Antimicrobica sinergia test viene utilizzato per valutare l’effetto di due o più antibiotici usati in combinazione e viene in genere eseguita da uno dei due metodi: la matrice della scacchiera o il dosaggio di time-kill. Qui, presentiamo un automatizzato, a getto d’inchiostro stampante-assistita scacchiera matrice sinergia tecnica e uno studio classico tempo-kill sinergia.
Come tassi di patogeni di multidrug-resistente (MDR) continuano a salire, superando lo sviluppo di nuovi agenti antimicrobici, nuovi approcci al trattamento di batteri MDR stanno diventando sempre più una necessità. Un tale approccio è la terapia di combinazione, in cui due o più antibiotici sono utilizzati insieme per trattare un’infezione contro cui uno o entrambi i farmaci possono essere inefficaci da solo. Quando i due farmaci, in combinazione, esercitano una maggiore rispetto a effetto additivo, sono considerati sinergici. Ricerca in vitro di attività sinergica è un primo passo importante nel valutare l’eventuale efficacia di combinazioni di farmaci. Due metodi di prova principale sinergia in vitro sono stati sviluppati: la matrice di scacchiera e lo studio di time-kill. In questa carta, presentiamo un metodo di matrice scacchiera automatizzato che fa uso di tecnologia di stampa a getto d’inchiostro per aumentare l’efficienza e la precisione di questa tecnica, come pure un metodo standard manuale sinergia di time-kill. La matrice di scacchiera automatizzato può servire come un test di screening ad alta resa, mentre lo studio di time-kill manuale fornisce dati aggiuntivi, complementari su uccisione e attività sinergica.
La matrice della scacchiera è una modifica di standard concentrazione inibitoria minima (MIC) test, in cui i batteri sono incubati con antibiotici alle combinazioni differenti concentrazioni e valutati per l’inibizione della crescita dopo incubazione overnight. Manuale delle prestazioni della matrice della scacchiera richiede una laboriosa ed error-prone serie di diluizioni e calcoli. Nel metodo automatizzato presentati qui, il calcolo e l’erogazione della soluzione stock antibiotico necessari volumi sono automatizzati attraverso l’uso di tecnologia di stampa a getto d’inchiostro. Nell’analisi della sinergia di time-kill, batteri sono incubati con gli antibiotici di interesse, sia insieme che singolarmente e campionati a intervalli nel corso di 24 h per coltura quantitativa. I risultati possono determinare se una combinazione è sinergica e se è battericida e fornire dati sull’inibizione e uccisione dei batteri nel corso del tempo.
La diffusione di patogeni batterici di multidrug-resistente (MDR), in particolare batteri gram-negativi quali Enterobacteriaceae carbapenem-resistente (CRE), MDR ha lasciato i medici con le opzioni sempre più limitate per la riuscita terapia antinfettiva 1, un problema aggravato dal ritmo lento del romanzo droga antibatterica discovery2,3. Sinergia antimicrobica, in cui due farmaci usati in combinazione esercitano un effetto maggiore di additivo, offre la possibilità di recupero esistenti antibiotici per uso nel trattamento di batteri MDR, anche quando questi batteri sono resistenti a uno o entrambi i gli antibiotici individualmente. Le tecniche descritte in questo articolo forniscono due metodi complementari di sinergia in vitro test che, se utilizzati insieme, consentono gli investigatori a combinazioni di antimicrobici in modo efficiente schermo di interesse per la prova di attività sinergica (automatizzati Metodo della matrice della scacchiera) e quindi di valutare ulteriormente la cinetica di inibizione e di uccisione ha dimostrato dalle combinazioni promettenti individuati nella fase di screening (il metodo manuale di time-kill).
Uno dei metodi più comunemente usati di sinergia in vitro test è il test di matrice della scacchiera, una modificazione della concentrazione minima inibente (MIC) test in cui isolare l’attività inibitoria di due diversi antibiotici contro un batterico sono testati sopra una gamma di concentrazione combinazioni4,5. Se le due droghe esercitano maggiore attività additiva quando utilizzati insieme, la combinazione è considerata sinergico6. Tuttavia, creazione di una matrice di scacchiera manualmente comporta una serie di calcoli e passaggi di diluizione e pipettaggio che sono laboriosi e vulnerabili all’errore umano. Questi vincoli hanno avuto l’effetto di limitare l’uso di sinergia test principalmente per la valutazione retrospettiva di un piccolo numero di combinazioni antibiotiche e isolati batterici e risultati non sono sempre stati coerenti tra studi7, 8,9,10,11. Inoltre, la complessità del test di sinergia ha contribuito alla sua indisponibilità nel laboratorio di microbiologia clinica e per la virtuale assenza di dati di test in vitro sinergia da studi clinici di terapia di combinazione12, 13.
Al fine di aumentare l’efficienza e la velocità effettiva del metodo matrice della scacchiera, abbiamo fatto uso di una tecnica di test automatizzata di MIC precedentemente sviluppata nel nostro laboratorio che utilizza tecnologia di stampa a getto d’inchiostro a proprio e costantemente erogare piccoli volumi soluzione di antibiotico stock nei pozzetti in una piastra di microtitolo14. La piattaforma previene l’esigenza di calcoli complessi e più passaggi di pipettaggio. Il software associato calcola e dispensa volumi appropriati di antibiotici per creare una matrice bidimensionale della scacchiera, se l’utente semplicemente ingressi l’intervallo di concentrazione desiderata e concentrazione della soluzione di riserva degli antibiotici. Abbiamo inizialmente testato questo metodo contro una collezione di CRE isolati15 e successivamente si sono concentrati sulla prova combinazioni contenenti colistina per attività contro gli isolati resistenti colistina16. Colistina è una droga di ultimo ricorso generalmente riservato per l’uso nel trattamento di resistenza MDR patogeni Gram-negativi17,18e colistina rende già MDR batteri quasi pan-resistente19, che li rende ideali candidati per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche, uso di droghe che sono insensibili individualmente. Abbiamo trovato che la combinazione di colistina e la sintesi di proteina inibitore antibiotico minociclina hanno avuti un tasso molto alto di sinergia, anche contro i ceppi che erano resistenti a ciascuno di questi farmaci singolarmente, presumibilmente perché colistina esercita un subinibitorie permeabilizing effetto sui batteri anche colistina-resistente. Abbiamo scelto questa combinazione da utilizzare come un esempio in questo documento. Della nota, sinergia test utilizzabile anche da valutare per una maggiore efficacia dei due farmaci che sono entrambi efficaci singolarmente.
Il metodo di matrice automatizzato scacchiera facilita la sinergia rapid, high throughput test. Tuttavia, il metodo di matrice della scacchiera hanno limitazioni. Come un’analisi modificata di MIC, fornisce dati solo su inibizione della crescita batterica e non per uccidere, e non fornisce dati sugli effetti antibiotici nel corso del tempo. Al contrario, manuale delle prestazioni di time-kill sinergia saggi è più laborioso ma fornisce informazioni su inibizione sia uccisione sopra un 24h tempo corso20,21. Abbiamo usato l’analisi tempo-kill su un minor numero di isolati per confermare i nostri risultati di matrice della scacchiera e per determinare se le combinazioni sinergiche abbiamo identificato erano anche battericide.
Entrambi metodi di sinergia di matrice e tempo-kill scacchiera forniscono preziose informazioni sull’attività di combinazioni di farmaci e sono particolarmente utili nella valutazione di potenziali nuove opzioni terapeutiche per altamente resistente ai batteri patogeni. I metodi hanno anche limitazioni intrinseche. Il metodo di diluizione MIC microbroth standard ha una gamma di noto errore previsto di 1 diluizioni22, che è aumentato quando due farmaci sono testati insieme in una matrice di scacchiera. La definizione standard di sinergia, che considera che una combinazione sinergica solo se i farmaci sono attivi insieme a un quarto loro rispettivi MICs6, prende in considerazione questo previsto variabilità, ma tale variabilità (che è pensata per derivare da una combinazione di fluttuazioni biologiche e tecniche23) inevitabilmente genera incertezza circa l’affidabilità dei risultati di sinergia. La mancanza di standard di controllo di qualità stabiliti per le prove di sinergia è anche una limitazione di corrente. Forse la limitazione più significativa di tutti i metodi di collaudo di sinergia è la mancanza di stabilite correlazioni tra i risultati in vitro e gli esiti clinici quando combinazioni sono usati per trattare i pazienti24. Sinergia di più semplice e più rapido test di metodi, come il metodo di matrice automatizzato scacchiera descritto qui, può facilitare l’integrazione di sinergia in vitro testing all’interno di studi clinici o altre valutazioni di risultati per il paziente al fine di meglio caratterizzare il rapporto tra gli effetti in vitro e in vivo in futuro.
Il metodo di matrice scacchiera automatizzato che presentiamo qui offre un’opzione per high throughput screening di una varietà di combinazioni e tiene conto la valutazione rapida di accostamenti insoliti, di “alto rischio-alta ricompensa” senza un grande investimento di tempo e risorse. Il metodo di time-kill, che dimostriamo successivamente, possa fornire ulteriori informazioni di supporto sull’attività sinergica della combinazione e può aiutare a caratterizzare la sua attività battericida e cinetica antibatterico.
I due metodi descritti qui entrambi forniscono informazioni sull’attività di antimicrobici utilizzati in combinazione rispetto alla loro attività individuali. Automatizzato, digitale a getto d’inchiostro stampante-assistita metodo di erogazione è un adattamento del metodo descritto in Clinical Microbiology procedure manuale33, mentre il metodo time-kill segue più da vicino il protocollo corrispondente dallo stesso fare riferimento a34.
Nel metodo di matrice della scacchiera, i calcoli per determinare il volume necessario di antimicrobici stock per aggiungere a ciascun pozzetto nonché l’erogazione di questi volumi è automatizzato, eliminando così alcune delle principali fonti potenziali di errore in un manuale matrice della scacchiera. È ancora essenziale, tuttavia, che l’investigatore determina che gli stock originali sono rese a concentrazione che intendono e che le concentrazioni finali di obiettivo sono inserite correttamente nel software D300. Aggiungendo la sospensione antimicrobica per pozzetti in una piastra 384 pozzetti può essere difficile in un primo momento e richiede cura per garantire quel pipetta suggerimenti Inserire appositi pozzetti e quel liquido non splash fino ai bordi dei pozzi. Un gestore di liquido automatico utilizzabile in sostituzione di una pipetta multicanale portatile per aumentare la velocità e la precisione con cui la sospensione batterica è aggiunto ai pozzi. Come descritto nel protocollo, la D300 richiede l’aggiunta del tensioattivo, polisorbato 20 (P-20), per la corretta gestione di liquida. Un tensioattivo diverso, polisorbato 80, ad una concentrazione di 0,002%, è stato notato per abbassare il MICs colistina per organismi con colistina microfoni di < 2 µ g/mL in brodo standard microdilution saggi. 35 , 36 il nostro laboratorio precedentemente dimostrato che P-20 alle concentrazioni fino a 0,0015% non ha avuto effetto su D300-assistita MIC risultati in confronto con riferimento BMD14. Nell’esempio saggio presentato qui, la P-20 massima è concentrazione è 0,0014%.
Un problema che abbiamo incontrato con alcuni saggi di matrice della scacchiera era un gran numero di pozzi saltati. Ciò è avvenuto ad un tasso sproporzionato con alcuni antibiotici. In particolare, in una schermata di combinazioni contro una collezione di carbapenem-resistente Enterobacteriaceae, abbiamo trovato che mentre 49 di 521 prove (9,4%) erano inutilizzabili a causa di pozzi multipli saltati, 2 dei 12 antibiotici testati (Fosfomicina e cefepime) rappresentati il 46 di queste prove (94%). Tali tassi aumentati possono essere più probabili in farmaci che sono particolarmente suscettibili alla inoculo effetto31,32,37. Della nota, CLSI non consiglia test fosfomicina in brodo diluizione25 dovuto le preoccupazioni circa l’affidabilità dei risultati con questo metodo, che può spiegare i risultati inaffidabili visti con questo farmaco. Possono essere apportate alcune modifiche al metodo di scacchiera automatizzati in base alle preferenze di investigatore. Antimicrobici possono essere erogati in piastre contenenti già sospensione batterica, piuttosto che nei pozzetti vuoti, se questo è preferibile per ragioni di flusso di lavoro all’interno del laboratorio. Mentre piastre da 384 pozzetti sono state utilizzate qui, il metodo può essere effettuato in saggi di piastra a 96 pozzetti con modifica appropriata del volume ben. L’uso di un formato di piastra a 96 pozzetti può aiutare a wells riducente saltato per gli antibiotici che sono particolarmente sensibili alle piccole variazioni di inoculo. Quando calcolo FICho, potrebbe trattarsi di situazioni in cui il MIC è fuori scala (cioè, superiore a quello testato), comprese situazioni dove il farmaco da testare non ha attività singolarmente contro il tipo di organismo in fase di test. In questi casi, la FIC può essere calcolata sulla base supponendo che il microfono è una diluizione superiore alla concentrazione massima testata. Questa è la strategia più conservativa, in quanto presuppone il valore massimo possibile di FIC per qualsiasi diluizione dove l’inibizione è osservata durante la prova di sinergia. Ad esempio, se l’effettivo MIC erano invece due diluizioni raddoppio sopra la più alta concentrazione testato, allora il corrispondente FICs sarebbe duplice inferiore le assegnazioni di conservatore e così via.
Al fine di valutare con precisione l’attività battericida delle droghe in un’analisi di time-kill, è essenziale che le culture sia in fase logaritmica di crescita, particolarmente quando antibiotici attivi parete cellulare vengono testati28. Per i batteri di rapida crescita utilizzati in questo esempio (K. pneumoniae), 3 ore di incubazione con l’agitazione era appropriato per raggiungere questa fase di crescita, ma diverse quantità di tempo può essere necessaria per diversi organismi. In generale, la cultura dovrebbe apparire visibilmente ma non pesantemente torbida. La giusta quantità di tempo può essere determinata mediante la costruzione di una curva di crescita con i conteggi di Colonia presi a serial tempo punti (ad esempio, ogni 30 min per 4-6 h)38. L’inoculo iniziale previsto nello studio tempo-uccidere è anche importante. La concentrazione target dell’inoculo iniziale è di circa 5 x 105 a 1 x 106 CFU/mL. La diluizione descritta qui (100 μL di sospensione McFarland 1,0 in 10 mL di media) genera questo inoculo per Klebsiella pneumoniae e altre specie Enterobacteriaceae in cui lo abbiamo testato. Se la densità della partenza inoculi in un esperimento utilizzando diversi organismi è significativamente più alto o più basso di questo, poi una diluizione differente può essere necessaria. (La diluizione appropriata necessaria per una determinata specie può essere determinata eseguendo un conteggio di piastra di sospensione McFarland 0,5 o 1,0 per determinare quanti organismi questo torbidità rappresenta, quindi calcolare l’importo da cui la sospensione iniziale deve essere diluito per raggiungere la concentrazione finale appropriata.) Se, sulla revisione della conta su piastra dallo studio sinergia, l’inoculo iniziale di una qualsiasi delle provette contenenti antibiotico risulta sono stati significativamente più basso dell’inoculo iniziale del controllo di crescita, ciò potrebbe indicare entrambi riporto antibiotico o molto rapida uccisione dei batteri in breve tempo fra aggiunta di batteri nella provetta contenente Antibiotico e rimozione dell’aliquota per la placcatura. Se il numero effettivo delle colonie nella goccia non diluita in una serie è inferiore rispetto al numero di colonie in diluizioni successive, questo suggerisce effetto antibiotico riporto. Diverse opzioni sono state descritte per impedire questo effetto, tra cui diffusione una singola aliquota sopra un’ intera piastra38 o filatura giù il campione, rimuovere il supernatante e ri-sospensione in una soluzione salina sterile prima della placcatura39. In ogni punto tempo il metodo time-kill, è anche fondamentale per lo sperimentatore per in modo efficiente ma accuratamente rimuovere un’aliquota da ciascuna provetta di cultura ed eseguire diluizioni seriali. Ritardi durante questo processo, particolarmente durante i primi punti di tempo che si verificano in stretta successione, possono portare a periodi prolungati durante i quali culture non sono state incubate e scosso, considerando che incurante di erogazione e diluizioni seriali possono portare alla piastra imprecisa conta. Rispetto al metodo di piastra diffusione di piastra conteggio, in cui 100 μL di ogni diluizione si sviluppa su una piastra di agar intero, il metodo della piastra goccia descritto è molto più veloce, richiede un numero molto inferiore di piastre di agar e permette per il conteggio più veloce, come il massimo numerabile numero di colonie per ogni goccia è 30, mentre fino a 300 colonie può in genere essere contato da una piastra di diffusione. Tuttavia, il metodo della piastra di diffusione è anche un’opzione se gli investigatori sono più comodi con questa tecnica. Se gocce diffuso in altro dopo l’erogazione con una pipetta multicanale, singola applicazione delle gocce più ampiamente distanziati con una pipetta monocanale può essere eseguita invece. Nella nostra esperienza, piastre a 4 ° C prima dell’erogazione di gocce di raffreddamento sembrava ridurre eccessiva diffusione.
Una limitazione delle tecniche descritte qui è che i risultati dei due tipi di test di sinergia (matrice di scacchiera e tempo-kill) non sono sempre concordi, e poiché gli articoli di sinergia più pubblicati utilizzano un metodo o l’altro piuttosto che entrambi insieme, può essere difficile sapere come integrare dati da due tipi di analisi. Perché il metodo di matrice automatizzato scacchiera che abbiamo sviluppato è semplice e ad alta produttività, abbiamo usato esso in effetti come una sorta di schermo per testare combinazioni contro un più grande numero di isolati e per determinare quali combinazioni di concentrazione erano sinergici. Abbiamo quindi effettuato un numero minore di studi di time-kill, selezionando combinazioni e le concentrazioni che erano stato efficace nella matrice della scacchiera. Di nota, perché l’analisi della scacchiera viene in genere eseguita su una scala di diluizione microbroth, mentre l’analisi tempo-kill utilizza più grandi volumi (simile a una diluizione di macrobroth), abbiamo trovato che FICs talvolta erano differenti fra i due metodi, con maggiore concentrazioni generalmente richieste nell’analisi tempo-uccidere per dimostrare l’attività. Questo fenomeno è stato notato in precedenza, quando macrobroth e microbroth diluizione MIC Test risultati vengono confrontati per bacilli gram-negativi26 e quando inoculi più grandi (come quello usato in studi di time-kill) vengono confrontati con l’inoculo standard utilizzato in matrice di diluizione e scacchiera microbroth dosaggi32. Un limite specifico della matrice della scacchiera è la variabilità inerente in diluizione microbroth MIC Test22. Mentre FICho tagli per conto di sinergia per questa variabilità matematicamente6 tale variabilità inevitabilmente genera preoccupazione circa l’affidabilità e la coerenza dei risultati di matrice della scacchiera.
A causa delle limitazioni inerenti alla sinergia tutto in vitro (inclusa la coltivazione di batteri in un terreno di coltura artificiale, concentrazioni di antibiotiche statiche e un corso di tempo limitato) metodi di prova, i risultati ottenuti con questi metodi devono essere confermati e ulteriormente valutato utilizzando tecniche supplementari. Tali metodi includono studi in vitro farmacocinetica/farmacodinamica (PK/PD) (ad esempio, la fibra cava infezione modello40), modelli animali e, in definitiva, gli studi umani di PK/PD e l’efficacia. Il metodo di matrice automatizzato scacchiera descritto qui, fornendo un metodo rapido con cui a combinazioni di schermo per potenziali attività sinergica, permette per più mirato l’utilizzo di queste tecniche. Ulteriormente l’automazione di tutti questi metodi, come così come più sistematica indagine sulla relazione tra parametri in vitro e gli esiti clinici, sarà importante nel ridimensionamento fino l’uso di sinergia test e aumentando la sua applicabilità clinica.
The authors have nothing to disclose.
Thea Brennan-Krohn è stata sostenuta da un Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health e malattie infettive pediatriche di sviluppo umano di ricerca formazione grant (T32HD055148), un Istituto nazionale dell’allergia e malattie infettive formazione grant ( T32AI007061), borsa di studio di Boston bambini ospedale ufficio di facoltà sviluppo carriera sviluppo della facoltà e il National Institute of Allergy e malattie infettive career development award (1K08AI132716). J.E.K. è stata sostenuta dal National Institute of Allergy e malattie infettive dei National Institutes of Health, sotto numero premio R33 AI119114. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.
Escherichia coli strain ATCC 25922 | ATCC | 25922 | QC strain |
0.5 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1605-0000 | |
1 L 0.22 µm bottle-top filter | Thermo Scientific Nalgene | 597-4520 | |
12 mm x 75 mm borosilicate glass round bottom culture tubes | Fisherbrand | 14-961-26 | |
15 mL conical tubes | Phenix | SS-PH15 | |
15 x 100 mm or 15 x 150 mm Mueller Hinton agar plates | Thermo Scientific | R01620 or R04050 | |
25 mm stainless steel closures for 25 x 150 mm glass culture tubes | Bellco | 2005-02512 | |
25 x 150 mm borosilicate glass round bottom culture tubes | Bellco | 2011-25150 | |
348-well sterile clear, flat-bottom, untreated microplates with lids | Greiner Bio-One | 781186 | |
50 mL conical tubes | Phenix | SS-PH50 | |
50 mL sterile reagent reservoirs | Corning | 4870 | |
96 deep well polypropylene microplate with 2 mL wells | Fisherbrand | 12-566-612 | |
96-well sterile clear, round-bottom, untreated microplates with lids | Evergreen | 222-8032-01R | |
Cation adjusted Mueller Hinton broth | BD Diagnostics | 212322 | |
Colistin sulfate | Alfa Aesar | J60915 | |
D300e Control Software | HP/Tecan | ||
DensiCHEK Plus McFarland reader | bioMérieux | 21250 | |
Excel spreadsheet software | Microsoft | ||
Extra long SHARP 10 µL Precision Barrier Tips | Denville Scientific | P1096-FR | |
HP D300 digital dispenser | HP/Tecan | ||
HP D300 T8+ cassettes | HP/Tecan | 30097370 | |
Minocycline hydrochloride | Chem-Impex | 14302 | |
Picus 12-channel 10-300 µL pipette | Sartorius | 735461 | |
Polysorbate 20 | Fisher Bioreagents | BP-337 | Brand name: Tween 20 |
Sodium chloride | Fisher Chemical | S271 | |
Spectrophotometer | Tecan | Infinite M1000 PRO | |
Xplorer 12-channel 50-1200 µL pipette | Eppendorf | 2231000328 |