée avant l’expérience, congeler à-80 ° C, les stocks jusqu’au prêt à l’emploi. Déterminer les concentrations de solution stock antibiotique basé sur la solubilité des antibiotiques et souhaité la concentration finale dans les études de temps-détruisent. Dans cet exemple, faites des stocks de colistine et minocycline à une concentration de 1 mg/mL. Utilisez le document CLSI M100 pour déterminer des solvants appropriés pour chaque antibiotique25. Utiliser de l’eau, comme l’a recommandé, pour colistine et la minocycline. Peser poudre antibiotique à l’aide de la balance analytique et calculer le volume de solvant nécessaire pour obtenir la concentration stock objectif. Si nécessaire, effectuer un calcul de puissance avant de déterminer la quantité de solvant nécessaire, tel que décrit à l’étape ci-dessus 1.1.2.1. Verser la poudre antibiotique 15 mL tubes coniques et ajouter la quantité appropriée d’eau. Vortex jusqu’à dissolution. À l’aide de la méthode de microdilution bouillon manuelle décrite dans CLSI M0726, effectuer QC d’antimicrobien les stocks destinés à la fois tuent des expériences de synergie. Effectuez cette étape au moins un jour avant le test pour que le QC résultats peuvent être passés en revue avant d’utiliser le stock de synergie. Sélectionner une souche appropriée de QC et de déterminer la plage acceptable des MIC pour les médicaments mis à l’essai basé sur tableau 5 a-1 à CLSI M10025. Pour les médicaments ici, utiliser e. coli ATCC 25922 ; les intervalles MIC pour cette souche sont 0,25-1 mg/mL pour la minocycline et 0,25-2 mg/mL pour la colistine. Préparer le bouillon contenant antibiotique microdilution plaques. Sélectionnez la plus forte concentration d’antibiotique à tester toute la gamme QC peut donc être incluse. Utiliser une gamme de 0,016 à 8 mg/mL pour la minocycline et la colistine pour ATCC 25922. Diluer les stocks d’antibiotiques pour une solution de travail en CAMHB à deux fois la plus forte concentration nécessaire (car il sera dilué 1:1 avec la suspension des bactéries). Dans cet exemple, diluer les deux stocks de 10 mg/mL à 16 mg/mL. À l’aide d’une pipette multicanaux, ajouter 100 mL de chacune des 2 x suspensions antibiotiques dans un puits dans la première colonne d’une plaque de 96 puits claire, fond rond, non traitée et ajouter 50 mL de bouillon clair (c.-à-d. sans antibiotique) dans chaque puits des colonnes suivantes. Prélever 50 mL antibiotique contenant du bouillon de chaque bien dans la première colonne et ajouter aux puits dans la deuxième colonne. Pipette de monter et descendre plusieurs fois pour mélanger le contenu, générant une concentration d’antibiotique la moitié de la concentration dans la première colonne. Répétez l’étape 2.2.2.4 avec chaque colonne, afin qu’une série de dilutions en série double, chacune avec un volume de 50 mL, est établie. Pipette de changement conseils entre chaque étape de dilution, si vous le souhaitez afin d’éliminer la possibilité de report de l’antibiotique. Notez que les concentrations qui en résultent sont tous encore 2 x les concentrations finales, car ils seront ensuite dilué 1:1 avec une suspension bactérienne. N’ajoutez pas de n’importe quel antibiotique pour les deux dernières colonnes, car ce seront les colonnes de contrôle négatif et la croissance. Préparer une suspension bactérienne. Préparer une suspension de McFarland 0,5 d’une plaque d’une nuit d’e. coli ATCC 25922 à 0,9 % de chlorure de sodium comme décrit dans les étapes 1.2.1.5-1.2.1.6. Réaliser une dilution au 1 : 150 de la suspension de McFarland 0,5 en ajoutant 50 mL de la suspension à 7,5 mL de CAMHB.Remarque : La suspension bactérienne finale sera dilué 1 : 300 une fois qu’il se mélange 1:1 avec la solution antibiotique, pour atteindre la densité cellulaire CLSI-recommandé de 5 x 105 UFC/mL,27). Ajouter des bactéries dans la microplaque et incuber. Ajouter 50 mL de la suspension bactérienne dans chaque puits, sauf dans le 11ème colonne. Ajouter 50 mL de CAMHB à la 11ième colonne (colonne de contrôle négatif). Incuber les plaques à 35 ° C pendant 16 à 20 h.Remarque : Une durée différente d’incubation peut-être être nécessaire si les organismes autres que les entérobactéries sont testés ; consulter CLSI M10025 recommandations par organisme. Lire la plaque de croissance visuellement à l’aide de lumière transmise et, pour chaque antibiotique, déterminer la concentration minimale dans lequel il n’y a pas de croissance ; Il s’agit de la MIC. Consulter le document CLSI M07 pour plus de détails sur l’interprétation visuelle de MIC26. Si le micro est dans les limites prévues de QC, la solution est conçue pour fonctionner. Commencer la culture initiale. Faire un 0,5 McFarland suspension d’organisme d’essai stérile 0,9 % NaCl comme décrit ci-dessus. Ajouter 100 mL de la 0,5 McFarland suspension à 5 mL de CAMHB dans un verre de 25 mm x 150 mm rond tube à culture bas avec fermeture en inox et vortex doucement pour mélanger. En utilisant une boucle inoculation stérile, strie isolement une goutte de la suspension diluée sur une gélose au sang pour confirmer la pureté de l’inoculum et incuber à 35 ° C dans l’air ambiant. Remplacer la fermeture sur tube et incuber dans un rack de tube à essai sur un agitateur à 35 ° C dans l’air ambiant pendant au moins 3 h, jusqu’à ce que la phase logarithmique de croissance est atteint (voir étape 2.6.1). Passez à l’étape 2.4, tandis que la culture est dans l’incubateur. Préparer des solutions antimicrobiennes dans 25 mm x 150 mm tubes de culture de verre. Sortez antimicrobiens aliquotes stocks du congélateur-80 ° C à dégeler. Vortex après décongelé, afin d’assurer l’antibiotique est en solution. Alors que la culture initiale est en incubation, ajouter 10 mL de CAMHB à cinq tubes de culture de verre stérilisés à l’autoclave 25 x 150 mm et ajouter des solutions antimicrobiennes de stock comme suit.Remarque : Pour une étude de synergie, au moins une drogue doit être à une concentration qui n’affecte pas la croissance courbe individuellement28; Ceci peut être déterminé en évaluant les effets de concentrations de médicament avant l’étude synergie. Tube 1 : Ajouter la quantité appropriée d’antibiotique #1 pour obtenir la concentration d’antibiotique cible finale. Dans ce cas, ajouter 10 mL de 1 mg/mL de bouillon de colistine pour obtenir une concentration finale de colistine de 1 mg/mL, il s’agit d’une concentration qui est inefficace contre la souche utilisée dans cet exemple. Tube 2 : Ajouter la quantité appropriée d’antibiotique #2 pour obtenir la concentration finale d’antibiotique à tester. Dans ce cas, ajouter 10 mL de 1 mg/mL de bouillon de minocycline pour obtenir une concentration finale de 1 mg/mL, une concentration qui est inefficace contre la souche utilisée dans cet exemple. Tube 3 : Ajouter la même quantité d’antibiotiques #1 et antibiotique #2 tel qu’utilisé dans les tubes 1 et 2. Dans ce cas, ajouter 10 mL de stock de minocycline 1 mg/mL et 10 mL de 1 mg/mL de bouillon de colistine. Tube 4 : n’ajouter aucun antibiotique ; ce sera le tube de contrôle de la croissance. Tube 5 : n’ajouter aucun antibiotique ; ce sera le tube de contrôle négatif. Préparer des 96 plaques puits profond en polypropylène avec puits de 2 mL pour les dilutions en série en ajoutant 900 µL de chlorure de sodium à 0,9 % stérile aux lignes B-H des colonnes 1 à 5 avec une pipette multicanaux. Préparer l’inoculum de départ et ajouter dans les tubes. Une fois que la culture initiale a atteint la phase de croissance logarithmique (~ 3 h pour Klebsiella pneumoniae, l’organisme utilisé dans cet exemple), enlevez le tube à culture le shaker, vortex transférer doucement, ~ 1 mL de suspension sur un tube de culture en verre de 12 mm x 75 mm, et vérifier la densité avec un lecteur de McFarland. Si elle est inférieure à 1,0 McFarland, retourner le tube à l’agitateur et incuber plus. Si elle est supérieure à 1,0 McFarland, ajouter CAMHB dans le tube, vortex doucement et ré-échantillonner, répéter le processus jusqu’à ce que la suspension est à 1,0 McFarland. Ajouter 100 mL de la suspension de McFarland 1,0 à tubes 1-4 et vortex doucement. Échantillon des aliquotes de chaque culture et procéder série dix fois les dilutions. Au temps 0 (immédiatement après l’ajout de bactéries aux tubes) et à 1, 2, 4, 6 et 24 h, prélever un 150 mL aliquote de chaque tube à culture en inclinant le tube afin que seule la pointe de pipette stérile entre le tube et non l’arbre non stériles multipipette durant le sevrage de l’aliquote. Ajouter aliquotes, respectivement, aux puits consécutives dans la première ligne de la plaque de puits profonds 96 préalablement préparée. Retour tubes à un support de tube à essai sur un agitateur dans une étuve à 35 ° C l’air ambiant immédiatement après avoir enlevé les parties aliquotes à chaque instant. À l’aide d’une pipette multicanaux, prélever 100 mL de rangée A, ajouter à la ligne B (qui contient 900 mL de chlorure de sodium 0,9 %) et pipeter haut et en bas 4 ou 5 fois au mélange, créant un 01:10 dilution. Jeter des trucs après chaque étape de dilution afin d’éviter le report des bactéries, ce qui peut conduire à des comptages de colonies faussement élevées. Répétez l’étape 2.7.2 pour lignes B-H avec nouvelles pointes de pipette pour chaque ligne. Plaque dilué des échantillons pour le dénombrement des colonies à l’aide de la méthode de plaque goutte29,30. Étiqueter les boîtes de gélose de Mueller-Hinton avec les conditions de l’antibiotiques et la dilution à être plaquée. À l’aide d’une pipette multicanaux avec embouts extra longue (pour s’assurer que la pointe atteint en suspension), prélever 10 mL de chaque puits dans la colonne 1 et répartir soigneusement d’affilée sur la plaque correctement identifiée. Si les plaques légères (100 mm de diamètre) sont utilisés, distribuer 3 rangs (chacun étant constitué de gouttes de lignes A-H d’une colonne unique) par plaque ; sur les grandes plaques (150 mm de diamètre), diluer 8 rangs par plaque. Permettre aux gouttes sécher complètement (~ 15 min). Après 24 h, déposez une goutte de 10 mL prélevée directement du tube de contrôle négatif dans un secteur indiqué de l’une des plaques pour tester la stérilité. Inverser les plaques et incuber une nuit à 35 ° C dans l’air ambiant. Dénombrer les colonies et calculer la densité cellulaire. Marquer les colonies avec un marqueur permanent pointe fine au verso de la plaque pour éviter la double comptabilisation ou manquants de colonies. Tout d’abord, vérifiez la plaque de pureté et que les colonies isolées soient d’une morphologie unique qui correspond à la morphologie attendue de l’organisme mis à l’essai. Pour chaque série de dilution, identifier les gouttes avec 3-30 colonies (en général une goutte par série de dilution). Compter les colonies dans ces gouttes et d’enregistrer le nombre ainsi que le facteur de dilution. S’il n’y a aucune gouttes dans une série de dilutions avec 3-30 colonies, compter les colonies dans la dernière goutte avec > 30 colonies et la première goutte avec < 3 colonies (ceux-ci devraient être adjacentes gouttes). Pour chaque série de dilution, calculer le nombre de colonies formant des unités par millilitre (UFC/mL) dans l’échantillon en fonction du nombre de colonies dans le menu déroulant en utilisant la formule suivante : UFC/mL = n(1 /d) (100) où n est le nombre de colonies, d est le facteur de dilution (1 pour l’échantillon non dilué (ligne A), 0,1 ou 10-1 pour le premier 01:10 dilution (ligne B), 0,01 ou 10-2 pour le deuxième 01:10 dilution (ligne C) et ainsi de suite et les constantes 100 comptes pour le fait que le volume total de la goutte j’ai s 10 mL, tandis que la valeur finale est exprimée en UFC/mL, c’est-à-dire CFU/1 000 mL. Utiliser une feuille de calcul contenant des formules permettant de calculer l’UFC/mL de comptage des colonies à simplifier ce processus. Pour des séries de dilution où plus d’une goutte est dénombrable (ou où deux gouttes ne devait être compté car aucune goutte est tombée dans la gamme), en moyenne les chiffres définitifs de la CFU/mL pour tous les drops comptés. Parce que la limite inférieure de détection est de 300 UFC/mL (3 colonies dans la goutte non diluée), enregistrement et intrigue comptage des colonies comme £300 UFC/mL pour des séries de dilutions dans lequel il y a < 3 colonies dans la goutte non diluée. Inspecter la chute de contrôle de stérilité de temps 24 ; Si toute croissance est observée dans cette baisse, les résultats de l’expérience ne devraient pas servir. Graphique et analyser les résultats. Tracer les courbes de croissance de trois cultures contenant des antibiotiques et le contrôle de la croissance sur le même graphe. Tracer temps sur l’axe x et l’UFC/mL, à l’aide d’une échelle logarithmique, sur l’axe y . Calculer la différence en UFC/mL entre le tube de combinaison à la fois 24 et la monothérapie plus actif en temps 24. Si la différence est ≥ 2 log10, envisagez la combinaison synergique. Puis calculer la différence entre le tube de combinaison à la fois 24 et au temps 0 UFC/mL. Si la différence est ≥3 journal10, considèrent que le jumelage est bactéricide.

Representative Results

Figure 1 a présente une grille d’une expérience de synergie damier en tableau dans lequel minocycline dans des concentrations de 0-32 μg/mL a été combinée avec la colistine aux concentrations de 0-16 μg/mL et testé contre e. coli , souche 0494 FDA-CDC. Les valeurs représentent des lectures spectrophotométriques à densité optique 600 nm (OD600). Puits avec valeurs600 OD inférieures à 0,07 (ce qui correspond à aucune croissance en inspection visuelle) sont ombrés de rouge, tandis que les puits avec des valeurs de600 OD 0,07 (ce qui correspond à la croissance par inspection visuelle) sont d’un vert ombragé. Pour chaque médicament, la concentration minimale inhibitrice (CMI ; en gras) est la plus faible concentration de médicament qui inhibe la croissance bactérienne. Pour la minocycline, il s’agit de 32 μg/mL et de colistine, c’est 8 μg/mL. L’ombrage est retenue dans la Figure 1 b, mais les valeurs dans les puits où la croissance est inhibée sont remplacées par les valeurs fractionnaires concentration inhibitrice de l’indice (FICj’ai). Elles sont déterminées comme suit : dans chaque puits, l’indice de concentration inhibitrice fractionnaire (FIC) de chaque médicament est calculé en divisant la concentration d’antibiotique dans ce puits de MIC de la drogue, et la FIC j’est calculé en additionnant les deux FICs. Puits avec une valeur FICj’ai de 0,5, ce qui est considéré comme le seuil pour la synergie, sont indiqués par une bordure de ligne brisée, et le puits avec le FICj’ai valeur la plus basse (0,094) est en caractère gras. Parce que la valeur minimale FICj’ai est dans la gamme synergique, la combinaison est considérée synergique. Figure 2 a et 2 b de la Figure montrent grilles analogues à ceux de la Figure 1 a et 1 b de la Figure, mais dans ce cas la combinaison ne démontre pas une synergie contre l’isolat testé (isolat deK. pneumoniae 4 BIDMC), parce que le minimum FICj’ai au cours de laquelle la croissance est inhibée est 1, ce qui est > 0,5. La figure 3 illustre les valeurs de densité optique d’une grille de synergie damier où plusieurs puits ignorés est survenu (Enterobacter cloacae complexe isolat BIDMC 27). Ignoré les puits sont puits dans lequel la croissance bactérienne est inhibée malgré la présence de la croissance bactérienne dans les puits adjacents avec des concentrations plus élevées d’antibiotique. Ce phénomène, qui est connu pour se produire dans la norme MIC test ainsi, est probablement due à la variabilité biologique caractéristiques de croissance bactérienne de bien de bien et à la sensibilité de certains antibiotiques aux petites différences l’inoculum bactérien23 , 31 , 32. si plus d’un ignoré bien a eu lieu dans un tableau de damier, nous avons jeté les résultats et répété le test. Figure 4 présente des exemples de résultats de temps-détruisent synergie de trois combinaisons testées contre K. pneumoniae isolent BIDMC 32. Dénombrement des colonies est indiqués dans une échelle logarithmique sur y-axe et durée, en heures, sur le x-axe. La différence entre l’inoculum de départ dans le tube contenant la combinaison de médicaments et de la concentration des bactéries dans ce tube à 24h est illustrée par la barre rouge et le nombre, alors que la différence entre la concentration de bactéries à 24 h entre le tube contenant la combinaison et le tube contenant le plus actif en monothérapie seule est illustrée par la barre bleue et le nombre. Figure 4 a montre les résultats de la combinaison de la colistine et la minocycline ; Cette combinaison était synergique (différence entre les concentrations de bactéries exposées à combinaison et a plus actifs agent ≥2 seul journal10 UFC/mL après 24 h) et bactéricide (baisse de démarrer inoculum à concentration à 24h ≥3 journal10 CFU/mL). Figure 4 b montre provient de la combinaison de la colistine et la clindamycine, une combinaison synergique mais n’était pas bactéricide. Cette combinaison inhibe la croissance des bactéries, qui ni drogue fait seul, mais ne le tue pas eux. Figure 4 montre les résultats de la combinaison de la colistine et l’érythromycine, qui n’était ni bactéricide ni synergique. Figure 1 : Tableau de damier résultats démontrant synergie (minocycline + colistine testé contre e. coli de souche 0494 FDA-CDC). (A) par spectrophotométrie lecture et croissance interprétation d’un tableau de damier. Valeurs des cellules sont des valeurs de densité optique à 600 nm (OD600). Cellules OD600 valeur inférieure à 0,07 (correspondant à aucune croissance par inspection visuelle) sont ombrés de rouge, tandis que les cellules avec des valeurs de600 OD 0,07 (correspond à une croissance par inspection visuelle) sont vert ombragé. Calcul (B) de l’indice (FICj’ai) concentration inhibitrice fractionnaire. Ombrage, indiquant la croissance ou n’a été retenue. Valeurs de colistine et minocycline le long de x- et y-axes, respectivement, maintenant représentent la concentration inhibitrice fractionnaire (FIC) ou le rapport entre la concentration du médicament dans cette colonne ou cette ligne à la concentration minimale inhibitrice ( MIC) de ce médicament seul. La valeur de chaque cellule est la FICje, ou la somme des FICs des deux médicaments dans ce puits. La grosse boîte bordés de ligne brisée entoure puits avec une FICj’ai de 0,5. La cellule de bordure épaisse indique le puits avec le plus bas FICj’ai dont la croissance est inhibée ou le minimum FICj’ai. Parce que le minimum FICj’ai est de 0,5, la combinaison est considérée synergique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 2 : Résultats de tableau damier d’une combinaison qui ne démontre pas de synergie (minocycline + colistine testé contre K. pneumoniae isoler 4 BIDMC). Valeurs de densité optique (A) à 600 nm et croissance l’interprétation des résultats de tableau de damier tel que décrit à la Figure 1 a. (B) calcul de l’indice (FICj’ai) concentration inhibitrice fractionnaires comme décrit à la Figure 1 a. Étant le minimum FICj’ai > 0,5, la combinaison n’est pas considérée synergique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 3 : Résultats tableau damier ininterprétables due à sauté puits (minocycline + colistine testé contre Enterobacter cloacae complexe isolat BIDMC 27). Valeurs de densité optique à 600 nm et croissance l’interprétation des résultats de tableau de damier tel que décrit à la Figure 1 a. Plusieurs puits ignorés, dans lequel la croissance bactérienne est inhibée malgré la présence de la croissance dans les puits adjacents avec des concentrations plus élevées d’antibiotique, sont démontrés. Résultats ne sont pas interprétables et experiment doit être répété. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 4 : Temps-détruisent les résultats de synergie de trois combinaisons testées contre K. pneumoniae isolat BIDMC 32. Dénombrement des colonies est indiqués dans une échelle logarithmique sur y-axe et durée, en heures, sur le x-axe. La différence entre la concentration de bactéries dans la combinaison après 24 h et l’inoculum de départ dans le tube est illustrée par la barre rouge et le nombre. Si le déclin de démarrer inoculum à concentration à 24h est ≥3 journal10 UFC/mL, la combinaison est considéré comme bactéricide. La différence entre la concentration de bactéries à 24 h entre le tube contenant la combinaison et le tube contenant le plus actif en monothérapie seule est illustrée par la barre bleue et le nombre ; s’il y a ≥ 2 log10 réduction UFC/mL, la combinaison est considéré comme synergique. (A) colistine (CST) + minocycline (MIN), une combinaison synergique et bactéricide. (B) colistine + clindamycine (CLI), une combinaison synergique mais pas bactéricide. (C) colistine + érythromycine (ERY), une combinaison qui est synergique ni bactéricide. Ces résultats ont été publiés initialement dans le cadre d’une étude de l’activité synergique colistine contenant des combinaisons contre résistant à la colistine Enterobacteriaceae, dans laquelle nous avons démontré que colistine est synergique avec un certain nombre de antibiotiques qui sont actifs individuellement seulement (p. ex. la clindamycine) ou principalement (p. ex. érythromycine) contre les bactéries gram-positives,16. (Notez que l’érythromycine est synergique de tableau damier contre la souche montrée, mais pas de temps-détruisent, si elle a été choisie ici comme un exemple d’une combinaison non-synergique.) Nous avons émis l’hypothèse que colistine, qui est connu pour agir par perméabilisation de la membrane externe Gram-négative, exerce un effet perméabilisant Sub-inhibitrice sur les bactéries gram-négatives résistant à la colistine, permettant l’entrée de drogues comme la clindamycine qui normalement ne peut pas entrer la cellule Gram négative. Panneau (A) de cette figure a été modifié par Brennan-Krohn, Pironti et Kirby 201816, tous droits réservés © American Society for Microbiology, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 62(10), 2018, pii : e00873-18, doi : 10.1128/AAC.00873-18. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Les deux méthodes décrites ici tous deux fournissent des informations sur l’activité des antimicrobiens utilisés en combinaison par rapport à leur activité. Le numérique automatisé, d’assistée par imprimante jet d’encre méthode de distribution est une adaptation de la méthode décrite dans le manuel de procédures de microbiologie clinique33, tandis que la méthode de temps-détruisent suit de plus près le protocole correspondant de la même référence34.

Dans la méthode array et damier, calculs pour déterminer le volume d’antimicrobiens stock à ajouter à chaque puits nécessaire ainsi que la distribution de ces volumes est automatisé, ce qui élimine certaines des principales sources potentielles de l’erreur s’est produite dans un manuel tableau de damier. Il faut toujours, cependant, que l’enquêteur détermine que les stocks originaux sont faits à la concentration prévue et que la concentration finale de but est correctement tapée dans le logiciel de D300. Ajouter la suspension antimicrobiens à Herbert George wells dans une plaque 384 puits peut être difficile au début et nécessite des soins pour assurer cette pipette conseils entrer dans les puits appropriés et ce liquide ne pas éclabousser jusqu’à les bords des puits. Un gestionnaire automatisé de liquid peut être utilisé à la place une pipette multicanaux à main pour augmenter la vitesse et la précision avec laquelle la suspension bactérienne est ajoutée aux puits. Comme décrit dans le protocole, le D300 nécessite l’ajout du surfactant, polysorbate 20 (P-20), pour la manipulation de liquides appropriée. Un autre surfactant, polysorbate 80, à une concentration de 0,002 %, a été noté pour abaisser la colistine micros organismes avec micros colistine de < 2 µg/mL lors d’essais de microdilution bouillon standard. 35 , 36 notre laboratoire précédemment démontré que P-20 à des concentrations atteignant 0,0015 % n’avait aucun effet sur MIC D300 assistée résultats en comparaison avec les BMD14de référence. Dans l’exemple de l’analyse présentée ici, la P-20 maximale est concentration 0,0014 %.

Un des problèmes rencontrés avec certains tests de tableau damier a été un grand nombre de puits ignorés. Cela s’est produit à un taux disproportionné avec certains antibiotiques. Plus précisément, sur un écran de combinaisons contre une collection de résistant aux carbapénèmes Enterobacteriaceae, nous avons constaté que tout en 49 521 Trials (9,4 %) sont inutilisables en raison de multiples puits ignorés, 2 des 12 antibiotiques testés (fosfomycine et céfépime) représentés 46 de ces essais (94 %). Ces taux accrus peut-être être plus susceptibles à des médicaments qui sont particulièrement sensibles à l’inoculum effet31,32,37. À noter, CLSI ne recommande pas d’essais fosfomycine en bouillon dilution25 en raison de préoccupations concernant la fiabilité des résultats avec cette méthode, qui peut expliquer les résultats non fiables vus avec ce médicament. Quelques modifications sont possibles à damier automatisé méthode selon la préférence du chercheur. Antimicrobiens peuvent être servis en plaques contenant déjà une suspension bactérienne, plutôt que dans des puits vides, si cela est préférable pour des raisons de flux de travail au sein du laboratoire. Alors que les plaques 384 puits étaient utilisées ici, la méthode peut également effectuée lors d’essais de plaque à 96 puits avec des modifications appropriées du volume bien. L’utilisation d’un format de plaque à 96 puits peut-être contribuer à réduire puits ignorés pour les antibiotiques qui sont particulièrement sensibles aux faibles variations de l’inoculum. Lors du calcul des FICj’ai, il peut y avoir des situations où le MIC est hors échelle (c.-à-d., plus haut que testés), y compris les situations où le médicament testé n’a aucune activité individuellement contre le type d’organisme mis à l’essai. Dans ces cas, la FIC peut être calculée en supposant que le micro est une dilution plus élevée que la concentration la plus élevée. C’est la stratégie la plus conservatrice, car elle suppose la valeur maximale de la FIC possible pour toute dilution où l’inhibition est observée durant les essais de synergie. Par exemple, si le MIC réel était plutôt deux dilutions doublement ci-dessus la concentration la plus élevée testée, puis les FICs correspondantes serait deux fois plus faible que les affectations de conservateurs et ainsi de suite.

Afin d’évaluer avec précision l’activité bactéricide des médicaments dans un essai de temps-détruisent, il est essentiel que les cultures soient en phase logarithmique de croissance, en particulier lorsque des antibiotiques actifs pariétaux sont testé28. Pour les bactéries à croissance rapide, utilisés dans cet exemple (K. pneumoniae), 3 heures d’incubation avec agitation était appropriée pour atteindre cette phase de croissance, mais des quantités différentes de temps peuvent être nécessaires pour différents organismes. En général, la culture doit apparaître visiblement mais pas fortement Turbide. Le laps de temps approprié peut être déterminé en construisant une courbe de croissance avec des comptages de colonies prises à temps série points (par exemple, toutes les 30 min pendant 4-6 h)38. L’inoculum de départ prévue dans l’étude de temps-détruisent est également important. La concentration de la cible de l’inoculum de départ est d’environ 5 x 105 à 1 x 106 UFC/mL. La dilution décrite ici (100 μl d’une suspension de McFarland 1,0 dans 10 mL de médias) génère cet inoculum pour Klebsiella pneumoniae et autres espèces d’entérobactéries sur lequel nous avons testé. Si la densité de l’inoculum départ lors d’une expérience à l’aide de différents organismes est sensiblement supérieur ou inférieur à cela, une dilution différente peut être nécessaire. (La dilution appropriée requise pour une espèce donnée peut être déterminée en effectuant une teneur en germes d’une suspension de McFarland 0,5 ou 1,0 pour déterminer les organismes combien représente cette turbidité, puis en calculant le montant par lequel la suspension initiale doit être dilué pour atteindre la concentration finale appropriée). Si, lors du contrôle des dénombrements de l’étude synergie, l’inoculum de départ de le quelconque des tubes contenant des antibiotiques est considéré comme ayant été significativement plus faible que l’inoculum de départ de la contrôle de la croissance, cela peut signifier un report de l’antibiotique ou très tueur rapide de bactéries dans le bref délai entre l’ajout de bactéries dans le tube contenant des antibiotiques et l’enlèvement de l’aliquote pour l’électrodéposition. Si le nombre réel des colonies dans la goutte non diluée dans une série est plus faible que le nombre de colonies dont les dilutions successives, cela suggère un effet report de l’antibiotique. Différentes options ont été décrites pour prévenir cet effet, y compris répandant une aliquote unique sur une plaque entière38 ou filer vers le bas de l’échantillon, éliminer le surnageant et re-suspension dans une solution saline stérile avant électrodéposition39. À chaque instant dans la méthode de temps-détruisent, il est également essentiel pour le chercheur à efficacement mais précisément enlever une partie aliquote de chaque tube à culture et effectuer des dilutions successives. Retards au cours de ce processus, en particulier pendant les premiers points dans le temps qui se produisent successivement, peuvent conduire à des périodes prolongées au cours de laquelle les cultures ne sont pas été incubés et secoué, tandis que la distribution imprudente et les dilutions en série peuvent conduire à plaque inexacte chefs d’accusation. Par rapport à la méthode propagation de la plaque de plaque de comptage, dans lequel 100 μl de chaque dilution est étalé sur une gélose au complet, la méthode de plaque chute décrite est beaucoup plus rapide, requiert un nombre beaucoup plus restreint de plats d’agar et permet un comptage plus rapide, comme le maximum un nombre dénombrable de colonies pour chaque goutte est 30, alors que jusqu’à 300 colonies se comptent généralement d’une plaque de propagation. Toutefois, la méthode de propagation la plaque est également une option si les enquêteurs ne sont plus à l’aise avec cette technique. Si les gouttes se propagent dans l’autre après avec une pipette multicanaux, application individuelle des plus espacés gouttes avec une pipette à canal unique peut être effectuée à la place. Dans notre expérience, plaques à 4 ° C avant de recueillir les gouttes éjectées de refroidissement semble réduire la dispersion excessive.

Une des limites des techniques décrites ici est que les résultats des deux types de test de synergie (tableau de damier et temps-détruisent) ne sont pas toujours concordantes, et depuis plus des articles publiés synergie utilisent une méthode ou l’autre plutôt que les deux ensemble, elle peut être difficile de savoir comment intégrer des données provenant des deux types d’analyses. Parce que nous avons développé la méthode array et damier automatisé est simple et haut-débit, nous l’avons utilisé en effet comme une sorte d’écran pour tester les combinaisons contre un plus grand nombre d’isolats et déterminer quelles combinaisons de concentration étaient synergiques. Ensuite, nous avons réalisé un plus petit nombre d’études de temps-détruisent, en sélectionnant les combinaisons et les concentrations qui avaient été efficaces dans le tableau de damier. À noter, parce que le damier test est généralement réalisé sur une échelle de dilution étaient, tandis que le dernier temps-détruisent utilise des volumes plus importants (semblables à une dilution de macrobroth), nous avons constaté que les FICs ne différaient parfois entre les deux méthodes, avec plus concentrations généralement nécessaires dans l’épreuve du temps-détruisent pour démontrer l’activité. Ce phénomène a été noté précédemment, lorsqu’on compare les résultats d’analyse MIC de dilution de macrobroth et étaient pour les bacilles à gram négatif26 et quand inoculums plus grandes (comme utilisé dans les études de temps-détruisent) sont comparées avec l’inoculum standard utilisé dans tableau de dilution et damier étaient des analyses de32. Une limitation spécifique du tableau damier est la variabilité inhérente en dilution étaient MIC test22. Tout en FICj’ai les seuils pour compte de la synergie de cette variabilité mathématiquement6 cette variabilité pose inévitablement inquiète de la fiabilité et la cohérence des résultats tableau damier.

En raison des limitations inhérentes à la synergie tout in vitro tests méthodes (y compris la culture des bactéries dans un milieu de culture artificiel, concentrations d’antibiotique statiques et un cours de durée limitée), les résultats obtenus par ces méthodes doivent être confirmées et l’évaluation de l’utilisation de techniques complémentaires. Ces méthodes incluent des études in vitro pharmacocinétique/pharmacodynamique (pharmacocinétique/pharmacodynamique) (p. ex., les fibres creuses infection modèle40), modèles animaux et, finalement, des études Pharmacocinétiques et Pharmacodynamiques et l’efficacité humaines. La méthode array et damier automatisé décrite ici, en offrant une méthode rapide qui aux regroupements d’écran pour activité synergique potentielle, permet plus ciblée l’utilisation de ces techniques. Outre l’automatisation de toutes ces méthodes, comme une investigation plus systématique de la relation entre les paramètres in vitro et les résultats cliniques, sera importante à plus grande échelle jusqu’à l’utilisation de synergie stable et d’accroître son application clinique.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Thea Brennan-Krohn a été appuyée par une Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health et maladies infectieuses pédiatriques de développement humain de la recherche subvention de formation (T32HD055148), National Institute of Allergy et maladies infectieuses formation subvention ( T32AI007061), bourse hôpital bureau de faculté développement carrière professorale pour un enfants de Boston et un Institut National des allergies et maladies infectieuses career development award (1K08AI132716). J.E.K. a été pris en charge par le National Institute of Allergy et des maladies infectieuses de la National Institutes of Health, sous attribution numéro R33 AI119114. Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement l’opinion officielle de la National Institutes of Health.

Materials

Escherichia coli strain ATCC 25922 ATCC 25922 QC strain
0.5 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1605-0000
1 L 0.22 µm bottle-top filter Thermo Scientific Nalgene 597-4520
12 mm x 75 mm borosilicate glass round bottom culture tubes Fisherbrand 14-961-26
15 mL conical tubes Phenix SS-PH15
15 x 100 mm or 15 x 150 mm Mueller Hinton agar plates Thermo Scientific R01620 or R04050
25 mm stainless steel closures for 25 x 150 mm glass culture tubes Bellco 2005-02512
25 x 150 mm borosilicate glass round bottom culture tubes Bellco 2011-25150
348-well sterile clear, flat-bottom, untreated microplates with lids Greiner Bio-One 781186
50 mL conical tubes Phenix SS-PH50
50 mL sterile reagent reservoirs Corning 4870
96 deep well polypropylene microplate with 2 mL wells Fisherbrand 12-566-612
96-well sterile clear, round-bottom, untreated microplates with lids Evergreen 222-8032-01R
Cation adjusted Mueller Hinton broth BD Diagnostics 212322
Colistin sulfate Alfa Aesar J60915
D300e Control Software HP/Tecan
DensiCHEK Plus McFarland reader bioMérieux 21250
Excel spreadsheet software Microsoft
Extra long SHARP 10 µL Precision Barrier Tips Denville Scientific P1096-FR
HP D300 digital dispenser HP/Tecan
HP D300 T8+ cassettes HP/Tecan 30097370
Minocycline hydrochloride Chem-Impex 14302
Picus 12-channel 10-300 µL pipette Sartorius 735461
Polysorbate 20 Fisher Bioreagents BP-337 Brand name: Tween 20
Sodium chloride Fisher Chemical S271
Spectrophotometer Tecan Infinite M1000 PRO
Xplorer 12-channel 50-1200 µL pipette Eppendorf 2231000328
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References

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Brennan-Krohn, T., Kirby, J. E. Antimicrobial Synergy Testing by the Inkjet Printer-assisted Automated Checkerboard Array and the Manual Time-kill Method. J. Vis. Exp. (146), e58636, doi:10.3791/58636 (2019).
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