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Immunology and Infection

Antimicrobiana sinergia testes pela impressora jato de tinta-assistida matriz Checkerboard automatizado e o método Manual de tempo-kill

Published: April 18, 2019
doi:
10.3791/58636
,
1Department of Pathology,Beth Israel Deaconess Medical Center, 2Division of Infectious Diseases,Boston Children’s Hospital, 3Harvard Medical School

Summary

Antimicrobiana sinergia teste é usado para avaliar o efeito de dois ou mais antibióticos usados em combinação e é normalmente realizada por um dos dois métodos: a matriz do tabuleiro de damas ou o ensaio de matar tempo. Aqui, apresentamos um automatizado, jato de tinta impressora assistida quadriculado matriz sinergia técnica e um estudo clássico sinergia… matar tempo.

Abstract

Como taxas de patógenos multirresistentes de (MDR) continuam a aumentar, ultrapassando o desenvolvimento de novos antimicrobianos, novas abordagens para o tratamento de bactérias MDR são cada vez mais se tornando uma necessidade. Uma tal abordagem é a terapia de combinação, na quais dois ou mais antibióticos são usados juntos para tratar uma infecção contra qual uma ou ambas as drogas podem ser ineficazes em paz. Quando as duas drogas, em combinação, exercem um maior do que o efeito aditivo, são considerados sinérgicos. Investigações in vitro da atividade sinérgica é um primeiro passo importante em avaliar a possível eficácia das combinações de drogas. Desenvolveram-se dois métodos de teste principal sinergia in vitro: a matriz do tabuleiro de damas e o estudo de tempo… matar. Neste trabalho, apresentamos um método de matriz de quadriculado automatizado que faz uso da tecnologia de impressão jato de tinta para aumentar a eficiência e precisão desta técnica, bem como um método manual padrão tempo matar sinergia. A matriz de quadriculado automatizado pode servir como um ensaio de rastreio com throughput alto, enquanto o estudo de tempo… matar manual fornece dados adicionais, complementares na matança e atividade sinérgica.

A matriz do tabuleiro de damas é uma modificação do padrão concentração inibitória mínima (CIM) ensaios, em que bactérias são incubadas com antibióticos em combinações diferentes de concentração e avaliadas para inibição do crescimento após incubação durante a noite. Desempenho manual da matriz quadriculado requer uma série de cálculos e diluições trabalhosa e propenso a erros. No método automatizado apresentado aqui, o cálculo e distribuição da necessária solução antibiótica volumes são automatizados através do uso de tecnologia de impressão jato de tinta. No ensaio de tempo-matar sinergia, bactérias são incubadas com os antibióticos de interesse, tanto juntos e individualmente e amostradas em intervalos ao longo de 24h para cultura quantitativa. Os resultados podem determinar se uma combinação é sinérgica e seja bactericida e fornecer dados sobre a inibição e matança das bactérias ao longo do tempo.

Introduction

A disseminação de patógenos multirresistentes do bacterianas de (MDR), particularmente MDR bactérias Gram-negativas como Enterobacteriaceae carbapenem-resistente (CRE), deixou os médicos com opções cada vez mais limitadas para a terapia anti-infecciosa sucesso 1, um problema agravado pelo lento ritmo de novela droga antibacteriana descoberta2,3. Antimicrobiana sinergia, no qual duas drogas usadas em combinação exercem um efeito maior do que o aditivo, oferece a possibilidade de salvar os antibióticos existentes para uso no tratamento de bactérias MDR, mesmo quando estas bactérias são resistentes a um ou ambos os antibióticos individualmente. As técnicas descritas neste artigo fornecem dois métodos complementares de sinergia in vitro, teste que, quando usados em conjunto, permitem que os investigadores para eficientemente tela antimicrobiana as combinações de interesse para a evidência da atividade sinérgica (o automatizado método de matriz de quadriculado) e depois ainda avaliar a cinética de inibição e matança demonstrada por combinações promissoras identificadas na fase de triagem (o método manual de tempo-kill).

Um dos métodos mais comumente utilizados de testes in vitro sinergia é o ensaio de matriz do tabuleiro de damas, uma modificação do teste de concentração inibitória mínima (CIM), em que a atividade inibitória de dois antibióticos diferentes contra um bacteriano isolar são testados ao longo de um intervalo de concentração combinações4,5. Se as duas drogas exercem maior atividade aditiva quando usados juntos, a combinação é considerada sinérgicos6. No entanto, configurando uma matriz quadriculado manualmente envolve uma série de cálculos e diluição e pipetagem etapas que são vulneráveis ao erro humano e laborioso. Essas restrições tiveram o efeito de limitar a utilização de testes principalmente para a avaliação retrospectiva de um pequeno número de combinações antibióticas e isolados bacterianos de sinergia, e os resultados não foram consistentes entre estudos7, 8,9,10,11. Além disso, a complexidade dos testes de sinergia tem contribuído para sua indisponibilidade no laboratório de Microbiologia clínica e a virtual ausência de dados de teste in-vitro sinergia de estudos clínicos de terapia de combinação12, 13.

A fim de aumentar a eficiência e a produtividade do método de matriz de tabuleiro de damas, fizemos uso de uma técnica de teste MIC automatizada anteriormente desenvolvida em nosso laboratório que usa a tecnologia de impressão jato de tinta para precisamente e consistentemente dispensar volumes pequenos da solução antibiótica em poços de uma placa de microtitulação14. A plataforma elimina a necessidade de cálculos complexos e várias etapas de pipetagem. O software associado calcula e dispensa volumes adequados de antibióticos para criar uma matriz bidimensional quadriculado, se o usuário simplesmente insere o intervalo de concentração desejada e a concentração da solução das ações dos antibióticos. Inicialmente testamos esse método contra uma coleção de isolados CRE15 e posteriormente concentraram-se em testar combinações contendo colistina para atividade contra isolados resistentes colistina16. Colistina é uma droga de último recurso geralmente reservado para uso no tratamento da resistência MDR patógenos Gram-negativos17,18e colistina já processa MDR bactérias quase panresistente19, tornando-os ideais candidatos para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas usando drogas ao qual eles são insensíveis individualmente. Descobrimos que a combinação de colistina e a inibidor de síntese de proteína minociclina antibiótico tinha uma taxa muito alta de sinergia, mesmo contra as estirpes que eram resistentes a cada uma destas drogas individualmente, presumivelmente porque colistina exerce uma subinhibitory permeabilizing efeito sobre bactérias mesmo resistentes a colistina. Escolhemos esta combinação para usar como exemplo neste artigo. Digno de nota, sinergia testes também podem ser usado para a maior eficácia de dois medicamentos que são eficazes tanto individualmente.

O método de matriz de quadriculado automatizado facilita testes sinergia rápida, alta produtividade. No entanto, o método de matriz de xadrez tem limitações. Como um ensaio modificado do MIC, fornece dados somente na inibição do crescimento bacteriano e não na morte, e ele não fornece dados sobre os efeitos de antibióticos ao longo do tempo. Por outro lado, desempenho manual de ensaios de sinergia de vez… matar é mais trabalhoso, mas fornece informações sobre ambos inibição e matança sobre um 24h tempo curso20,21. Nós usamos análise tempo-mate em um número menor de isolados para confirmar nossos resultados de matriz do tabuleiro de damas e para determinar se as combinações sinergéticas identificamos também bactericidas.

Ambos os métodos de sinergia de matriz e tempo-kill quadriculado fornecem informações valiosas sobre a atividade de combinações de drogas e são particularmente úteis na avaliação de potenciais novas opções terapêuticas para patógenos bacterianos altamente resistentes. Os métodos também têm limitações inerentes. O método de diluição MIC microbroth padrão tem uma gama de erro esperada conhecido de 1 dupla diluição22, que é aumentado quando dois medicamentos são testados juntos em uma matriz de tabuleiro de damas. Espera-se a definição padrão de sinergia, que considera que uma combinação sinérgica somente se as drogas são ativas juntos em um quarto seus respectivos microfones6, leva em conta esta variabilidade, mas tal variabilidade (que é pensada para resultar de uma combinação de flutuações biológicas e técnicas23) inevitavelmente gera incerteza sobre a fiabilidade dos resultados de sinergia. A falta de padrões de controle de qualidade estabelecidos para o teste de sinergia é também uma limitação atual. Talvez a mais significativa limitação de todos os métodos de ensaio de sinergia é a falta de estabelecidas correlações entre os resultados in vitro e os resultados clínicos quando as combinações são usadas para tratar pacientes24. Sinergia mais simples e mais rápida testar métodos, como o método de matriz de quadriculado automatizado descrito aqui, pode facilitar a integração de sinergia em vitro testes em ensaios clínicos ou outras avaliações de resultados pacientes a fim de melhor caracteriza a relação entre efeitos in vitro e in vivo no futuro.

O método de matriz de quadriculado automatizado que apresentamos aqui oferece uma opção para seleção da elevado-produção de uma variedade de combinações e permite a avaliação rápida de combinações de “alto risco-alto recompensa” incomum, sem um grande investimento de tempo e recursos. O método tempo-kill, que posteriormente demonstramos, pode fornecer informações adicionais de apoia sobre a atividade sinérgica da combinação e pode ajudar a caracterizar sua atividade bactericida e cinética antibacteriana.

Protocol

Atenção: Use regras de segurança adequadas quando se trabalha com bactérias. Use luvas e avental em todos os momentos. Realizar o trabalho em uma biossegurança do armário se serão gerados aerossóis ou trabalhar com patógenos de alto risco. Nota: 20 a 24 h antes de iniciar os experimentos, raia para fora o isolate(s) bacteriana a ser testada (a partir de um estoque de colônia-purificado, minimamente passado congelado a-80 ° C em caldo tryptic soy com estoque de 50% de glicerol) em uma placa de ágar sangue. Incube a placa a 35 ° C, em ar ambiente. 1. impressora jato de tinta-assistida automatizado Checkerboard matriz sinergia Fazer soluções estoque antimicrobianas (Colistina e minociclina). Determine as concentrações de solução antibiótica baseiam na solubilidade dos antibióticos e desejado concentrações finais na matriz do tabuleiro de damas. Fazer estoques de 10 mg/mL de colistina e minociclina para esse exemplo. Use o documento CLSI M100 para determinar os solventes apropriados para cada antibiótico25. Tanto a colistina e minociclina são solúveis em água; Porque a D300 inkjet impressora requer a adição de surfactante para fluido aquoso adequado manipulação, dissolva os antibióticos em água desionizada ultrapura com 0,3% polissorbato 20. Pesar em pó antibiótico usando uma balança analítica e calcular o volume de solvente necessário para obter a concentração das ações de gol. Se o antibiótico é fornecido como um sal (sulfato de colistina, cloridrato de minociclina) ou na forma hidratada (por exemplo, meropenem triidratado), ou se é relatado pelo fabricante para ter menos do que 100% de pureza, executar um cálculo de potência26 de Determine a quantidade de solvente necessária. Siga este exemplo de cloridrato de minociclina com uma pureza declarada de 900 mg/mg:Ensaio de pureza: 900 mg/mgÍndice de água: nenhumFração ativa: 0,926 (obtido dividindo o peso molecular de minociclina (Da 457.48) pelo peso molecular do cloridrato de minociclina (Da 493.94)).Potência = (pureza de ensaio) * (1 – teor de água) * (fração ativa)= (900 mg/mg) * (1) * (0,926) = 833,4 mg/mg ou 83.34%Em seguida, determine o volume de solvente necessário como segue:Volume (mL) = [peso (mg) * potência (mg/mg)] ÷ [concentração (mg/mL)]Assim, por exemplo, se 34,7 mg de pó de cloridrato de minociclina é pesada, use o seguinte cálculo para determinar o volume de solvente necessário para fazer uma solução de 10 mg/mL:Volume = (34,7 mg) * (833.4 mg/mg) = 2,89 mL10.000 mg/mL Despeje o antibiótico em pó em um tubo cônico de 15 mL e adicionar o volume apropriado de água mais 0,3% polissorbato 20. Vórtice até dissolver. Alíquota solução antibiótica estoque em tubos de 0,5 mL microcentrifuga e loja a-80 ° C até que esteja pronto para uso. Realize o controle de qualidade (QC) de ações antimicrobianas para uso em experimentos de matriz de xadrez pelo menos um dia antes do teste de sinergia para que QC resultados podem ser avaliados antes de usar o estoque para o teste de sinergia.NOTA:A técnica QC descrita aqui é idêntica da técnica que seria usada para testar a concentração inibitória mínima (CIM) de drogas individuais e pode ser usada como tal com qualquer cepas de interesse para o investigador.Prepare a suspensão bacteriana. Tire uma alíquota de cada unidade populacional antibiótico do freezer-80 ° C para iniciar o descongelamento enquanto prepara a suspensão bacteriana. Uma vez descongelado para garantir que o antibiótico está na solução de vórtice. Selecione uma estirpe QC apropriada e determinar o intervalo aceitável de MIC para drogas sendo testado com base na tabela 5A-1 em CLSI M10025. Para as drogas aqui, uso de e. coli ATCC 25922; os intervalos MIC para esta estirpe são 0,25-1 mg/mL para minociclina e 0,25-2 mg/mL de colistina. Selecione um intervalo de concentrações de antibiótico para testar que incluem toda a gama QC. Use o intervalo de 0,0156 mg/mL a 8 mg/mL para minociclina e colistina para ATCC 25922. Adicione 1 mL de cloreto de sódio 0,9% para uma 12 x 75 mm redondo tubo de cultura de vidro de fundo. Selecione uma ou duas colônias de um prato da noite da ATCC 25922 e vórtice suavemente para suspender. Verifica a concentração de bactérias usando um leitor de McFarland. Ajuste conforme necessário pela adição de mais cloreto de sódio 0,9% ou mais bactérias para alcançar uma turvação 0,5 de McFarland de leitura. Fazer uma diluição de 1: 300 a suspensão de McFarland 0,5 adicionando 100 mL da suspensão a 30 mL de cátion ajustado Mueller-Hinton caldo (CAMHB) em um tubo cônico de 50 mL, para chegar a uma densidade de célula final de 5 x 105 UFC/mL, conforme recomendado pelo CLSI27. Usando um loop inoculando estéril, raia de isolamento uma gota do inóculo inicial em uma placa de ágar sangue para confirmar a pureza do inóculo e incubar a 35 ° C, em ar ambiente. Adicione uma fundo plano, quadrado-bem, clara, não tratada 384 placa usando o D300 antimicrobianos. Execute esta etapa imediatamente depois de preparar a suspensão bacteriana para que a suspensão pode ser adicionado para as placas dentro de 15min de preparação26. Ligue a impressora jato de tinta D300 e o computador associado. Abra o programa de software. Inicie um novo arquivo. Acima da imagem da grade de placa, com o botão direito na placa 1 e escolha Editar placa. Selecione o tipo de prato apropriado (384 bem) e o volume adicional (50 mL). Adicione líquidos (ou seja, ações antibióticas) para o protocolo clicando no sinal de mais ao lado de fluidos no painel esquerdo. Adicione dois fluidos (Colistina e minociclina). Passe o mouse sobre o painel que apareceu para fluido 1 e clique no lápis para editar. Nome do fluido “Colistin”, alterar a classe de “aquoso + Tween 20”, altere concentração para 10.000 e unidades de concentração mg/ml (note que ações concentração é 10 mg/mL, ou seja, 10.000 mg/mL). Deixe Dispense by a concentração e o restante dos campos em suas configurações padrão. Clique Okey. Repita o procedimento acima para fluido 2 (minociclina). Clique na guia Protocolo atual na parte superior da tela e alterar a concentração (massa) para mg/mL para determinar as unidades usadas para concentrações finais bem aos antibióticos. Selecione 10 poços na grade clicando e arrastando, clique em titulação na parte superior da tela. Para especificar titulação usando selecione maior concentração, para fluido escolhe colistina, para Maior concentração , digite 8 (certifique-se de unidades são mg/mL) e de distribuição Selecione 1:2 (50%). Deixe o padrão valores no lugar para o resto da janela e clique Okey. Repita o procedimento acima para minociclina gerar a titulação de minociclina. Salve o protocolo e, em seguida, clique no botão executar na parte superior esquerda. Clique no botão Iniciar . Carregar uma placa de 384 (com a tampa removida) para o suporte da placa e pressione Loaded sob a “carga placa 1 – sinergia” prompt.Nota: Este prompt é escolhido pelo software e não indica que o teste de sinergia está sendo executada. Coloque uma fita T8 + na ranhura da gaveta e pressione Loaded sob a carga uma gaveta T8 + alerta. Quando solicitado, adicione solução antibiótica para os reservatórios indicados na fita. Siga as instruções na tela para carregamento adequado e dispense cuidadosamente para evitar quaisquer bolhas na solução. Depois que cada solução é adicionada, pressione o botão de cheio . Adicionarmos a impressora jato de tinta tem estoque de antibiótico em volumes adequados a cada poço e caixa executar concluído é exibida, clique em fechar, retire a placa e desligue a D300. Adicionar as suspensões bacterianas ao 384-placa e incubar a placa. Despeje a suspensão bacteriana previamente preparada em um reservatório de reagente estéril. Use uma pipeta multicanal para adicionar 50 mL de suspensão bacteriana a todas as cavidades contendo antibiótico. Adicionar 50 mL de CAMHB sem bactérias para um poço vazio; Este será o controlo negativo bem para confirmar a esterilidade dos meios de comunicação. Coloque a placa em uma incubadora de ar ambiente de 35 ° C e incubar durante 16-20 h26.Nota: Uma duração diferente de incubação pode ser necessária se os organismos que não Enterobacteriaceae estão sendo testados; consulte o CLSI M10025 para recomendações específicas do organismo. Leia a placa em um leitor de microplacas na densidade óptica de 600 (OD600) e analisar os resultados. Usando um programa de planilha, sombrear células com um valor de600 OD de ≥0.07 verde, indicando o crescimento e células com um valor de < 0.07 vermelho, não indicando nenhum crescimento.Nota: Estes valores foram determinados com base em inspeção visual de crescimento vs sem crescimento e correlação com as leituras de OD para estas experiências; Leituras de600 OD de poços que contém a mídia só foram consistentemente abaixo de 0,07. Cortes apropriados podem diferir com bactérias e leitores de placa diferente. Determine o MIC para cada droga. O MIC é a menor concentração da droga no qual o crescimento bacteriano é inibido. Se o MIC está dentro do intervalo QC esperado de acordo com o documento CLSI M10025, a solução é apropriada para uso. Prepare a suspensão bacteriana para matriz de tabuleiro de damas. Tire uma alíquota de cada unidade populacional antibiótico do freezer-80 ° C para iniciar o descongelamento enquanto prepara a suspensão bacteriana. Uma vez descongelado para garantir antibiótico de vórtice está em solução. Adicione ~ 1 mL de cloreto de sódio 0,9% para uma 12 x 75 mm redondo tubo de cultura de vidro de fundo. Selecione uma ou duas colônias de uma placa durante a noite de bactérias (nesse caso, estirpe de Escherichia coli 0494 FDA-CDC) e vórtice suavemente para suspender estas em cloreto de sódio a 0,9%. Verifica a concentração de bactérias usando um leitor de McFarland. Ajuste conforme necessário pela adição de mais cloreto de sódio 0,9% ou mais bactérias para alcançar uma turvação 0,5 de McFarland de leitura. Fazer uma diluição de 1: 300 a suspensão de McFarland 0,5 adicionando-se 100 mL de suspensão de 30 ml de CAMHB em um tubo cônico de 50 mL, para chegar a uma densidade de célula final de 5 x 105 UFC/mL27. Adicione uma fundo plano, quadrado-bem, clara, não tratada 384 placa usando o D300 antimicrobianos.Nota: execute esta etapa imediatamente depois de preparar a suspensão bacteriana para que a suspensão pode ser adicionado para as placas dentro de 15 minutos de preparação26. Ligue a impressora jato de tinta, iniciar um novo arquivo e adicionar líquidos do protocolo como em etapas 1.2.2.1-1.2.2.3. Gere grade de sinergia. Clique no ícone de sinergia na parte superior da tela e prossiga com as etapas. Tipo selecione dois ou mais fluidos fatorados juntos. Para a placa, não é necessário excluir qualquer poços; clique em Next nesta etapa sem fazer alterações. Na guia de titulação , insira a concentrações de antibiótico e colocação. A fim de adicionar minociclina em decrescente diluições dobra de 32 a 0,031 mg/mL, além de um poço negativo com nenhum antibiótico, abaixo do eixo y , digite 12 níveis de titulação no painel esquerdo. Para especificar titulação usando, selecione maior concentração; para fluido, selecione minociclina; para maior concentração, digite 32 (verifique se a unidade encontra-se em mg/mL; se não, é fechar a caixa de diálogo de sinergia e alterar na guia Protocolo atual ). Certifique-se de que a caixa de valor incluem 0 é verificada. Alterar a distribuição de 1:2 (50%). Repita essas etapas para colistina no painel da direita, usando 12 níveis de titulação e uma maior concentração de 16. Clique em seguinte. Na guia Layout , escolha níveis de titulação dos 2 primeiros fluidos determinar o número de linhas e colunas em uma grade de layout. Clique em seguinte. Se a grade é exibida conforme o esperado, clique em concluir. Salvar o protocolo e, em seguida, clique no botão executar na parte superior esquerda. Clique no botão Iniciar . Carregar uma placa de 384 (com a tampa removida) para o suporte da placa e pressione carregado com a carga placa 1 – sinergia prompt. Coloque uma fita T8 + na ranhura da gaveta e pressione Loaded sob a carga uma gaveta T8 + alerta. Quando solicitado, adicione solução antibiótica para os reservatórios indicados na fita. Siga as instruções na tela para carregamento adequado e dispense cuidadosamente para evitar quaisquer bolhas na solução. Depois que cada solução é adicionada, pressione o botão de cheio . Adicionarmos o dispensador D300 tem estoque de antibiótico em volumes adequados a cada poço e caixa executar concluído é exibida, clique em sair, retire a placa e desligue a D300. Adicionar as suspensões bacterianas ao 384-placa e incubar a placa. Despeje a suspensão bacteriana previamente preparada em um reservatório de reagente estéril. Use uma pipeta multicanal para adicionar 50 mL de suspensão de todas as cavidades da matriz do tabuleiro de damas. Adicionar 50 mL de CAMHB sem bactérias para um poço vazio; Este será o controlo negativo bem para confirmar a esterilidade dos meios de comunicação. Incube em uma incubadora de ar ambiente de 35 ° C por 16-20 h26. Leia a placa em um leitor de microplacas com OD600 e analisar resultados de matriz do tabuleiro de damas. Em primeiro lugar, verificar a placa de pureza e certifique-se de que as colônias isoladas são de uma única morfologia consistente com a esperada morfologia do organismo sendo testado. Usando um programa de planilha, sombrear células para indicar o crescimento e não como na etapa 1.2.4.1. Determine o MIC para cada droga. Para uma droga que não inibe o crescimento bacteriano em maior concentração testada, o MIC é considerado fora de escala. Para cada poço no qual o crescimento é inibido, determinar a concentração inibitória fracional (FIC) para cada antibiótico baseado MIC desse antibiótico (ver figura 1B e Figura 2B).Nota: A FIC é a relação da concentração do antibiótico em um poço no qual o crescimento é inibido para seu MIC; Então para uma droga com um MIC de 8 mg/mL, um bem com 8 mg/mL de droga tem uma FIC de 1, enquanto um bem contendo 4 mg/mL tem uma FIC de 0,5. Calcule o valor de índice (FICeu) concentração inibitória fracionário para cada poço no qual o crescimento é inibido pela soma dos FICs de cada uma das drogas naquele poço. Determine o menor FICeu no qual o crescimento é inibido (mínimo FICeu). Se o mínimo FICeu £0,5, considere a combinação sinérgica; se 0,5-4, considere a combinação indiferente; e se > 4, considere a combinação antagônica. Se a combinação sinérgica em algumas combinações de concentração mas antagônicos em outros, Observe este resultado mas considerar globalmente a combinação antagônica. 2. tempo… matar sinergia testes Fazer soluções estoque antimicrobianas. Se esta etapa é executada antes do experimento, congele ações a-80 ° C até que esteja pronto para uso. Determine as concentrações de solução antibiótica baseiam na solubilidade dos antibióticos e desejado concentrações finais em estudos de tempo-mata. Neste exemplo, fazer estoques de colistina e minociclina em uma concentração de 1 mg/mL. Use o documento CLSI M100 para determinar os solventes apropriados para cada antibiótico25. Use água, tal como recomendado, tanto para colistina e minociclina. Pesar em pó antibiótico usando a balança analítica e calcular o volume de solvente necessário para obter a concentração das ações de gol. Se necessário, execute um cálculo de potência antes de determinar a quantidade de solvente necessária, conforme descrito na etapa 1.1.2.1 acima. Despeje em pó antibiótico 15ml tubos cónicos e adicionar o volume apropriado de água. Vórtice até dissolver. Usando o método de caldo manual como descrito em CLSI M0726, executar QC de antimicrobianos estoques para uso em tempo de matar experimentos de sinergia. Execute esta etapa pelo menos um dia antes do teste para que resultados QC podem ser revistos antes de utilizar o estoque de sinergia. Selecione uma estirpe QC apropriada e determinar o intervalo aceitável de MIC para drogas sendo testado com base na tabela 5A-1 em CLSI M10025. Para as drogas aqui, uso de e. coli ATCC 25922; os intervalos MIC para esta estirpe são 0,25-1 mg/mL para minociclina e 0,25-2 mg/mL de colistina. Prepare o caldo contendo antibiótico como placas. Selecione a maior concentração de antibiótico para ser testado para que toda a gama QC pode ser incluída. Use um intervalo de 0.016 a 8 mg/mL para minociclina e colistina para ATCC 25922. Dilua os estoques antibióticos para uma solução de trabalho na CAMHB em duas vezes a concentração máxima necessária (porque vai ser diluído 1:1 com a suspensão de bactérias). Neste exemplo, dilua as duas ações de 10 mg/mL a 16 mg/mL. Usando uma pipeta multicanal, adicionar 100 mL de cada uma das 2 x antibióticas suspensões para um poço na primeira coluna de uma placa de 96 poços clara, fundo redondo, sem tratamento e adicionar 50 mL de caldo simples (ou seja, sem antibiótico) para cada poço de colunas subsequentes. Retire 50 mL de antibiótico contendo caldo de cada bem na primeira coluna e adicionar aos poços na segunda coluna. Pipeta de cima e para baixo várias vezes para misturar o conteúdo, gerando uma concentração de antibiótico metade isso da concentração na primeira coluna. Repita a etapa 2.2.2.4 com cada coluna, para que uma série de diluições em série duas vezes, cada um com um volume de 50 mL, esteja preparada. Pontas da pipeta de mudança entre cada etapa de diluição se desejado para eliminar a possibilidade de reporte aos antibióticos. Observe que as concentrações resultantes são todos ainda 2 x as concentrações finais, como eles serão posteriormente diluída 1:1 com a suspensão bacteriana. Não adicione qualquer antibiótico finais duas colunas, que estão as colunas de controle negativo e crescimento. Prepare a suspensão bacteriana. Prepare uma suspensão de McFarland 0,5 de uma placa durante a noite de e. coli ATCC 25922 em 0,9% de cloreto de sódio, conforme descrito em etapas 1.2.1.5-1.2.1.6. Fazer uma diluição de 1:150 de suspensão de McFarland 0,5 adicionando 50 mL da suspensão a 7,5 mL de CAMHB.Nota: A suspensão bacteriana final será diluída 1: 300 quando é misturado com a solução antibiótica, atingindo a densidade celular CLSI-recomendado de 5 x 105 UFC/mL271:1). Adicionar bactérias microplate e incubar. Adicione 50 mL da suspensão bacteriana em cada poço, exceto na coluna 11th . Adicione 50 mL de CAMHB a 11th coluna (controle negativo). Incube a placa a 35 ° C por 16-20 h.Nota: Uma duração diferente de incubação pode ser necessária se os organismos que não Enterobacteriaceae estão sendo testados; consulte o CLSI M10025 para recomendações específicas do organismo. Leia a placa para crescimento visualmente usando luz transmitida e, para cada antibiótico, determinar a menor concentração em que não há nenhum crescimento; Este é o MIC. Consulte o documento do CLSI M07 para obter detalhes adicionais sobre interpretação visual do MIC26. Se o microfone está dentro do intervalo esperado do QC, a solução é apropriada para uso. Começa a cultura inicial. Fazer um 0.5 McFarland suspensão do organismo de teste em estéril 0,9% NaCl como descrito acima. Adicione 100 mL de suspensão McFarland, 5 ml de CAMHB em um vidro de 25 x 150 mm redondo tubo de cultura inferior com fecho de aço inoxidável e vórtice delicadamente para misturar a 0,5. Usando um loop inoculando estéril, raia de isolamento uma gota da suspensão diluída em uma placa de ágar sangue para confirmar a pureza do inóculo e incubar a 35 ° C, em ar ambiente. Substituir o encerramento no tubo e incubar em um rack de tubo de ensaio um agitador a 35 ° C, em ar ambiente pelo menos 3 h, até fase logarítmica de crescimento é atingido (consulte a etapa 2.6.1). Prossiga para a etapa 2.4 enquanto a cultura está na incubadora. Prepare soluções antimicrobianas em 25 x 150 mm tubos de cultura do vidro. Retire alíquotas ações antimicrobianas do congelador-80 ° C para descongelar. Uma vez descongelado para garantir antibiótico de vórtice está em solução. Enquanto a cultura inicial está incubando, adicionar 10 mL de CAMHB cinco tubos de cultura de vidro esterilizada 25 x 150 mm e adicionar soluções estoque antimicrobianas como segue.Nota: Para um estudo de sinergia, deve ser pelo menos uma droga em uma concentração que não afeta o crescimento individualmente curva28; Isso pode ser determinado avaliando os efeitos de concentrações individuais de drogas antes do estudo de sinergia. Tubo 1: Adicione a quantidade apropriada de antibióticos #1 para obter a concentração de antibiótico final de destino. Neste caso, adicione 10 mL de 1 mg/mL de caldo de colistina para obter uma concentração final de colistina de 1 mg/mL, como se trata de uma concentração que é ineficaz contra as estirpes utilizadas neste exemplo. Tubo 2: Adicione a quantidade apropriada de antibióticos #2 para obter a concentração final de antibiótica a ser testado. Neste caso, adicione 10 mL de 1 mg/mL de caldo de minociclina para obter uma concentração final de 1 mg/mL, uma concentração que é ineficaz contra a tensão que está sendo usada neste exemplo. Tubo 3: Adicione a mesma quantidade de antibiótico #1 antibiótico e #2 como usado em tubos de 1 e 2. Neste caso, adicione 10 mL de caldo de minociclina 1mg/mL e 10 mL de 1 mg/mL de caldo de colistina. Tubo 4: Adicionar sem antibióticos; Este será o tubo de controle de crescimento. Tubo 5: Adicionar sem antibióticos; Este será o tubo controle negativo. Prepare-se 96 placas de poço profundo de polipropileno com poços de 2 mL para diluições em série adicionando 900 µ l de cloreto de sódio 0,9% estéril para linhas B-H de colunas 1-5 com uma pipeta multicanal. Preparar o inóculo inicial e adicionar aos tubos. Uma vez que a cultura inicial alcançou a fase de crescimento logarítmico (~ 3 h para Klebsiella pneumoniae, o organismo usado neste exemplo), retire o tubo de cultura de agitador, vórtice suavemente, transferir ~ 1 mL de suspensão para um tubo de cultura de vidro 12 x 75 mm, e Verifique a densidade com um leitor de McFarland. Se for menor que 1,0 McFarland, retornar o tubo ao agitador e incubar mais. Se for maior que 1,0 McFarland, adicionar CAMHB ao tubo, vórtice suavemente e re-amostra, repetindo o processo até que a suspensão é em 1,0 McFarland. Adicione 100 mL de suspensão de McFarland de 1,0 para tubos de 1-4 e vórtice suavemente. Alíquotas de amostra de cada cultura e realizar série de diluições de dez vezes. Em momento 0 (imediatamente após a adição de bactérias para os tubos) e 1, 2, 4, 6 e 24 h, retire uma alíquota de 150 mL cada tubo de cultura pela inclinação do tubo para que apenas a ponta da pipeta estéril entre o tubo e não o eixo de pipeta não esterilizada durante a retirada de alíquota. Adicione alíquotas, respectivamente, para poços consecutivos na primeira linha da placa de poço profundo 96 previamente preparado. Retorne os tubos para uma cremalheira do tubo de ensaio num agitador em uma incubadora de ar ambiente de 35 ° C imediatamente depois de retirar alíquotas em cada ponto de tempo. Usando uma pipeta multicanal, remover 100 mL da linha A, adicione a linha B (que contém 900 mL de cloreto de sódio 0,9%) e pipetar para cima e para baixo 4 – 5 vezes a mistura, criando um 01:10 diluição. Descarte dicas seguindo cada passo de diluição para impedir o transporte das bactérias, o que pode levar a acusações de colônia falsamente elevados. Repita a etapa 2.7.2 para linhas B-H com pontas de pipeta nova para cada linha. Placa diluído amostras para contagem de colônia usando a gota placa método29,30. Placas de ágar Mueller-Hinton com o antibióticas condições e diluição para ser banhado de rotular. Usando uma pipeta multicanal e pontas extra-longas (para garantir que a dicas chegue em suspensão), retire 10 mL de cada poço na primeira coluna e dispense cuidadosamente seguidas na chapa devidamente etiquetada. Se forem usadas placas pequenas (100 mm de diâmetro), dispensar 3 linhas (cada um composto por gotas de linhas A-H de uma única coluna) por placa; em grandes placas (150 mm de diâmetro), dispense 8 linhas por placa. Permitir gotas secar completamente (~ 15 min). Em 24h, coloque uma gota de 10ml tomada diretamente do tubo controle negativo em uma área indicada de uma das placas para teste de esterilidade. Inverter as placas e incubar durante uma noite a 35 ° C, em ar ambiente. Contagem das colónias e calcular a densidade de células. Marcar as colônias com um marcador permanente de ponta fina-no verso da placa para evitar a dupla contagem ou falta de colônias. Em primeiro lugar, verificar a placa de pureza e certifique-se de que as colônias isoladas são de uma única morfologia consistente com a esperada morfologia do organismo sendo testado. Para cada série de diluição, identifica gotas com colônias de 3-30 (normalmente uma gota por séries de diluição). Contar as colônias nestas gotas e gravar a contagem juntamente com o factor de diluição. Se não houver nenhum gotas em uma série de diluição com colônias de 3-30, contar as colônias na última gota com > 30 colônias e a primeira gota com < 3 colônias (estes devem ser adjacentes gotas). Para cada série de diluição, calcular o número de unidades por mililitro (UFC/mL) formadoras da amostra com base no número de colônias no drop usando a seguinte fórmula: UFC/mL = n(1 /d) (100) onde n é o número de colônias, d é o factor de diluição (1 para a amostra não diluída (linha A), 0,1 ou 10-1 para o primeiro 01:10 diluição (linha B), 0,01 ou 10-2 para a segunda 01:10 diluição (linha C) e assim por diante e as constantes 100 contas para o fato de que o volume total da gota eu s 10 mL, enquanto o valor final é expresso em UFC/mL, ou seja, CFU/1.000 mL. Use uma planilha que contêm fórmulas que calculam o UFC/mL da contagem de colônia para simplificar esse processo. Para a série de diluição, onde mais de uma gota era contável (ou onde duas gotas tinha que ser contado porque nenhuma gota caiu no intervalo), média a final UFC/mL conta gotas contadas todos. Porque o limite inferior de detecção é 300 CFU/mL (3 colônias na gota não diluída), registro e trama colônia Conde como £300 CFU/mL para a série de diluição em que existem < 3 colônias na gota não diluída. Inspecionar a queda de controle de esterilidade de tempo 24; Se qualquer crescimento é observado nessa queda, os resultados do experimento não devem ser usados. Gráfico e analisar os resultados. Traça as curvas de crescimento de três culturas contendo antibiótico e o controle de crescimento no mesmo gráfico. Sinopse o tempo no eixo x e UFC/mL, usando uma escala logarítmica, no eixo y . Calcule a diferença em UFC/mL, entre o tubo de combinação em vez de 24 e o único agente mais ativo no tempo 24. Se a diferença for ≥2 log10, considere a combinação sinérgica. Em seguida, calcule a diferença entre o tubo de combinação 24 hora e hora 0 UFC/mL. Se a diferença for ≥3 log10, considere a combinação bactericida.

Representative Results

A figura 1A apresenta uma grade de uma experiência de sinergia de matriz de xadrez no qual minociclina em concentrações de 0-32 μg/mL foi combinado com colistina em concentrações de 0-16 μg/mL e testada contra a estirpe de e. coli 0494 FDA-CDC. Os valores representam as leituras espectrofotométricas em densidade óptica 600 nm (OD600). Poços com valores de600 OD abaixo 0.07 (que corresponde a nenhum crescimento por inspeção visual) são sombreado vermelho, enquanto poços com valores de600 OD 0.07 (que corresponde ao crescimento por inspeção visual) são sombreada verde. Para cada droga, a concentração inibitória mínima (MIC; em negrito) é a menor concentração de fármaco que inibe o crescimento bacteriano. Para minociclina, isto é 32 μg/mL e para colistina, é 8 μg/mL. O sombreamento é retido na figura 1B, mas valores dentro dos poços em que o crescimento é inibido são substituídos por valores de índice (FICeu) concentração inibitória fracional. Estas são determinadas como segue: em cada poço, o índice de concentração inibitória fracional (FIC) de cada droga é calculado dividindo-se a concentração de antibiótico no poço pelo MIC da droga, e a FICeu é calculado somando-se a duas FICs. Poços com um FICeu valor de 0,5, que é considerado o corte de sinergia, são indicados com uma borda de linha quebrada, e o poço com o valor mais baixo FICeu (0.094) está em negrito. Porque o FICeu valor mínimo está na faixa sinérgica, a combinação é considerada sinérgica. Figura 2A e 2B figura mostram redes análogas às indicadas na figura 1A e figura 1B, mas neste caso a combinação não demonstram sinergia contra o isolado foi testado (K. pneumoniae isolado 4 BIDMC), porque o mínimo FICeu no qual o crescimento é inibido é 1, o que é > 0.5. A Figura 3 ilustra as leituras da densidade óptica de uma grade de sinergia de xadrez no qual vários poços saltados ocorreram (Enterobacter cloacae complexo isolar BIDMC 27). Saltado poços são poços em que o crescimento bacteriano é inibido apesar da presença de crescimento bacteriano em poços adjacentes com altas concentrações de antibiótico. Este fenômeno, que é conhecido para ocorrer em padrão MIC testing também, é provavelmente devido a variabilidade biológica das características de crescimento bacteriano de bem para bem e para a sensibilidade de alguns antibióticos para pequenas diferenças de inóculo bacteriano23 , 31 , 32. se mais de um ignorado bem ocorreu em uma matriz de tabuleiro de damas, estamos descartados os resultados e repetido o ensaio. Figura 4 apresenta exemplos de resultados de tempo-matar sinergia das três combinações testadas contra K. pneumoniae isolam BIDMC 32. Colônia contagens são indicadas em uma escala logarítmica no y-axis e tempo, em horas, no x-eixo. A diferença entre o inóculo inicial no tubo que contém a combinação de drogas e a concentração de bactérias naquele tubo em 24h é ilustrada pelo número, enquanto a diferença entre a concentração de bactérias em 24 h entre o tubo e barra vermelha que contém a combinação e o tubo contendo o agente único mais ativo sozinho é ilustrado pela barra azul e número. A figura 4A mostra resultados da combinação de colistina e minociclina; Esta combinação foi sinérgica (diferença entre as concentrações de bactérias expostas a combinação e a mais ativa agente sozinho ≥2 log10 UFC/mL em 24 h) e bactericido (declínio de iniciar o inóculo a concentração às 24h ≥3 log10 CFU/mL). Figura 4B mostra os resultados da combinação de colistina e clindamicina, uma combinação que foi sinérgica, mas não era bactericida. Esta combinação inibiu o crescimento das bactérias, que nem droga fiz sozinho, mas não os mate. A Figura 4 mostra os resultados da combinação de colistina e eritromicina, que não era nem bactericida sinérgica. Figura 1: Matriz de xadrez resultados demonstra sinergia (minociclina + colistina testado contra e. coli estirpe 0494 FDA-CDC). (A) espectrofotométrico interpretação leitura e crescimento de uma matriz de tabuleiro de damas. Os valores nas células são leituras da densidade óptica em 600 nm (OD600). Células com valores de600 OD abaixo 0.07 (correspondente a nenhum crescimento por inspeção visual) são sombreado vermelho, enquanto as células com valores de600 OD 0.07 (correspondente ao crescimento por inspeção visual) são sombreada verde. Cálculo de índice (FICeu) (B) concentração inibitória fracional. Sombreamento, indicando o crescimento ou o crescimento não foi mantido. Valores para colistina e minociclina ao longo de x- e y-eixos, respectivamente, agora representam a concentração inibitória fracional (FIC), ou a relação entre a concentração da droga em que a coluna ou linha para a concentração inibitória mínima ( MIC) daquela droga sozinho. O valor em cada célula é a FICeu, ou a soma das FICs das duas drogas naquele poço. Quebrado faz fronteira com linha caixa grande inclui poços com uma FICeu de 0,5. A célula de espessura-fronteira indica o poço com o mais baixo FICeu no qual o crescimento é inibido, ou o mínimo FICeu. Porque o mínimo FICeu é 0,5, a combinação é considerada sinérgica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Resultados de matriz quadriculado de uma combinação que não demonstram sinergia (minociclina + colistina testado contra K. pneumoniae isolar BIDMC 4). Valores de densidade óptica (A) em 600 nm e crescimento interpretação dos resultados da matriz quadriculado conforme descrito para a figura 1A. (B) concentração inibitória fracional índice (FICeu) cálculo conforme descrito para a figura 1A. Porque o mínimo FICeu é > 0,5, a combinação não é considerada sinérgica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: Resultados de matriz de xadrez que são difíceis de interpretar devido a ignorada poços (minociclina + colistina testado contra Enterobacter cloacae complexo isolar BIDMC 27). Valores de densidade óptica em 600 nm e crescimento interpretação dos resultados da matriz quadriculado conforme descrito para a figura 1A. Vários poços saltados, em que o crescimento bacteriano é inibido apesar da presença de crescimento em poços adjacentes com altas concentrações de antibiótico, são demonstrados. Os resultados não são interpretáveis e experimentar precisa ser repetido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: Resultados de sinergia de tempo-mata de três combinações testadas contra K. pneumoniae isolado BIDMC 32. Contagem de colônia é indicadas em uma escala logarítmica no y-axis e tempo, em horas, no x-eixo. A diferença entre a concentração de bactérias na combinação em 24h e o inóculo inicial no tubo é ilustrada pela barra vermelha e número. Se o declínio de iniciar o inóculo a concentração em 24h é ≥3 log10 UFC/mL, a combinação é considerada bactericida. A diferença entre a concentração de bactérias em 24 h entre o tubo que contém a combinação e o tubo contendo o agente único mais ativo sozinho é ilustrada pela barra azul e número; Se houver ≥2 log10 redução de UFC/mL, a combinação é considerada sinérgica. (A) colistina (CST) + minociclina (MIN), uma combinação que seja sinérgico e bactericida. Colistina (B) + Clindamicina (CLI), uma combinação que é sinérgica mas não bactericida. (C) colistina + eritromicina (ERY), uma combinação que não é nem sinérgica bactericida. Estes resultados foram inicialmente publicados como parte de um estudo da atividade sinérgica de colistina contendo combinações contra resistente a colistina Enterobacteriaceae, em que demonstrámos que colistina foi sinérgica com um número de antibióticos que estão ativos apenas individualmente (por exemplo, Clindamicina) ou principalmente (p. ex. Eritromicina) contra bactérias gram-positivas16. (Observe que a eritromicina foi sinérgica por matriz de xadrez contra a tensão mostrada, mas não pelo tempo de matar, então foi selecionada aqui como um exemplo de uma combinação não-sinérgica.) Formulamos a hipótese que colistina, que é conhecida por atuar por permeabilização da membrana exterior gram-negativa, exerce um efeito permeabilizing sub-inibitória em bactérias Gram-negativas resistentes a colistina, permitindo que a entrada de drogas como a clindamicina Normalmente não pode entrar na célula gram-negativa. Painel (A) desta figura foi modificado de Brennan-Krohn, Pironti e Kirby 201816, copyright © American Society for Microbiology, agentes antimicrobianos e quimioterapia, 62(10), 2018, pii: e00873-18, doi: 10.1128/AAC.00873-18. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Os dois métodos descritos aqui ambos fornecem informações sobre a atividade dos antimicrobianos utilizados em combinação em relação à sua atividade individual. O automatizado, jato de tinta impressora assistida digital método de distribuição é uma adaptação do método descrito no manual de procedimentos de Microbiologia clínica33, enquanto o método kill-tempo segue mais pròxima o protocolo correspondente da mesma referência34.

No método de matriz de tabuleiro de damas, cálculos para determinar o volume necessário de estoque antimicrobiana para adicionar para cada poço, bem como a distribuição desses volumes é automatizada, eliminando assim algumas das principais fontes potenciais de erro encontrado em um manual matriz do tabuleiro de damas. É ainda essencial, entretanto, que o investigador determina que ações originais são feitas na concentração pretendida e que concentrações finais de gol são inseridas o D300 software corretamente. Adicionando suspensão do antimicrobiana para poços de uma placa de 384 pode ser um desafio no início e requer cuidados de garantir essa pipeta dicas entram os poços apropriados e o líquido não molha faz até as bordas dos poços. Um manipulador de líquido automático pode ser usado no lugar de uma pipeta multicanal portátil para aumentar a velocidade e precisão com a qual a suspensão bacteriana é adicionada aos poços. Conforme descrito no protocolo, a D300 requer a adição de tensoativo, polissorbato 20 (P-20), para manipulação de líquidos adequada. Um surfactante diferente, Polissorbato 80, em uma concentração de 0,002%, tem sido observado para abaixar a colistina microfones para organismos com colistina microfones de < 2 µ g/mL em caldo padrão como ensaios. 35 , 36 o nosso laboratório anteriormente demonstrou que P-20 em concentrações até 0,0015% não teve efeito na D300-assistida MIC resultados em comparação com referência a BMD14. No exemplo do ensaio apresentado aqui, a máxima P-20 é concentração é 0.0014%.

Um problema que encontramos com alguns ensaios de matriz de xadrez foi um grande número de poços saltados. Isso ocorreu em uma taxa desproporcional com certos antibióticos. Especificamente, em uma tela de combinações contra uma coleção de resistentes aos carbapenemas Enterobacteriaceae, descobrimos que enquanto 49 de 521 ensaios (9,4%) estava inutilizável devido a vários poços saltados, 2 dos 12 antibióticos testados (Fosfomicina e cefepime) representaram 46 desses ensaios (94%). Tal aumento das taxas pode ser mais provável em drogas que são particularmente suscetíveis ao inóculo efeito31,32,37. Digno de nota, CLSI não recomenda testar Fosfomicina em caldo diluição25 devido a preocupações sobre a fiabilidade dos resultados com este método, o que pode explicar os resultados não-confiáveis vistos com esta droga. Algumas modificações podem ser feitas ao método automatizado quadriculado de acordo com a preferência do investigador. Agentes antimicrobianos podem ser dispensados em chapas já contendo a suspensão bacteriana, ao invés de nos poços vazios, se isso é preferível por motivos de fluxo de trabalho dentro do laboratório. Enquanto placas boas 384 foram usadas aqui, o método também pode ser realizado em ensaios de placa de 96 poços, com modificação apropriada de volume bem. O uso de um formato de placa de 96 poços pode ajudar a reduzir poços saltados para antibióticos que são particularmente sensíveis a pequenas mudanças no inóculo. Ao calcular a FICeu, pode haver situações em que o MIC é fora de escala (ou seja, mais do que testado), incluindo situações onde a droga que está sendo testada não tem atividade individualmente contra o tipo de organismo a ser testado. Nestes casos, a FIC pode ser calculada com base na assumindo que o MIC é uma diluição maior do que a maior concentração testada. Esta é a estratégia mais conservadora, vez que assume o valor FIC máximo possível para qualquer diluição onde a inibição é observada durante o teste de sinergia. Por exemplo, se o MIC real em vez disso foram duas diluições dobra acima maior concentração testada, então os FICs correspondentes seria duas vezes mais baixo do que o conservadoras atribuições e assim por diante.

Para avaliar com precisão a atividade bactericida de drogas em um ensaio de tempo de matar, é essencial que as culturas em fase logarítmica de crescimento, particularmente quando ativo antibióticos parede celular estão sendo testado28. Para que as bactérias de rápido crescimento usadas neste exemplo (K. pneumoniae), 3 horas de incubação com agitação era apropriado para chegar a esta fase de crescimento, mas diferentes quantidades de tempo podem ser necessárias para organismos diferentes. Em geral, a cultura deve aparecer visivelmente mas não fortemente turva. A quantidade adequada de tempo pode ser determinada através da construção de uma curva de crescimento com contagens de colônia tomadas no tempo serial pontos (por exemplo, cada 30 min para 4-6 h)38. O inóculo inicial pretendido no estudo de tempo-mate também é importante. A concentração alvo do inóculo inicial é aproximadamente 5 x 105 1 x 106 UFC/mL. A diluição descrita aqui (100 μL de 1,0 suspensão McFarland em 10 mL de mídia) gera este inóculo para Klebsiella pneumoniae e outras espécies de Enterobacteriaceae em que nós testamos. Se a densidade das partida inóculos em um experimento usando diferentes organismos é significativamente mais alto ou mais baixo do que isso, pode ser necessária uma diluição diferente. (A diluição adequada necessária para uma dada espécie pode ser determinada através da realização de uma contagem de placa de uma suspensão de McFarland 0,5 ou 1,0 para determinar quantos organismos esta turbidez representa, em seguida, calcular o montante pelo qual a suspensão inicial deve ser diluído para atingir a concentração final apropriada). Se, na avaliação das contagens das placas do estudo de sinergia, encontra-se o inóculo inicial de qualquer um dos tubos contendo antibiótico ter sido significativamente menor do que o inóculo inicial do controle de crescimento, isso pode indicar qualquer antibiótico reporte ou muito morte rápida de bactérias no breve tempo entre a adição de bactérias no tubo contendo antibiótico e eliminação da alíquota para o chapeamento. Se o número real de colônias na gota não diluída em uma série é menor que o número de colônias nas diluições subsequentes, isto sugere efeito antibiótico reporte. Diferentes opções têm sido descritas para evitar este efeito, incluindo espalhando uma única alíquota sobre um prato inteiro de38 ou girando a amostra, remover o sobrenadante e re-suspensão em soro fisiológico estéril antes do chapeamento39. Em cada ponto de tempo no método tempo-matar, também é fundamental para o investigador eficientemente, mas com precisão remover uma alíquota de cada tubo de cultura e executar diluições em série. Atrasos durante este processo, particularmente durante os primeiros pontos de tempo que ocorrem em sucessão fechar, podem levar a períodos prolongados, durante o qual as culturas não são foram incubados e abalada, Considerando que o manuseio descuidado e diluições em série podem levar a placa imprecisa conta. Em comparação com o método de placa de propagação de contagem de placa, na qual 100 μL de cada diluição é espalhada sobre uma placa de ágar inteiro, o método de placa de drop descrito é muito mais rápida, exige um número muito menor de placas de ágar e permite a contagem mais rápido, como o máximo número contável de colónias por cada gota é 30, Considerando que até 300 colônias normalmente pode ser contada de uma placa de expansão. No entanto, o método de placa de expansão também é uma opção se os investigadores estão mais confortáveis com esta técnica. Se gotas se espalhou no outro, depois com uma pipeta multicanal de distribuição, pode ser realizada aplicação individual de gotas mais amplamente espaçadas, com uma pipeta de canal único. Em nossa experiência, refrigerar placas a 4 ° C, antes da distribuição de gotas parecia reduzir a propagação excessiva.

Uma limitação das técnicas descritas aqui é que os resultados dos dois tipos de ensaio de sinergia (matriz de tabuleiro de damas e tempo-kill) nem sempre são concordantes, e como mais artigos publicados de sinergia usam um método ou o outro ao invés de ambos juntos, pode ser difícil saber como integrar dados entre os dois tipos de ensaios. Porque o método de matriz de quadriculado automatizado desenvolvemos é simples e elevado-throughput, usamos isso em vigor como uma espécie de tela para testar combinações contra um maior número de isolados e para determinar quais combinações de concentração são sinérgicas. Realizamos então um número menor de estudos… matar tempo, selecionando combinações e concentrações que tinham sido eficazes na matriz do tabuleiro de damas. Digno de nota, porque o ensaio de xadrez geralmente é executado em uma escala de diluição de microbroth, enquanto o ensaio de tempo-mate usa volumes maiores (semelhantes a uma diluição de macrobroth), encontramos que FICs às vezes eram diferentes entre os dois métodos, com maior concentrações geralmente exigidas no ensaio de tempo… matar para demonstrar a atividade. Este fenómeno tem sido observado anteriormente, quando macrobroth e microbroth diluição MIC ensaio resultados são comparados para bacilos Gram-negativos26 e quando inóculos maiores (como usado em estudos de tempo-mata) são comparados com o inóculo padrão usado em matriz de diluição e xadrez microbroth ensaios32. Uma limitação específica da matriz quadriculado é a variabilidade inerente em diluição microbroth MIC teste22. Enquanto FICeu cortes por conta de sinergia para esta variabilidade matematicamente6 tal variabilidade inevitavelmente gera preocupação sobre a confiabilidade e a consistência dos resultados de matriz do tabuleiro de damas.

Devido às limitações inerentes à sinergia tudo in vitro testar métodos (incluindo o cultivo de bactérias em um meio de crescimento artificial, concentrações de antibiótico estáticas e um curso de tempo limitado), os resultados obtidos por esses métodos devem ser confirmados e mais avaliada usando técnicas complementares. Tais métodos incluem estudos in-vitro farmacocinético/farmacodinâmico (PK/PD) (por exemplo, a fibra oca infecção modelo40), modelos animais e, finalmente, estudos humanos PK/PD e eficácia. O método de matriz de quadriculado automatizado descrito aqui, fornecendo um método rápido com os quais a combinações de tela para potencial atividade sinérgica, permite mais direcionado a utilização destas técnicas. Ainda mais a automação de todos estes métodos, como a investigação bem como mais sistemática da relação entre parâmetros in vitro e os resultados clínicos, será importante no dimensionamento até o uso de sinergia, testes e aumentando a sua aplicabilidade clínica.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Thea Brennan-Krohn foi apoiada por uma Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health e Infectologia Pediátrica desenvolvimento humano pesquisa formação grant (T32HD055148), um Instituto Nacional de alergia e doenças infecciosas (de subsídio de formação T32AI007061), bolsa de Hospital escritório da faculdade Faculdade carreira desenvolvimento infantil Boston e o Instituto Nacional de alergia e doenças infecciosas carreira desenvolvimento award (1K08AI132716). J.E.K. foi apoiada pelo Instituto Nacional de alergia e doenças infecciosas dos institutos nacionais de saúde, sob número prêmio R33 AI119114. O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do institutos nacionais da saúde.

Materials

Escherichia coli strain ATCC 25922 ATCC 25922 QC strain
0.5 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1605-0000
1 L 0.22 µm bottle-top filter Thermo Scientific Nalgene 597-4520
12 mm x 75 mm borosilicate glass round bottom culture tubes Fisherbrand 14-961-26
15 mL conical tubes Phenix SS-PH15
15 x 100 mm or 15 x 150 mm Mueller Hinton agar plates Thermo Scientific R01620 or R04050
25 mm stainless steel closures for 25 x 150 mm glass culture tubes Bellco 2005-02512
25 x 150 mm borosilicate glass round bottom culture tubes Bellco 2011-25150
348-well sterile clear, flat-bottom, untreated microplates with lids Greiner Bio-One 781186
50 mL conical tubes Phenix SS-PH50
50 mL sterile reagent reservoirs Corning 4870
96 deep well polypropylene microplate with 2 mL wells Fisherbrand 12-566-612
96-well sterile clear, round-bottom, untreated microplates with lids Evergreen 222-8032-01R
Cation adjusted Mueller Hinton broth BD Diagnostics 212322
Colistin sulfate Alfa Aesar J60915
D300e Control Software HP/Tecan
DensiCHEK Plus McFarland reader bioMérieux 21250
Excel spreadsheet software Microsoft
Extra long SHARP 10 µL Precision Barrier Tips Denville Scientific P1096-FR
HP D300 digital dispenser HP/Tecan
HP D300 T8+ cassettes HP/Tecan 30097370
Minocycline hydrochloride Chem-Impex 14302
Picus 12-channel 10-300 µL pipette Sartorius 735461
Polysorbate 20 Fisher Bioreagents BP-337 Brand name: Tween 20
Sodium chloride Fisher Chemical S271
Spectrophotometer Tecan Infinite M1000 PRO
Xplorer 12-channel 50-1200 µL pipette Eppendorf 2231000328
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References

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Brennan-Krohn, T., Kirby, J. E. Antimicrobial Synergy Testing by the Inkjet Printer-assisted Automated Checkerboard Array and the Manual Time-kill Method. J. Vis. Exp. (146), e58636, doi:10.3791/58636 (2019).
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