Sinergia antimicrobiana prueba asistida por la impresora de inyección de tinta matriz tablero automatizado y el método Manual de tiempo de matar
Summary
Prueba de sinergia antimicrobiana se utiliza para evaluar el efecto de dos o más antibióticos se usan en combinación y se realiza generalmente mediante uno de dos métodos: la matriz de tablero de ajedrez o el ensayo de tiempo de matar. Aquí, presentamos un automatizado, de inyección de tinta impresora-asistida tablero matriz sinergia técnica y un estudio clásico matar tiempo de sinergia.
Abstract
Como índices de patógenos multirresistentes de (MDR) continúan aumentando, superando el desarrollo de nuevos antimicrobianos, nuevos enfoques para el tratamiento de bacterias MDR están convirtiendo en una necesidad. Uno de los enfoques es la terapia de combinación, en que dos o más antibióticos se utilizan juntos para tratar una infección contra la cual uno o ambos de los fármacos pueden ser ineficaces solo. Cuando dos fármacos, en combinación, ejercen un mayor que efecto aditivo, se consideran sinérgicos. Investigación in vitro de actividad sinérgica es un primer paso importante en la evaluación de la posible eficacia de combinaciones de fármacos. Se han desarrollado dos métodos de pruebas de sinergia in vitro principal: la matriz de tablero de ajedrez y el estudio de tiempo de matar. En este trabajo presentamos un método de la matriz de tablero automatizado que hace uso de la tecnología de impresión de inyección de tinta para aumentar la eficiencia y la exactitud de esta técnica, así como un método estándar manual sinergia de matar tiempo. La matriz de tablero automatizado puede servir como un ensayo de cribado de alto rendimiento, mientras que el estudio de tiempo-kill manual proporciona datos adicionales y complementarios en matanza y actividad sinérgica.
La matriz de tablero de ajedrez es una modificación del estándar concentración inhibitoria mínima (MIC) de prueba, en el que las bacterias son incubadas con antibióticos en combinaciones de diferente concentración y evaluadas para inhibición del crecimiento después de la incubación durante la noche. Funcionamiento manual de la matriz de tablero de ajedrez requiere una serie de cálculos y diluciones laboriosa y propenso. En el método automatizado presentado aquí, el cálculo y la distribución de la solución madre antibiótico requiere de volúmenes están automatizados mediante el uso de tecnología de impresora chorro de tinta. En el ensayo de sinergia de matar tiempo, bacterias son incubadas con los antibióticos de interés, juntos e individualmente y muestreadas en intervalos a lo largo de 24 h para cultivo cuantitativo. Los resultados pueden determinar si una combinación es sinérgica y si es bactericida y proporcionan datos sobre inhibición y muerte de bacterias con el tiempo.
Introduction
La propagación de patógenos bacterianos de multidrug-resistente (MDR), particularmente MDR las bacterias Gram negativas como enterobacterias resistentes a carbapenem (CRE), ha dejado a los médicos con cada vez más limitadas opciones para la terapia antiinfecciosa exitosa 1, un problema exacerbado por el lento ritmo de descubrimiento de nuevo fármaco antibacteriano2,3. Sinergia antimicrobiana, en el que dos medicamentos en combinación ejercen un efecto mayor que el aditivo, ofrece la posibilidad de recuperación de los antibióticos existentes para el uso en el tratamiento de las bacterias de TB, incluso cuando estas bacterias son resistentes a uno o ambos de los antibióticos individualmente. Las técnicas descritas en este artículo proporcionan dos métodos complementarios de sinergia in vitro pruebas de que, cuando se usan juntos, permiten a los investigadores eficacia antimicrobiana combinaciones de pantalla de interés para la evidencia de actividad sinérgica (automatizado método de matriz de tablero de ajedrez) y luego evaluar la cinética de inhibición y muerte demostrada por combinaciones promisorias identificadas en la etapa de selección (el método manual de tiempo de matar).
Uno de los métodos más utilizados de las pruebas de sinergia in vitro es el análisis de la matriz de tablero de ajedrez, una modificación de las pruebas de concentración mínima inhibitoria (CMI) en el que la actividad inhibitoria de dos antibióticos diferentes contra un bacteriano aislar son probados en un rango de concentración combinaciones4,5. Si los dos fármacos ejercen mayor actividad aditivo cuando se usan juntos, la combinación se considera sinérgico6. Sin embargo, configurar manualmente una matriz de tablero de ajedrez consiste en una serie de cálculos y pasos de dilución y pipetas que son laboriosos y vulnerables al error humano. Estas limitaciones han tenido el efecto de limitar el uso de pruebas principalmente para la evaluación retrospectiva de una pequeña cantidad de combinaciones de antibióticos y aislamientos bacterianos de sinergia y resultados no siempre han sido consistentes entre los estudios7, 8,9,10,11. Además, la complejidad de la prueba de sinergia ha contribuido a su falta de disponibilidad en el laboratorio de microbiología clínica y la ausencia virtual de datos pruebas de sinergia in vitro de los estudios clínicos de terapia de combinación12, 13.
Para aumentar la eficiencia y rendimiento del método de matriz de tablero de ajedrez, hicimos uso de una técnica de prueba automatizada de MIC desarrollada previamente en nuestro laboratorio que utiliza la tecnología de impresión de inyección de tinta para precisamente y consistentemente dispensar volúmenes pequeños de solución madre de antibiótica en los pocillos de una placa de microtitulación14. La plataforma evita la necesidad de cálculos complejos y múltiples pasos de pipeteo. El software asociado calcula y distribuye volúmenes adecuados de antibióticos para crear una matriz de dos dimensiones del tablero de ajedrez si el usuario simplemente entradas de la gama de la concentración deseada y concentración de la solución stock de los antibióticos. Inicialmente probamos este método contra una colección de aislamientos CRE15 y posteriormente se han centrado en pruebas de combinaciones que contienen colistina para actividad contra cepas resistentes a la colistina16. La colistina es un fármaco de último recurso, reservado generalmente para el uso en el tratamiento de la resistencia MDR patógeno gramnegativos17,18y colistina ya hace TB bacterias pan-resistentes casi19, lo que es ideal candidatos para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas con drogas que son insensibles individualmente. Encontramos que la combinación de colistina y la minociclina antibiótico inhibidor de proteína síntesis tenía un índice muy alto de sinergia, incluso contra cepas que eran resistentes a cada uno de estos fármacos individualmente, probablemente porque la colistina ejerce un subinhibitory efecto permeabilizing de bacterias incluso resistentes a la colistina. Hemos elegido esta combinación para usar como ejemplo en este artículo. De nota, prueba de sinergia puede usarse para evaluar para mejorar eficacia de dos fármacos que son eficaces tanto individualmente.
El método de la matriz de tablero automatizado facilita la prueba de sinergia rápido y alto rendimiento. Sin embargo, el método de la matriz de tablero de ajedrez tiene limitaciones. Como un ensayo MIC modificado, proporciona datos sólo en la inhibición del crecimiento bacteriano y no en la matanza, y no proporciona datos sobre los efectos del antibiótico en el tiempo. Por el contrario, funcionamiento manual de ensayos de matar tiempo sinergia es más laborioso pero proporciona información sobre inhibición y muerte por un tiempo de 24 horas curso20,21. Utilizamos análisis de tiempo de matar en un menor número de aislamientos para confirmar nuestros resultados de la matriz de tablero de ajedrez y para determinar si las combinaciones sinérgicas que se identificaron también son bactericidas.
Ambos métodos de sinergia tablero matriz y matar tiempo proporcionan información valiosa sobre la actividad de combinaciones de fármacos y son especialmente útiles en la evaluación de posibles opciones terapéuticas novela para patógenos bacterianos resistentes. Los métodos también tienen limitaciones inherentes. El método de dilución MIC microbroth estándar tiene un rango de error esperado conocido de 1 doble dilución22, que se incrementa cuando dos fármacos se prueban juntos en una matriz de tablero de ajedrez. Espera de la definición estándar de sinergia, que considera que una combinación sinérgica sólo si los fármacos son activos juntos en un cuarto sus respectivos micrófonos6, tiene en cuenta esta variabilidad, pero dicha variabilidad (que se piensa para resultar de una combinación de fluctuaciones biológicas y técnicas23) inevitablemente genera incierto acerca de la fiabilidad de los resultados de la sinergia. La falta de normas de control de calidad establecidas para la prueba de sinergia es también una limitación actual. Quizás la limitación más importante de los métodos de prueba de sinergia es la falta de correlaciones establecidas entre los resultados in vitro y los resultados clínicos cuando se utilizan combinaciones para tratar pacientes24. Sinergia más rápido y más simple prueba métodos como el método de la matriz de tablero automatizado descrito aquí, puede facilitar la integración de sinergia in vitro dentro de ensayos clínicos o de otras evaluaciones de los resultados del paciente la prueba para mejor caracterizar la relación entre in vitro e in vivo efectos en el futuro.
El método de matriz de tablero automatizado que presentamos ofrece una opción para la detección de alto rendimiento de una variedad de combinaciones y permite la evaluación rápida de combinaciones de “alto riesgo-alta recompensa” inusuales, sin una gran inversión de tiempo y recursos. El método de tiempo de matar, que se demuestra posteriormente, puede proporcionar información de apoyo adicional sobre la actividad sinérgica de la combinación y puede ayudar a caracterizar su actividad bactericida y cinética antibacteriano.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los dos métodos descritos aquí ambos proporcionan información sobre la actividad de los antimicrobianos utilizados en combinación, en comparación con su actividad individual. Automatizado, digital asistida por la impresora de inyección de tinta método es una adaptación del método descrito en el manual de procedimientos de microbiología clínica33, mientras que el método de matar tiempo sigue más de cerca el protocolo correspondiente de la misma referencia34.
En el método de la matriz de tablero de ajedrez, cálculos para determinar el volumen necesario de acción antimicrobiana para agregar a cada pozo, así como la distribución de estos volúmenes está automatizado, eliminando algunas de las principales fuentes potenciales de error encontrado en un manual matriz de tablero de ajedrez. Sin embargo, es todavía esencial que el investigador determina que las poblaciones originales se hacen en la concentración prevista y que concentraciones finales objetivo se introducen en el software de la D300 correctamente. Agregar la suspensión antimicrobiana en los pocillos de una placa de 384 pozos puede ser difícil al principio y requiere cuidado para asegurar pipeta consejos entrar en los pocillos adecuados y ese líquido no salpique hasta los bordes de los pozos. Un controlador automático de líquido puede usarse en lugar de una pipeta multicanal portátil para aumentar la velocidad y la precisión con que la suspensión bacteriana se agrega a los pozos. Como se describe en el protocolo, la D300 requiere el agregado de surfactante, polisorbato 20 (P-20), para el adecuado manejo de líquidos. Un surfactante diferentes, polisorbato 80, en una concentración de 0.002%, se ha observado para bajar micrófonos de colistina para organismos con colistina MICs de < 2 μg/mL en caldo estándar microdilución ensayos. 35 , 36 nuestro laboratorio demostrado previamente que P-20 en concentraciones hasta 0.0015% no tuvo ningún efecto en los resultados MIC D300-asistida en comparación con DMO14de referencia. En el ejemplo de análisis presentado aquí, P-20 máxima es concentración es 0,0014%.
Un problema que nos encontramos con algunos ensayos de la matriz de tablero de ajedrez fue un gran número de pozos se saltan. Esto se debía a una tasa desproporcionada con ciertos antibióticos. En concreto, en una pantalla de combinaciones contra una colección de carbapenem-resistentes Enterobacteriaceae, encontramos que mientras 49 de 521 ensayos (9,4%) eran inutilizables debido a los múltiples pozos saltadas, 2 de los 12 antibióticos probados (fosfomicina y cefepime) representaron 46 de estos ensayos (94%). Tal aumento de las tasas puede ser más probable en los medicamentos que son particularmente susceptibles a los efectos de inóculo31,32,37. De nota, CLSI no recomienda pruebas de fosfomicina en caldo dilución25 debido a las preocupaciones sobre la confiabilidad de los resultados con este método, que puede explicar los resultados poco fiables considerados esta droga. Pueden hacerse algunas modificaciones al método de tablero automatizado según las preferencias del investigador. Antimicrobianos pueden dispensar en placas ya que contiene la suspensión bacteriana, más que en los pocillos vacíos, si es preferible por razones de flujo de trabajo dentro del laboratorio. Mientras que aquí se utilizaron placas de 384 pocillos, el método puede también llevarse a cabo en los ensayos de placa de 96 pocillos con modificación apropiada del volumen bien. El uso de un formato de placa de 96 pocillos puede ayudar a reducir pozos omitidas para los antibióticos que son particularmente sensibles a pequeños cambios en el inóculo. Cálculo de FIC, puede haber situaciones donde el micrófono está fuera de escala (es decir, más que probado), incluyendo situaciones donde la droga ensayada no tiene actividad individualmente contra el tipo de organismo sometido a prueba. En estos casos, el FIC puede ser calculado en suponiendo que el MIC es una dilución más alta que la concentración más alta probada. Esta es la estrategia más conservadora, como asume el máximo valor posible de la FIC para cualquier dilución donde se observa inhibición durante la prueba de sinergia. Por ejemplo, si el micrófono real en lugar de otro fueron dos diluciones de doblaje anteriores la concentración más alta prueba, entonces el FICs correspondientes dos veces inferior a las asignaciones de conservadoras y así sucesivamente.
Para evaluar con precisión la actividad bactericida de las drogas en un análisis de tiempo de matar, es fundamental que las culturas en fase logarítmica de crecimiento, particularmente cuando antibióticos activos de la pared celular están siendo probados28. Para las bacterias de rápido crecimiento utilizadas en este ejemplo (K. pneumoniae), 3 horas de incubación con agitación era apropiado para llegar a esta fase de crecimiento, pero diferentes cantidades de tiempo pueden ser necesarios para diversos organismos. En general, la cultura debe aparecer visiblemente pero no muy turbia. La cantidad de tiempo apropiada se puede determinar mediante la construcción de una curva de crecimiento con recuentos de colonias en tiempo serial puntos (por ejemplo, cada 30 minutos durante 4-6 h)38. El inóculo inicial previsto en el estudio de la muerte de tiempo también es importante. La concentración objetivo del inóculo inicial es aproximadamente de 5 x 105 a 1 x 106 UFC/mL. La dilución que se describe aquí (100 μL de una suspensión de McFarland 1,0 en 10 mL de medio) genera este inóculo para Klebsiella pneumoniae y otras especies de Enterobacteriaceae en que nosotros lo hemos probado. Si la densidad del inóculo inicial en un experimento utilizando diferentes organismos es significativamente mayor o menor que esto, puede necesitarse una dilución diferentes. (La dilución necesaria para una determinada especie puede determinarse mediante la realización de un conteo de placa de suspensión McFarland 0.5 o 1.0 para determinar cuántos organismos esta turbidez representa, entonces, calcular el importe por el cual debe ser la suspensión inicial diluido para alcanzar la concentración final adecuada). Si en la revisión de cuentas de la placa desde el estudio de sinergia, el inóculo a partir de cualquiera de los tubos que contienen el antibiótico se encuentra haber sido perceptiblemente más bajo que el inóculo a partir del control de crecimiento, esto puede indicar que cualquier remanente de antibiótico o muy matanza rápida de bacterias en el breve tiempo entre la adición de bacterias en el tubo que contiene el antibiótico y la eliminación de la alícuota para la galjanoplastia. Si el número de colonias en la gota de aceite puro en una serie es menor que el número de colonias en las diluciones subsecuentes, esto sugiere efecto arrastre antibiótico. Se han descrito diferentes opciones para prevenir este efecto, como separar una alícuota única sobre una placa entera38 o girar hacia abajo la muestra, retirar el sobrenadante y vuelva a suspender en solución salina estéril antes de platear39. En cada momento en el método de tiempo de matar, también es fundamental para el investigador eficaz pero precisa extraer una alícuota de cada tubo de cultivo y realizar diluciones seriadas. Retrasos durante este proceso, particularmente durante los primeros momentos que se producen en estrecha sucesión, pueden conducir a períodos prolongados durante los cuales las culturas no son incubados y agitado, mientras que dispensar descuidado y diluciones seriadas pueden llevar a placa incorrecta cuenta. En comparación con el método de placa extensión de conteo de placa, en la que 100 μL de cada dilución se extiende sobre una placa de agar todo, el método de placa gota descrito es mucho más rápido, requiere un número mucho menor de placas de agar y permite contar más rápido, como máximo contable número de colonias por cada gota es 30, mientras que normalmente se puede contar hasta 300 colonias de una placa de expansión. Sin embargo, el método de placa de propagación también es una opción si los investigadores son más cómodos con esta técnica. Si gotas diseminado entre sí después de la dosificación con una pipeta multicanal, aplicación individual de más ampliamente espaciadas gotas con una pipeta monocanal puede realizarse en su lugar. En nuestra experiencia, enfriamiento placas a 4 ° C antes de dispensar las gotas parecía reducir propagación excesiva.
Una limitación de las técnicas descritas aquí es que los resultados de los dos tipos de ensayo de sinergia (matriz de tablero de ajedrez y tiempo de matar) no siempre son concordantes, y puesto que más publicaciones sinergia utilizan un método o el otro en lugar de ambos juntos, puede es difícil saber cómo integrar datos procedentes de los dos tipos de ensayos. Porque el método de la matriz de tablero automatizado que hemos desarrollado es sencillo y alto rendimiento, hemos utilizado lo en efecto como una especie de pantalla para probar combinaciones contra un mayor número de aislamientos y determinar qué combinaciones de concentración fueron sinérgicos. Luego realizamos un número menor de estudios de tiempo de matar, la selección de combinaciones y concentraciones que habían sido eficaces en la matriz de tablero de ajedrez. De nota, porque el ensayo de tablero de ajedrez se realiza típicamente en una escala de dilución microbroth, mientras que el tiempo matar emplea grandes volúmenes (similares a una dilución de macrobroth), encontramos que los FICs a veces eran diferentes entre los dos métodos, con mayor concentraciones generalmente requeridas en el ensayo de matar tiempo para demostrar la actividad. Este fenómeno se ha observado anteriormente cuando se comparan resultados de ensayo MIC de dilución de macrobroth y microbroth para bacilos Gram-negativos26 y cuando inóculos más grandes (como los utilizados en los estudios de tiempo de matar) son comparados con el inóculo estándar utilizado en microbroth dilución y tablero matriz ensayos de32. Una limitación específica de la matriz de tablero de ajedrez es la variabilidad inherente en dilución de microbroth MIC prueba22. Mientras CIE cortes de cuenta de sinergia para esta variabilidad matemáticamente6 tal variabilidad inevitablemente plantea preocupación acerca de la fiabilidad y consistencia de los resultados de la matriz de tablero de ajedrez.
Debido a las limitaciones inherentes a todo in vitro synergy (incluyendo el cultivo de bacterias en un medio artificial de crecimiento, concentraciones de antibióticas estáticas y un curso de tiempo limitado) los métodos de prueba, deben confirmarse los resultados obtenidos por estos métodos y más evaluado mediante técnicas suplementarias. Tales métodos incluyen estudios en vitro farmacocinéticos/farmacodinámicos (PK/PD) (por ejemplo, la fibra hueca infección modelo40), los modelos animales y, en definitiva, los estudios PK/PD y la eficacia en humanos. El método de la matriz de tablero automatizado descrito aquí, proporcionando un método rápido con el que a las combinaciones de pantalla para la actividad sinérgica potencial, permite más objetivo la utilización de estas técnicas. Más automatización de todos estos métodos, como investigación sistemática así como más de la relación entre los parámetros in vitro y los resultados clínicos, serán importante en escala hasta el uso de la sinergia de prueba y aumentar su aplicabilidad clínica.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Thea Brennan-Krohn fue apoyado por un Eunice Kennedy Shriver Instituto Nacional de salud infantil y de enfermedades infecciosas pediátricas desarrollo humano investigación beca de formación (T32HD055148), Instituto Nacional de alergias y enfermedades infecciosas () beca formación T32AI007061), beca de Hospital oficina de Facultad Facultad carrera desarrollo infantil Boston y un Instituto Nacional de alergias y enfermedades infecciosas desarrollo concesión de la carrera (1K08AI132716). J.E.K. fue apoyado por el Instituto Nacional de alergias y enfermedades infecciosas de los institutos nacionales de salud con el número de concesión AI119114 R33. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los institutos nacionales de salud.
Materials
| Escherichia coli strain ATCC 25922 | ATCC | 25922 | QC strain |
| 0.5 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1605-0000 | |
| 1 L 0.22 µm bottle-top filter | Thermo Scientific Nalgene | 597-4520 | |
| 12 mm x 75 mm borosilicate glass round bottom culture tubes | Fisherbrand | 14-961-26 | |
| 15 mL conical tubes | Phenix | SS-PH15 | |
| 15 x 100 mm or 15 x 150 mm Mueller Hinton agar plates | Thermo Scientific | R01620 or R04050 | |
| 25 mm stainless steel closures for 25 x 150 mm glass culture tubes | Bellco | 2005-02512 | |
| 25 x 150 mm borosilicate glass round bottom culture tubes | Bellco | 2011-25150 | |
| 348-well sterile clear, flat-bottom, untreated microplates with lids | Greiner Bio-One | 781186 | |
| 50 mL conical tubes | Phenix | SS-PH50 | |
| 50 mL sterile reagent reservoirs | Corning | 4870 | |
| 96 deep well polypropylene microplate with 2 mL wells | Fisherbrand | 12-566-612 | |
| 96-well sterile clear, round-bottom, untreated microplates with lids | Evergreen | 222-8032-01R | |
| Cation adjusted Mueller Hinton broth | BD Diagnostics | 212322 | |
| Colistin sulfate | Alfa Aesar | J60915 | |
| D300e Control Software | HP/Tecan | ||
| DensiCHEK Plus McFarland reader | bioMérieux | 21250 | |
| Excel spreadsheet software | Microsoft | ||
| Extra long SHARP 10 µL Precision Barrier Tips | Denville Scientific | P1096-FR | |
| HP D300 digital dispenser | HP/Tecan | ||
| HP D300 T8+ cassettes | HP/Tecan | 30097370 | |
| Minocycline hydrochloride | Chem-Impex | 14302 | |
| Picus 12-channel 10-300 µL pipette | Sartorius | 735461 | |
| Polysorbate 20 | Fisher Bioreagents | BP-337 | Brand name: Tween 20 |
| Sodium chloride | Fisher Chemical | S271 | |
| Spectrophotometer | Tecan | Infinite M1000 PRO | |
| Xplorer 12-channel 50-1200 µL pipette | Eppendorf | 2231000328 |
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