JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Antimicrobiële synergie testen door de Inkjet Printer-bijgewoonde geautomatiseerde dambord matrix en de handmatige methode van de tijd-kill

Published: April 18, 2019
doi:
10.3791/58636
,
1Department of Pathology,Beth Israel Deaconess Medical Center, 2Division of Infectious Diseases,Boston Children’s Hospital, 3Harvard Medical School

Summary

Antimicrobiële synergie testen wordt gebruikt ter beoordeling van het effect van twee of meer antibiotica in combinatie gebruikt en worden doorgaans uitgevoerd door een van twee methoden: de dambord array of de bepaling van de tijd-doden. Hier presenteren we een geautomatiseerd, inkjet printer-bijgewoonde dambord matrix synergie techniek en een studie van de klassieke tijd-kill synergie.

Abstract

Aangezien tarieven van multiresistente (MDR) ziekteverwekkers stijgen blijven, overtreft de ontwikkeling van nieuwe antimicrobiële stoffen, zijn nieuwe benaderingen voor de behandeling van MDR bacteriën steeds een noodzaak. Een dergelijke aanpak is combinatietherapie, in welke twee of meer antibiotica samen worden gebruikt voor de behandeling van een infectie tegen welke een of beide van de drugs kunnen ineffectief alleen. Wanneer twee geneesmiddelen, in combinatie, een grotere uitoefenen dan additief effect, worden zij beschouwd als synergetische. In vitro onderzoek van synergetische activiteit is een belangrijke eerste stap bij het beoordelen van de mogelijke werkzaamheid van drug combinaties. Twee belangrijkste synergie van in vitro-testmethoden zijn ontwikkeld: het dambord-array en de studie van de tijd-doden. In deze paper presenteren we een geautomatiseerde dambord matrix methode die gebruik maakt van inkjet printing technologie te verhogen van de efficiëntie en nauwkeurigheid van deze techniek, evenals een standaard handmatige tijd-kill synergie-methode. De geautomatiseerde dambord-array kan dienen als een high-throughput screening assay, terwijl de handmatig tijd-kill studie extra, aanvullende gegevens over synergetische activiteit en moord biedt.

De array dambord is een wijziging van de standaard minimale remmende concentratie (MIC) testen, waarin bacteriën zijn geïncubeerd met antibiotica op verschillende concentratie combinaties en geëvalueerd voor groeiremming na een incubatieperiode van de overnachting. Handmatige uitvoering van de array dambord vereist een bewerkelijke en foutgevoelige reeks berekeningen en verdunningen. In de geautomatiseerde methode hier gepresenteerd, de berekening en de verstrekking van de vereiste antibiotica stockoplossing volumes worden geautomatiseerd met behulp van inkjet printertechnologie. In de tijd-kill synergie assay, zijn bacteriën geïncubeerd met de antibiotica van belang, zowel samen als individueel, en bemonsterd met tussenpozen in de loop van de 24 h voor kwantitatieve cultuur. De resultaten kunnen bepalen of een combinatie synergetische is en of het bactericide, en verstrekken van gegevens over remming en doden van de bacteriën na verloop van tijd.

Introduction

De verspreiding van multiresistente (MDR) bacteriële pathogenen, met name MDR gramnegatieve bacteriën zoals carbapenem-resistente Enterobacteriaceae (CRE), heeft clinici verlaten met steeds beperkte opties voor succesvolle infectiebestrijdende therapie 1, een probleem verergerd door het trage tempo van de roman antibacteriële drug discovery2,3. Antimicrobiële synergie, waarin twee geneesmiddelen die gebruikt worden in combinatie een groter-dan-additief effect oefenen, biedt de mogelijkheid van berging van bestaande antibiotica voor gebruik bij behandeling van MDR bacteriën, zelfs wanneer deze bacteriën resistent zijn tegen een of beide van de antibiotica individueel. De technieken beschreven in dit document bieden twee complementaire methoden voor in vitro synergy tests die, wanneer samen gebruikt, staan onderzoekers aan efficiënt scherm antimicrobiële combinaties van belang voor het bewijs van de synergetische activiteiten (de geautomatiseerde Dambord matrix methode) en vervolgens verder evalueren de kinetiek van inhibitie en doden aangetoond door veelbelovende combinaties geïdentificeerd in het stadium van de screening (de handmatige methode-tijd-kill).

Een van de meest gebruikte methoden voor het testen van in vitro synergie is de bepaling van de matrix Dambord, een wijziging van het testen van de minimaal remmende concentratie (MIC) waarin de inhiberende activiteit van twee verschillende antibiotica tegen een bacteriële isoleren worden getest over een bereik van concentratie combinaties4,5. Als de twee drugs groter is dan de additieve activiteit uitoefenen wanneer samen gebruikt, wordt de combinatie synergetische6beschouwd. Echter omvat een dambord matrix handmatig instellen een reeks van berekeningen en verdunnen en pipetting stappen die moeizaam en kwetsbaar voor menselijke fouten zijn. Deze beperkingen hebben het effect van het beperken van het gebruik van de synergie voornamelijk aan de retrospectieve beoordeling van kleine aantallen antibiotica combinaties en bacteriële isolaten van het testen, en resultaten niet altijd hebben consistente tussen studies7, 8,9,10,11. Bovendien, de complexiteit van het testen van synergie heeft bijgedragen tot de onbeschikbaarheid in het laboratorium klinische microbiologie en de virtuele afwezigheid van in vitro synergie testgegevens van klinische studies van combinatie therapie12, 13.

Teneinde de doeltreffendheid en de doorvoer van het dambord matrix methode, maakten we gebruik van een geautomatiseerd testen MIC-techniek met de eerder ontwikkelde in ons laboratorium die gebruikmaakt van inkjet printing technologie om precies en consequent afzien kleine volumes van antibiotica stockoplossing in putten in een microtiterplaat plaat14. Het platform ondervangt de behoefte aan complexe berekeningen en meerdere pipetting stappen. De bijbehorende software berekent en uitdeelt passende hoeveelheid antibiotica een tweedimensionale dambord-array maken als de gebruiker eenvoudig de gewenste concentratiebereik ingangen en concentratie van de stockoplossing van de antibiotica. We in eerste instantie getest deze methode tegen een verzameling van CRE isolaten15 en vervolgens hebben gericht op testen colistine-bevattende combinaties voor activiteit tegen colistine-resistente isolaten16. Colistine is een drug van laatste redmiddel doorgaans gereserveerd voor gebruik bij de behandeling van MDR gramnegatieve ziekteverwekkers17,18, en colistine weerstand maakt al MDR bacteriën bijna pan-resistente19, waardoor ze ideaal zijn kandidaten voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën door middel van de drugs waarnaar ze ongevoelig individueel zijn. We vonden dat de combinatie van colistine en de eiwit synthese remmer antibiotica minocycline had een zeer hoge mate van synergie, zelfs tegen stammen die resistent aan elk van deze drugs individueel, vermoedelijk waren omdat colistine een subinhibitory oefent permeabilizing effect op zelfs colistine-resistente bacteriën. Wij hebben besloten deze combinatie te gebruiken als een voorbeeld in dit document. Van de nota, kan synergie testen ook worden gebruikt om te evalueren voor verbeterde doeltreffendheid van twee geneesmiddelen die beide effectief individueel.

De geautomatiseerde dambord matrix methode vergemakkelijkt de snelle, hoge-doorvoer synergie testen. Het dambord matrix methode hoeft echter beperkingen. Als een gemodificeerde MIC assay, het levert gegevens alleen op de remming van de groei van bacteriën en niet op doden en biedt geen gegevens over antibiotica effecten na verloop van tijd. Daarentegen, handmatige prestaties van tijd-kill synergie tests is meer arbeidsintensief maar geeft informatie over zowel inhibitie en doden over een 24-uurs tijd cursus20,21. We gebruikten tijd-kill analyse op een kleiner aantal isolaten onze dambord matrix resultaten te bevestigen en om te bepalen of de synergetische combinaties die we geïdentificeerd ook bactericide waren.

Beide methoden dambord array en tijd-kill synergie waardevolle informatie verstrekt over de activiteit van de drug combinaties en zijn vooral handig bij het evalueren van potentiële nieuwe therapeutische opties voor zeer resistente bacteriële pathogenen. De methoden hebben ook inherente beperkingen. De standaard microbroth verdunning MIC-methode heeft een bekende verwachte foutbereik van 1 dubbele verdunning22, die wordt verhoogd wanneer twee geneesmiddelen samen worden getest in een dambord-matrix. De standaard definitie van synergie, die acht dat een synergetische combinatie alleen als de drugs die samen op een vierde hun respectieve MICs6, actief zijn rekening wordt gehouden met dit verwacht variabiliteit, maar dergelijke variabiliteit (die wordt verondersteld te leiden tot uit een combinatie van biologische en technische schommelingen23) onvermijdelijk genereert onzeker over de betrouwbaarheid van de resultaten van de synergie. Het gebrek aan vastgestelde normen van de kwaliteitscontrole voor het testen van synergie is ook een huidige beperking. Misschien is de belangrijkste beperking van alle methoden voor het testen van synergie is het ontbreken van gevestigde correlaties tussen in vitro resultaten en klinische resultaten wanneer combinaties worden gebruikt voor de behandeling van patiënten24. Sneller en eenvoudiger synergie testmethoden, zoals de geautomatiseerde dambord matrix methode hier beschreven, kan het vergemakkelijken van de integratie van in vitro synergie testen binnen de klinische proeven of andere evaluaties van patiëntenoutcomes om beter kenmerkend zijn voor de relatie tussen in vitro en in vivo effecten in de toekomst.

De geautomatiseerde dambord matrix methode die wij hier presenteren biedt een premieaffaire voor high-throughput screening van een aantal combinaties en zorgt voor snelle evaluatie van ongewone, “hoog risico-hoge beloning” combinaties zonder een grote investering van tijd en middelen. De tijd-kill-methode, die we vervolgens aantonen, extra ondersteunende informatie kan verschaffen over de synergetische activiteiten van de combinatie en kan helpen om te karakteriseren zijn bactericide activiteit en antibacteriële kinetiek.

Protocol

Let op: Gebruik juiste veiligheidsprocedures wanneer u werkt met bacteriën. Draag handschoenen en een laboratoriumjas te allen tijde. Werken in een bioveiligheid kabinet als aërosolen wordt gegenereerd of werken met hoog risico ziekteverwekkers. Opmerking: Twintig tot en met 24 h voordat experimenten, streak uit de bacteriële isolate(s) te beproeven (uit een kolonie-gezuiverd, minimaal gepasseerd voorraad bevroren bij-80 ° C in al soja bouillon met 50% glycerol voorraad) op een bloed agarplaat. Incubeer de plaat bij 35 ° C in de lucht. 1. Inkjet Printer-bijgewoonde geautomatiseerde dambord Array synergie Antimicrobiële stockoplossingen (colistine en minocycline) maken Bepalen van antibiotica stockoplossing concentraties op basis van de oplosbaarheid van antibiotica en gewenste eindconcentraties in dambord matrix. Maken van 10 mg/mL voorraden colistine en minocycline voor dit voorbeeld. Gebruik de CLSI-M100 document om te bepalen van de geschikte oplosmiddelen voor elke antibiotica25. Zowel colistine en minocycline zijn oplosbaar in water; omdat de D300 inkjetprinter de toevoeging van een oppervlakteactieve stof voor juiste waterige Vloeistofbehandeling vereist, Los de antibiotica in ultrazuiver gedeïoniseerd water met 0,3% Polysorbaat 20. Weeg antibiotica poeder met behulp van een analytische balans en berekenen van de hoeveelheid oplosmiddel die nodig zijn voor het verkrijgen van doel voorraad concentratie. Als het antibioticum wordt geleverd als een zout (bijvoorbeeld colistine sulfaat, minocycline hydrochloride) of in gehydrateerde vorm (zoals meropenem Trihydraat), of als het is gemeld door de fabrikant te hebben van minder dan 100% zuiverheid, voeren een sterkte berekening26 tot en met bepaalt de hoeveelheid oplosmiddel nodig. Volg dit voorbeeld van minocycline hydrochloride met een vermelde zuiverheid van 900 mg/mg:Assay zuiverheid: 900 mg/mgWatergehalte: geenActieve breuk: 0.926 (verkregen door het verdelen van het molecuulgewicht van minocycline (457.48 Da) door het molecuulgewicht van minocycline hydrochloride (493.94 Da)).Potentie (Assay zuiverheid) = * (1-watergehalte) * (actieve Fractie)= (900 mg/mg) * (1) * (0.926) = 833.4 mg/mg of 83.34%Vervolgens bepalen de hoeveelheid oplosmiddel die nodig is als volgt:Volume (mL) = [gewicht (mg) * sterkte (mg/mg)] ÷ [concentratie (mg/mL)]Dus bijvoorbeeld als 34.7 mg minocycline hydrochloride poeder is afgewogen, gebruik de volgende berekening om te bepalen van de hoeveelheid oplosmiddel die nodig zijn om een oplossing van 10 mg/mL:Volume = (34.7 mg) * (833.4 mg/mg) = 2.89 mL10.000 mg/mL Giet antibiotica poeder in een conische tube van 15 mL en voeg de juiste hoeveelheid water plus 0,3% Polysorbaat 20. Vortex tot het is opgelost. Hoeveelheid antibiotica stockoplossing in 0,5 mL microcentrifuge buizen en winkel bij-80 ° C tot klaar voor gebruik. Kwaliteitscontrole (QC) van antimicrobiële voorraden voor gebruik in dambord matrix proeven ten minste één dag voorafgaand aan synergie testen zodat QC resultaten kunnen worden geëvalueerd alvorens de voorraad te gebruiken voor het testen van synergie uitvoeren.OPMERKING:De hier beschreven QC-techniek is identiek aan de techniek die zou worden gebruikt voor het testen van de minimaal remmende concentratie (MIC) van individuele drugs en als zodanig kan worden gebruikt met elke stammen van belang zijn voor de onderzoeker.Maak bacteriële suspensie. Neem een aliquoot gedeelte van elke antibiotica voorraad uit de vriezer-80 ° C te ontdooien terwijl de voorbereiding van bacteriële suspensie. Vortex eenmaal ontdooid om ervoor te zorgen dat het antibioticum in oplossing. Selecteer een geschikte QC-stam en bepalen het acceptabele bereik van de MIC voor drugs wordt getest op basis van tabel 5 bis-1 in CLSI M10025. Gebruik voor de drugs hier, E. coli ATCC 25922; het bereik van de MIC voor deze spanning wordt er 0,25-1 mg/mL voor minocycline en 0,25-2 mg/mL voor colistine. Selecteer een bereik van antibiotica concentraties te testen die het gehele bereik van de QC zal omvatten. Gebruik het bereik van 0.0156 mg/mL 8 mg/mL voor minocycline en colistine voor ATCC 25922. Voeg 1 mL natriumchloride 0,9% tot een 12 x 75 mm ronde onderkant glazen cultuur buis. Selecteer één of twee koloniën in een overnachting plaat van ATCC 25922 en vortex voorzichtig op te schorten. Controleer de concentratie van bacteriën McFarland lezer gebruikt. Naar wens aanpassen door het toevoegen van meer 0,9% natriumchloride of meer bacteriën te bereiken een 0.5 McFarland troebelheid lezen. Een verdunning van de 1:300 van de 0.5 McFarland schorsing maken door toevoeging van 100 mL van de ophanging aan catie-aangepast Mueller-Hinton Bouillon (CAMHB) in een conische buis van 50 mL te bereiken van een definitieve celdichtheid van 5 x 105 CFU/mL, 30 mL, zoals aanbevolen door CLSI27. Met behulp van een steriele inoculating lus, isolatie streep een val van de startende entmateriaal op een bord bloed agar te bevestigen entmateriaal zuiverheid, Incubeer bij 35 ° C in de lucht. Antimicrobiële stoffen toevoegen aan een flat-onder, vierkant-well, duidelijk, onbehandelde 384-well plaat met behulp van de D300. Voer deze stap onmiddellijk na de voorbereiding van bacteriële suspensie, zodat de schorsing kan worden toegevoegd aan de platen binnen 15 min van voorbereiding26. Zet de D300 inkjet-printer en de bijbehorende computer. Open het programma. Maak een nieuw bestand. Boven de afbeelding van het raster van de plaat, met de rechtermuisknop op bord 1 en kies bewerken plaat. Selecteer de juiste plaat type (384 goed) en extra volume (50 mL). Vloeistoffen (dat wil zeggen, antibiotica voorraden) aan het protocol toevoegen door te klikken op het plusteken naast vloeistoffen op het linker paneel. Het toevoegen van twee vloeistoffen (colistine en minocycline). Beweeg over het paneel dat voor Fluid 1 verscheen en klik op het potlood om te bewerken. De vloeistof “Colistine” naam, klasse te wijzigen “Aqueous + tween-20”, wijzigen concentratie tot 10.000 en concentratie eenheden tot mg/mL (Let erop dat de voorraad concentratie 10 mg/mL, d.w.z. is, 10.000 mg/mL). Doseer by laat op concentratie en laat de rest van de velden op hun standaardinstellingen. Klik op OK. Herhaal de bovenstaande procedure voor Fluid 2 (minocycline). Klik op het tabblad van het Huidige Protocol boven aan het scherm en wijzigen mg/mL om te bepalen welke maateenheid wordt gebruikt voor goed antibioticum eindconcentraties concentratie (massa) . 10 putten in het raster door op te klikken en te slepen, klik vervolgens op titratie aan de bovenkant van het scherm. Voor opgeven met behulp van titratie Selecteer hoogste concentratie, voor Fluid colistine kiest, voor de Hoogste concentratie voert u 8 (zorg ervoor dat eenheden zijn mg/mL), en voor distributie Selecteer 1:2 (50%). Laat de standaard waarden in plaats voor de rest van het venster en klik op OK. Herhaal de bovenstaande procedure voor minocycline voor het genereren van de titratie met minocycline. Opslaan van het protocol, en klik op de knop uitvoeren links bovenaan. Klik op de knop Start . Laad een 384-well-plate (met deksel verwijderd) in de houder plaat en druk op geladen onder de “Load plaat 1 – Synergy” weergegeven.Opmerking: Deze prompt wordt gekozen door de software en geeft niet aan dat synergie testen wordt uitgevoerd. Plaats een T8 + cassette in hetcassettevak en druk op geladen onder de belasting een T8 + cassette weergegeven. Desgevraagd toevoegen antibiotica stockoplossing aan de aangegeven reservoirs op de cassette. Volg de instructies op het scherm voor het laden van de juiste en afzien zorgvuldig om te voorkomen dat je bubbels in de oplossing. Nadat elke oplossing is toegevoegd, drukt u op de knop gevuld . Zodra de inkjetprinter heeft toegevoegd antibiotica voorraad in geschikte volumes aan elk putje en het voltooide uitvoeren wordt weergegeven, klikt u op sluiten, verwijderen van de plaat en uitschakelen van de D300. Bacteriële schorsingen toevoegen aan 384-well plaat en plaat uit te broeden. Giet de eerder bereid bacteriële suspensie in een steriele reagens reservoir. Gebruik een meerkanaalspipet 50 mL voor bacteriële suspensie toevoegen aan alle antibioticum-bevattende putjes. Voeg 50 mL CAMHB zonder bacteriën aan een lege putje; Dit zal de negatieve controle goed te bevestigen steriliteit van de media. Plaats van de plaat in een incubator van de omgevingslucht 35 ° C en incubeer gedurende 16-20 h26.Opmerking: Een andere duur van incubatie kan dienen als organismen, andere dan Enterobacteriaceae worden getest; Raadpleeg CLSI M10025 voor organisme-specifieke aanbevelingen. Plaat op een microplate-reader op een optische dichtheid van 600 (OD600) lezen en analyseren van resultaten. Cellen met een waarde600 OD ≥0.07 groen, met vermelding van de groei en cellen met een waarde van een werkbladprogramma gebruiken, arceren < 0.07 rood, die aangeeft geen groei.Opmerking: Deze waarden werden bepaald op basis van visuele inspectie van groei vs. geen groei en correlatie met OD lezingen voor deze experimenten; OD600 lezingen uit putten met media alleen waren lager 0.07 consequent. Passende cutoffs afwijken met verschillende plaat lezers en bacteriën. Het bepalen van de MIC voor elk medicijn. De MIC is de laagste concentratie van drug waartegen bacteriegroei wordt geremd. Als de microfoon binnen het verwachte bereik van QC volgens de CLSI M100 document25 is, is de stockoplossing geschikt voor gebruik. Maak bacteriële suspensie voor dambord matrix. Neem een aliquoot gedeelte van elke antibiotica voorraad uit de vriezer-80 ° C te ontdooien terwijl de voorbereiding van bacteriële suspensie. Vortex eenmaal ontdooid zodat antibioticum is in oplossing. Voeg ~ 1 mL natriumchloride 0,9% tot een 12 x 75 mm ronde onderkant glazen cultuur buis. Selecteer één of twee koloniën in een overnachting plaat van bacteriën (in dit geval, E. coli -stam FDA-CDC 0494) en vortex voorzichtig op te schorten in de natriumchloride 0,9%. Controleer de concentratie van bacteriën McFarland lezer gebruikt. Naar wens aanpassen door het toevoegen van meer 0,9% natriumchloride of meer bacteriën te bereiken een 0.5 McFarland troebelheid lezen. Een verdunning van de 1:300 van de 0.5 McFarland schorsing maken door toevoeging van 100 mL van de schorsing tot 30 mL van CAMHB in een conische buis van 50 mL te bereiken van een definitieve celdichtheid van 5 x 105 CFU/mL27. Antimicrobiële stoffen toevoegen aan een flat-onder, vierkant-well, duidelijk, onbehandelde 384-well plaat met behulp van de D300.Opmerking: waarnemen zulks trede onmiddellijk na de voorbereiding van bacteriële suspensie, zodat de schorsing kan worden toegevoegd aan de platen binnen 15 minuten van voorbereiding26. Schakel de inkjetprinter, start een nieuw bestand en vloeistoffen toevoegen aan het protocol zoals in stappen 1.2.2.1-1.2.2.3. Het raster synergie te genereren. Klik op het pictogram van de synergie bij de bovenkant van het scherm en doorloop de stappen. Voor Type selecteert u twee of meer vloeistoffen factored samen. Voor plaatis het niet nodig om uit te sluiten van alle putten; Klik op volgende op deze stap zonder wijzigingen. Voer op het tabblad titratie de antibioticum concentratie en de plaatsing. Om toe te voegen minocycline in het verminderen van de verdubbeling verdunningen van 32 tot 0.031 mg/mL, naast een negatieve goed met geen antibioticum, beneden de y -as, voer 12 voor titratie niveaus op het linker paneel. Voor het gebruik van de titratie opgeven, Selecteer hoogste concentratie; Selecteer voor vloeistof, Minocycline; voor de hoogste concentratie, dan voert u 32 (zorg ervoor dat de eenheid ligt bij mg/mL; zo niet, sluit het dialoogvenster synergie en veranderen onder het tabblad Huidige Protocol ). Zorg ervoor dat het waardevak bevatten 0 wordt gecontroleerd. Distributie omzetten in 1:2 (50%). Herhaal deze stappen voor colistine op het rechter paneel, met behulp van de 12 titratie niveaus en een hoogste concentratie van 16. Klik op volgende. Kies titratie niveaus van eerste 2 vloeistoffen bepalen het aantal rijen en kolommen in een lay-outrasterop het tabblad indeling . Klik op volgende. Als het raster wordt weergegeven zoals verwacht, klikt u op Voltooien. Opslaan van het protocol, en klik vervolgens op uitvoeren links bovenaan. Klik op de knop Start . Laad een 384-well-plate (met het deksel verwijderd) in de houder plaat en druk op geladen onder de belasting plaat 1 – synergie weergegeven. Plaats een T8 + cassette in hetcassettevak en druk op geladen onder de belasting een T8 + cassette weergegeven. Desgevraagd toevoegen antibiotica stockoplossing aan de aangegeven reservoirs op de cassette. Volg de instructies op het scherm voor het laden van de juiste en afzien zorgvuldig om te voorkomen dat je bubbels in de oplossing. Nadat elke oplossing is toegevoegd, drukt u op de knop gevuld . Zodra de D300 dispenser heeft toegevoegd antibiotica voorraad in geschikte volumes aan elk putje en het voltooide uitvoeren wordt weergegeven, klikt u op Afsluiten, de plaat te verwijderen en uitschakelen van de D300. Bacteriële schorsingen toevoegen aan 384-well plaat en plaat uit te broeden. Giet de eerder bereid bacteriële suspensie in een steriele reagens reservoir. Gebruik een meerkanaalspipet toe 50 mL van de ophanging aan alle putjes in de matrix dambord. Voeg 50 mL CAMHB zonder bacteriën aan een lege putje; Dit zal de negatieve controle goed te bevestigen steriliteit van de media. Incubeer in een incubator omgevingslucht 35 ° C voor 16-20 h26. Lees plaat op een lezer microplate bij OD600 en dambord matrix resultaten analyseren. Eerst, Controleer de zuiverheid plaat en ervoor zorgen dat de geïsoleerde kolonies van een enkele morfologie die strookt met de verwachte morfologie van het organisme wordt getest. Een werkbladprogramma gebruiken, om en om arceren cellen om groei en geen groei zoals in stap 1.2.4.1 te geven. Het bepalen van de MIC voor elk medicijn. Voor een geneesmiddel dat niet de groei van de bacteriën op de hoogste geteste concentratie remmen doet, de MIC wordt beschouwd als af-schaal. Voor elk putje waarin de groei wordt geremd, bepaal de fractionele remmende concentratie (“fic”) voor elke antibiotica op basis van de dat antibioticum MIC (Zie figuur 1B en figuur 2B).Opmerking: Het “fic” is de verhouding van de concentratie van een antibioticum in een put waarin groei wordt geremd zijn Mic; dus voor een geneesmiddel met een MIC van 8 mg/mL, een goed met 8 mg/mL dat drugs een “fic” van 1, heeft terwijl een goed met 4 mg/mL een “fic” van 0,5 heeft. De fractionele remmende concentratie index (“fic”ik) waarde berekend voor elk putje waarin de groei wordt geremd als de som van de FICs van elk van de drugs in dat goed. Bepaal de laagste “fic”ik waartegen groei is geremd (minimum “fic”ik). Als de minimale “fic”ik £0,5, kunt u overwegen de combinatie synergetische; als 0.5-4, overwegen de combinatie onverschillig; en als > 4, overwegen de combinatie antagonistische. Als de combinatie synergetische op sommige combinaties van de concentratie maar antagonistische op anderen is, Let op dit resultaat maar beschouwen de combinatie algemeen antagonistische. 2. tijd-kill synergie testen Antimicrobiële stamoplossingen maken Als deze stap vooruit van het experiment wordt uitgevoerd, blokkeert u voorraden bij-80 ° C tot klaar voor gebruik. Bepalen concentraties van antibiotica stockoplossing gebaseerd op oplosbaarheid van antibiotica en gewenst eindconcentraties in tijd-kill studies. In dit voorbeeld maken colistine en minocycline voorraden bij een concentratie van 1 mg/mL Gebruik de CLSI-M100 document om te bepalen van de geschikte oplosmiddelen voor elke antibiotica25. Het gebruik van water, zoals aanbevolen, voor zowel colistine en minocycline. Weeg antibiotica poeder met behulp van analytische balans en berekenen van de hoeveelheid oplosmiddel die nodig zijn voor het verkrijgen van doel voorraad concentratie. Indien nodig, een sterkte berekening vóór de bepaling van de hoeveelheid oplosmiddel nodig, zoals beschreven in stap 1.1.2.1 hierboven uitvoeren. Giet antibiotica poeder in 15 mL conische buizen en voeg de juiste hoeveelheid water. Vortex tot het is opgelost. Met behulp van de handmatige Bouillon microdilution methode beschreven in CLSI M0726, QC van antimicrobiële uitvoeren voorraden voor gebruik in tijd doden synergie experimenten. Voer deze stap uit ten minste één dag voorafgaand aan synergie testen zodat QC resultaten kunnen worden herzien voordat u de voorraad. Selecteer een geschikte QC-stam en bepalen het acceptabele bereik van de MIC voor drugs wordt getest op basis van tabel 5 bis-1 in CLSI M10025. Gebruik voor de drugs hier, E. coli ATCC 25922; het bereik van de MIC voor deze spanning wordt er 0,25-1 mg/mL voor minocycline en 0,25-2 mg/mL voor colistine. Het bereiden van Bouillon antibioticum-bevattende microdilution platen. Selecteer de hoogste concentratie van een antibioticum te worden getest, zodat het gehele QC-bereik opgenomen worden kan. Gebruik een bereik van 0.016 tot en met 8 mg/mL voor minocycline en colistine voor ATCC 25922. Verdun de antibiotica bestanden naar een werkende oplossing in CAMHB in twee keer de hoogste concentratie nodig (want het zal verdunde 1:1 met de schorsing van bacteriën). In dit voorbeeld, Verdun beide voorraden van 10 mg/mL tot 16 mg/mL. Met behulp van een pipet meerkanaals, voeg 100 mL van elk van de 2 x antibiotica schorsingen aan een putje in de eerste kolom van een duidelijke, ronde onderkant, onbehandelde 96-wells-plaat en voeg 50 mL van gewone Bouillon (dat wil zeggen, zonder antibioticum) aan elk putje van de volgende kolommen. Verwijderen van antibioticum-bevattende 50 mL Bouillon van elk goed in de eerste kolom en voeg toe aan de putjes in de tweede kolom. Pipetteer op en neer meerdere malen te mengen van de inhoud, het genereren van een antibioticum concentratie de helft van de concentratie in de eerste kolom. Herhaal stap 2.2.2.4 met elke kolom, zodat een aantal seriële tweevoudige verdunningen, elk met een volume van 50 mL, is voorbereid. Verandering Pipetteer tips tussen elke stap verdunning als wilde elimineren de mogelijkheid van overdracht van de antibiotica. Merk op dat de daaruit voortvloeiende concentraties alle nog 2 x de eindconcentraties zijn, zoals zij vervolgens verdund 1:1 met bacteriële suspensie zullen. Voeg een antibioticum geen aan de laatste twee kolommen, zoals deze de negatieven van afbeeldingen en groei controle-kolommen zullen. Maak bacteriële suspensie. Maak een 0.5 McFarland suspensie van een overnachting plaat van E. coli ATCC 25922 in 0,9% natriumchloride zoals beschreven in stappen 1.2.1.5-1.2.1.6. Een verdunning van de 1:150 van de 0.5 McFarland schorsing maken door toevoeging van 50 mL van de schorsing tot 7,5 mL van CAMHB.Opmerking: De definitieve bacteriële suspensie zullen verdunde 1:300 zodra het 1:1 wordt gemengd met de antibiotica oplossing, het bereiken van de CLSI-aanbevolen celdichtheid van 5 x 105 CFU/mL27). Bacteriën aan de microplate toevoegen en uit te broeden. Voeg 50 mL van de bacteriële suspensie aan elk putje, behalve in de 11th -kolom. Voeg 50 mL van CAMHB naar de 11th kolom (kolom van de negatieve controle). Incubeer plaat bij 35 ° C voor 16-20 h.Opmerking: Een andere duur van incubatie kan dienen als organismen, andere dan Enterobacteriaceae worden getest; Raadpleeg CLSI M10025 voor organisme-specifieke aanbevelingen. Plaat voor groei visueel met doorvallend licht lezen en, voor elke antibioticum, bepaal de laagste concentratie waarbij er geen groei is; Dit is de MIC. Raadpleeg het CLSI M07-document voor meer informatie over visuele interpretatie van MIC26. Als de microfoon binnen het verwachte bereik van QC is, is de stockoplossing geschikt voor gebruik. Start eerste cultuur. Maken van een 0,5 McFarland opschorting van testorganisme in steriele 0.9% NaCl als hierboven beschreven. Voeg 100 mL van de 0,5 McFarland schorsing tot 5 mL van CAMHB in een glas 25 x 150 mm ronde bodem cultuur buis met roestvrij staal sluiting en vortex voorzichtig te mengen. Met behulp van een steriele inoculating lus, isolatie streep een daling van de verdunde schorsing op een bord bloed agar te bevestigen entmateriaal zuiverheid en Incubeer bij 35 ° C in de lucht. Sluiting op buis vervangen en broeden in een reageerbuis rek op een shaker bij 35 ° C in de lucht gedurende ten minste 3 uur, tot groei van de logaritmische-fase is bereikt (zie stap 2.6.1). Ga naar stap 2.4 terwijl de cultuur in de incubator is. Bereiden antimicrobiële oplossingen in 25 mm x 150 mm glas cultuur buizen. Neem antimicrobiële voorraad aliquots uit-80 ° C vriezer te ontdooien. Vortex eenmaal ontdooid zodat antibioticum is in oplossing. Terwijl de oorspronkelijke cultuur is aan het broeden, voeg 10 mL van de CAMHB vijf gesteriliseerde met autoclaaf 25 x 150 mm glas cultuur buizen en antimicrobiële stamoplossingen bijvoegen.Opmerking: Voor de studie van een synergie, moet ten minste één drug met een concentratie die heeft geen invloed op de groei curve afzonderlijk28; Dit kan worden bepaald door de beoordeling van de effecten van individuele drug concentraties voorafgaand aan de studie van synergie. Buis 1: Voeg de juiste hoeveelheid van antibiotica #1 te verkrijgen van antibiotica eindconcentratie van doel. In dit geval voeg 10 mL 1 mg/mL colistine materieel te verkrijgen van een definitieve colistine concentratie van 1 mg/mL, aangezien dit een concentratie die is niet effectief tegen de stam in dit voorbeeld gebruikt. Buis 2: Voeg de juiste hoeveelheid van antibiotica #2 voor antibiotica eindconcentratie te beproeven. In dit geval voeg 10 mL 1 mg/mL minocycline materieel te verkrijgen van een eindconcentratie van 1 mg/mL, een concentratie die is niet effectief tegen de stam in dit voorbeeld wordt gebruikt. Buis 3: Voeg een dezelfde hoeveelheid antibiotica #1, en #2 zoals gebruikt in buizen 1 en 2 antibioticum. In dit geval voeg 10 mL 1 mg/mL minocycline voorraad en 10 mL 1 mg/mL colistine voorraad. Buis 4: Voeg geen antibiotica; Dit zal de groei controle buis. Buis 5: Voeg geen antibiotica; Dit zal de buis van de negatieve controle. 96 diepe put polypropyleen platen met 2 mL wells voorbereiden met seriële verdunningen door toevoeging van 900 µL van steriele 0,9% natriumchloride aan rijen B-H van kolommen 1-5 met een meerkanaalspipet. Bereiden van startende entmateriaal en voeg aan buizen. Zodra de oorspronkelijke cultuur tot stand gekomen logaritmische groeifase (~ 3 h voor Klebsiella pneumoniae, het organisme gebruikt in dit voorbeeld), verwijder de buis van de cultuur van de shaker, vortex zachtjes, breng ~ 1 mL van schorsing een 12 x 75 mm buis voor de cultuur van de glas, en Controleer dichtheid met een McFarland-lezer. Als er minder dan 1,0 McFarland, buis terug te keren naar de shaker en meer uit te broeden. Als het groter dan 1,0 McFarland is, voegt u CAMHB toe aan de buis, vortex zachtjes, en opnieuw te proeven, het proces herhalen totdat de schorsing op 1,0 McFarland is. Voeg 100 mL van de 1.0 McFarland schorsing buizen 1-4 en vortex zachtjes. Monster aliquots van elke cultuur en het uitvoeren van seriële tienvoudige verdunningen. Op moment 0 (onmiddellijk na het toevoegen van bacteriën aan de buizen) en 1, 2, 4, 6 en 24 h, verwijder een aliquoot 150 mL uit elke cultuur buis door het kantelen van de buis, zodat slechts het topje van de steriele Pipetteer de buis en niet de niet-steriel pipet schacht tijdens aliquoot terugtrekking treedt. Breng aliquots, respectievelijk, in opeenvolgende putjes in de eerste rij van de eerder bereid 96 diep goed plaat. Terugkomen buizen een reageerbuis rek op een shaker in een incubator van de omgevingslucht 35 ° C onmiddellijk na het verwijderen van aliquots op elk tijdstip. Met behulp van een meerkanaalspipet, 100 mL uit rij A verwijderen, toevoegen aan rij B (die bevat 900 mL van 0,9% natriumchloride) en Pipetteer op en neer 4 – 5 keer naar mix, maken van een 1:10 verdunning. Tips na elke verdunning stap ter voorkoming van de overdracht van bacteriën, die tot vals verhoogde kolonie graven leiden kan negeren. Herhaal stap 2.7.2 voor rijen B-H met de nieuwe Pipet tips voor elke rij. Plaat verdund monsters voor kolonie graven met behulp van de daling van de plaat methode29,30. Label Mueller-Hinton agar platen met de antibiotica voorwaarden en verdunning te worden bekleed. Met behulp van een meerkanaalspipet en extra lange tips (om ervoor te zorgen dat tips in suspensie bereiken), verwijderen van 10 mL van elk putje in kolom 1 en zorgvuldig afzien in een rij op de juiste gelabelde bord. Als kleine (100 mm doorsnede) platen worden gebruikt, afzien 3 rijen (elk bestaande uit druppels van één kolom rijen A-H) per plaat; afzien op grote (150 mm doorsnede) platen, 8 rijen per plaat. Toestaan dat druppels volledig drogen (~ 15 min). Breng een druppel van de 10 mL rechtstreeks overgenomen uit de buis van de negatieve controle in een aangegeven deel van één van de platen om te testen voor steriliteit bij 24 h. Omkeren van platen en na een nacht bebroeden bij 35 ° C in de lucht. Tellen van kolonies en berekenen van de celdichtheid. Mark kolonies met een permanent marker van fine-tip op de achterzijde van de plaat om te voorkomen dat dubbele telling of ontbrekende kolonies. Eerst, Controleer de zuiverheid plaat en ervoor zorgen dat de geïsoleerde kolonies van een enkele morfologie die strookt met de verwachte morfologie van het organisme wordt getest. Voor elke verdunningsreeks, identificeren u druppels met 3-30 koloniën (meestal één druppel per verdunningsreeks). De kolonies in deze dalingen tellen en registreren van de telling samen met de verdunningsfactor. Als er geen druppels in een verdunningsreeks met 3-30 kolonies, tellen de kolonies in de laatste druppel met > 30 koloniën en de eerste druppel met < 3 koloniën (deze moet aangrenzende druppels). Voor elke verdunningsreeks, aantal kolonievormende eenheden per milliliter (CFU/mL) in het monster gebaseerd op het aantal kolonies in het drop-met behulp van de volgende formule berekenen: CFU/mL = n(1 /d) (100) waar n staat voor het aantal kolonies, d is de verdunningsfactor (1 voor onverdund monster (rij A), 0.1 of 10-1 voor de eerste 1:10 verdunning (rij B), 0,01 of 10-2 voor de tweede 1:10 verdunning (rij C), enzovoort, en de constante 100 rekeningen voor het feit dat het totale volume van de druppel ik s 10 mL, terwijl de uiteindelijke waarde wordt uitgedrukt in kve/mL, d.w.z., CFU/1000 mL. Gebruik een werkblad met formules die berekening CFU/mL vanaf Telling kolonies bij om dit proces te vereenvoudigen. Gemiddelde voor verdunningsreeks waar meer dan één druppel was aftelbare (of waar twee druppels moest worden geteld omdat geen druppel viel in bereik), de laatste CFU/mL graven voor alle getelde druppels. Want de ondergrens voor detectie is 300 kve/mL (3 kolonies in het onverdunde drop), record en plot Telling kolonies bij £300 kve/mL voor verdunningsreeks waarin er zijn < 3 kolonies in het onverdunde drop. Inspecteer de steriliteit controle daling van tijd 24; Indien groei is waargenomen in deze daling, moeten de resultaten van het experiment niet worden gebruikt. Grafiek en analyseren van resultaten. Groeicurven van de drie antibioticum-bevattende culturen en de controle van de groei in dezelfde grafiek worden uitgezet. Tijd op de x -as en de CFU/mL, met behulp van een logaritmische schaal, op de y -as worden uitgezet. Het verschil in CFU/mL tussen de combinatie buis op tijdstip 24 en de meest actieve enkele agent op tijdstip 24 te berekenen. Het verschil is ≥2 log10, overweeg de combinatie synergetische. Vervolgens berekent het verschil in CFU/mL tussen de combinatie buis tijde 24 en op moment 0. Als het verschil ≥3 log10, kunt u overwegen de combinatie bactericide.

Representative Results

Figuur 1A presenteert een raster van een experiment van de synergie van dambord-matrix, in welke minocycline in concentraties van 0-32 μg/mL werd gecombineerd met colistine bij concentraties van 0-16 μg/mL en getest tegen E. coli stam FDA-CDC 0494. De waarden vertegenwoordigen spectrofotometrische lezingen op optische dichtheid 600 nm (OD600). Putjes met OD600 waarden onder 0.07 (die correspondeert met geen groei door visuele inspectie) zijn grijs rood, terwijl putjes met OD600 waarden 0,07 (dat overeenstemt met de groei door visuele inspectie) grijs groen. Voor elk medicijn is de minimale remmende concentratie (MIC; vette) de laagste concentratie van het geneesmiddel dat remt de groei van bacteriën. Voor minocycline, dit is 32 μg/mL en voor colistine, is 8 μg/mL. De arcering wordt bewaard in figuur 1B, maar waarden binnen de putjes waarin groei wordt geremd worden vervangen door fractionele remmende concentratie (“fic”ik) indexwaarden. Deze wordt als volgt bepaald: in elk putje, de index van de fractionele remmende concentratie (“fic”) van elk medicijn wordt berekend door de concentratie van een antibioticum dat goed door van de drug MIC, en het “fic”ik wordt berekend door optelling van de twee FICs. Putjes met een “fic”ik waarde van 0,5, die wordt beschouwd als de cutoff voor synergie, worden aangegeven met een gebroken-lijnrand en de put met de laagste “fic”ik waarde (0.094) is vet. Omdat het “fic”ik minimumwaarde in de synergetische bereik is, wordt de combinatie synergetische beschouwd. Figuur 2A en 2B van de figuur weergeven rasters analoog zijn aan die in figuur 1A en figuur 1B, maar in dit geval de combinatie niet aantoont synergie tegen het isolaat getest (K. pneumoniae isolaat BIDMC 4), omdat de minimale “fic”ik waartegen de groei wordt geremd is 1, oftewel > 0,5. Figuur 3 toont de gemeten optische dichtheid van een dambord synergie raster waarin verschillende overgeslagen wells (Enterobacter cloacae complexe isolaat BIDMC 27) is opgetreden. Overgeslagen putten zijn putten waarin bacteriegroei wordt geremd, ondanks de aanwezigheid van de bacteriële groei in aangrenzende putten met hogere concentraties van antibiotica. Dit verschijnsel, waarvan bekend is dat het optreden in standaard MIC testen alsmede, is waarschijnlijk te wijten aan biologische variabiliteit in bacteriële groei kenmerken van goed tot goed en de gevoeligheid van sommige antibiotica tot kleine verschillen in de bacteriële entmateriaal23 , 31 , 32. als meer dan één goed heeft plaatsgevonden in een dambord-array overgeslagen, we verwijderd van de resultaten en de test herhaald. Figuur 4 presenteert voorbeelden van tijd-kill synergie resultaten van drie combinaties getest tegen K. pneumoniae isoleren BIDMC 32. Kolonie graven zijn aangegeven in een logaritmische schaal op de y-as en tijd, in uren, op de x-as. Het verschil tussen de startende entmateriaal in de buis met de combinatie van de drug en de concentratie van bacteriën in die buis bij 24 h wordt geïllustreerd door de rode balk en het aantal, terwijl het verschil tussen de concentratie van de bacteriën op 24 h tussen de buis met de combinatie en de buis met de meest actieve enkele agent alleen wordt geïllustreerd door de blauwe balk en het aantal. Figuur 4A toont resultaten uit de combinatie van colistine en minocycline; Deze combinatie was synergetische (verschil tussen de concentraties van bacteriën blootgesteld aan combinatie en actiefste agent alleen ≥2 log10 CFU/mL in 24 h) en bactericide (daling van het starten van entmateriaal tot een concentratie op 24u ≥3 log10 CFU/mL). Figuur 4B toont de resultaten van de combinatie van colistine en clindamycine, een combinatie die was synergetische maar was niet bactericide. Deze combinatie geremd groei van de bacteriën, die noch drug deed alleen, maar heb ze niet doden. Figuur 4C toont de resultaten van de combinatie van colistine en erythromycine, die niet bactericide of synergetische was. Figuur 1: Dambord matrix resultaten demonstrerende synergie (minocycline + colistine getest tegen E. coli FDA-CDC 0494 stam). (A) spectrofotometrische uitlezing en groei interpretatie van een dambord-array. Waarden in de cellen zijn optische dichtheid lezingen op 600 nm (OD600). Cellen met OD600 waarden onder 0.07 (overeenkomend met geen groei door visuele inspectie) zijn grijs rood, terwijl cellen met OD600 waarden 0.07 (overeenkomend met groei door visuele inspectie) grijs groen. (B) fractionele remmende concentratie index (“fic”ik) berekening. Arcering die aangeeft groei of geen groei is bewaard gebleven. Waarden voor colistine en minocycline langs de x- en y-assen, respectievelijk, nu vertegenwoordigen de fractionele remmende concentratie (“fic”), of de verhouding van de concentratie van de drug in die kolom of rij naar de (minimale remmende concentratie MIC) van dat medicijn alleen. De waarde in elke cel is het “fic”ik, of de som van de FICs van de twee drugs in dat goed. Het grote gebroken lijn-begrensd vak omsluit putjes met een “fic”ik van 0,5. Het grenst aan de dik cel geeft de put met de laagste “fic”ik in die groei wordt geremd, of het minimum “fic”ik. Omdat het minimum “fic”ik 0,5 is, wordt de combinatie synergetische beschouwd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 2: De resultaten van de matrix van het dambord van een combinatie die niet aantoont synergie (minocycline + colistine getest tegen K. pneumoniae isoleren BIDMC 4). (A) optische dichtheid waarden op 600 nm en groei interpretatie van dambord matrix resultaten als beschreven voor het figuur 1A. (B) fractionele remmende concentratie index (“fic”ik) berekening zoals beschreven voor figuur 1A. Omdat het minimum “fic”ik > 0,5, de combinatie wordt niet beschouwd als synergetische. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 3: Dambord matrix resultaten die uninterpretable moeten zijn overgeslagen wells (minocycline + colistine getest tegen Enterobacter cloacae complexe isoleren BIDMC 27). Optische dichtheid waarden op 600 nm en groei interpretatie van dambord matrix resultaten als beschreven voor het figuur 1A. Verschillende overgeslagen wells, waarin bacteriegroei wordt geremd, ondanks de aanwezigheid van groei in aangrenzende putten met hogere concentraties van antibiotica, worden gedemonstreerd. Resultaten zijn niet interpreteerbaar en experimenteren moet worden herhaald. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 4: De resultaten van de synergie van het tijd-doden van drie combinaties getest tegen K. pneumoniae isoleren BIDMC 32. Kolonie graven zijn aangegeven in een logaritmische schaal op de y-as en tijd, in uren, op de x-as. Het verschil tussen de concentratie van bacteriën in de combinatie op 24 h en de startende entmateriaal in de buis wordt geïllustreerd door de rode balk en het aantal. Wanneer de daling van het starten van entmateriaal tot een concentratie bij 24 h ≥3 log10 CFU/mL is, wordt de combinatie bactericide. Het verschil tussen de concentratie van de bacteriën op 24 h tussen de buis met de combinatie en de buis met de meest actieve enkele agent alleen wordt geïllustreerd door de blauwe balk en het aantal; Als er ≥2 log10 CFU/mL vermindering is, als de combinatie synergetische. (A) colistine (CST) + minocycline (MIN), een combinatie die zowel synergetische en bactericide. (B) colistine + Clindamycine (CLI), een combinatie die is synergetische maar niet bactericide. (C) colistine + erytromycine (ERY), een combinatie die is niet synergetische noch bactericide. Deze resultaten werden aanvankelijk gepubliceerd als onderdeel van een studie van de synergetische activiteiten van colistine-bevattende combinaties tegen colistine-resistente Enterobacteriaceae, waarin we laten dat colistine zien was synergetische met een aantal antibiotica die actief individueel alleen zijn (bijvoorbeeld clindamycine) of hoofdzakelijk (bv. erytromycine) tegen gram-positieve bacteriën16. (Merk op dat erytromycine synergetische door dambord array tegen de spanning komt te staan was, maar niet door tijd-doden, dus het is geselecteerd als een voorbeeld van een niet-synergetische combinatie.) Wij die hypothetische colistine, die bekend staat om op te treden door de permeabilization van de gram-negatieve buitenmembraan, oefent een sub-inhibitory permeabilizing effect op colistine-resistente gram-negatieve bacteriën, waardoor de invoer van drugs zoals clindamycine die normaal gesproken binnengaan niet de gram-negatieve cel. Deelvenster (A) van deze afbeelding is gewijzigd van Brennan-Krohn, Pironti en Kirby 201816, copyright © American Society for Microbiology, antimicrobiële stoffen en chemotherapie, 62(10), 2018, pii: e00873-18, doi: 10.1128/AAC.00873-18. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

De twee methoden die hier worden beschreven bieden beide informatie over de activiteit van antimicrobiële stoffen gebruikt in combinatie ten opzichte van hun individuele activiteit. De geautomatiseerde, inkjet printer-bijgewoonde digitale toedieningseenheden methode is een aanpassing van de methode beschreven in de klinische microbiologie Procedures handboek33, terwijl de tijd-kill methode nauwer blijkens het bijbehorende protocol hetzelfde verwijst naar de34.

In de methode dambord matrix berekeningen om te bepalen van de benodigde hoeveelheid antimicrobiële voorraad toe te voegen aan elk putje en de verstrekking van deze volumes is geautomatiseerd, waardoor enkele van de belangrijkste potentiële bronnen van fout opgetreden in een handleiding Dambord matrix. Het is echter nog steeds noodzakelijk dat de onderzoeker bepaalt dat oorspronkelijke bestanden zijn gemaakt bij de voorgenomen concentratie en dat doel eindconcentraties de D300-software correct worden aangegaan. De antimicrobiële schorsing aan putjes in de plaat van een 384-well eerst kan worden uitdagend en vereist zorg toe te voegen om ervoor te zorgen dat Pipetteer tips Voer de juiste putjes en die vloeistof niet plons up gemaakt van de randen van de putten. Een geautomatiseerde vloeibare-handler kan worden gebruikt in plaats van een hand-held meerkanaalspipet te verhogen van de snelheid en nauwkeurigheid waarmee de bacteriële suspensie wordt toegevoegd aan putjes. Zoals beschreven in het protocol, vereist de D300 de toevoeging van de oppervlakteactieve stof, Polysorbaat 20 (P-20), voor de correcte afhandeling van de liquid. Een andere oppervlakteactieve stof, polysorbaat 80, met een concentratie van 0.002%, geconstateerd tot lagere colistine microfoons voor organismen met colistine microfoons van < 2 µg/mL in standaard Bouillon microdilution testen. 35 , 36 ons laboratorium eerder aangetoond dat P-20 bij concentraties tot 0.0015% had geen effect op de D300-bijgewoonde MIC resultaten in vergelijking met referentie BMD14. In het voorbeeld van assay hier gepresenteerd, is de maximale P-20 concentratie 0.0014%.

Een probleem we ondervonden met sommige dambord matrix testen was een groot aantal overgeslagen wells. Dit gebeurde in een onevenredige tempo met bepaalde antibiotica. In het bijzonder in een scherm van combinaties tegen een verzameling carbapenem-resistente Enterobacteriaceaevonden we dat terwijl 49 521 proeven (9,4%) onbruikbaar als gevolg van meerdere overgeslagen wells, werden 2 van de 12 antibiotica getest (fosfomycin en cefepime) goed voor 46 van deze proeven (94%). Dergelijke verhoogde tarieven kunnen waarschijnlijk meer in geneesmiddelen die vooral gevoelig voor de entmateriaal effect31,32,37 zijn. Van de nota adviseert CLSI niet testen van de fosfomycin in Bouillon verdunning25 als gevolg van bezorgdheid over de betrouwbaarheid van de resultaten met deze methode, wat de onbetrouwbare resultaten gezien met deze drug verklaren kan. Sommige wijzigingen kunnen worden aangebracht aan geautomatiseerde dambord methode volgens de voorkeur van de onderzoeker. Antimicrobiële stoffen kunnen achterwege worden gelaten in platen al met bacteriële suspensie, in plaats van in lege wells, als dat beter dan omwille van de werkstroom binnen het laboratorium is. Terwijl 384-Wells-platen hier gebruikt werden, kan de methode ook worden uitgevoerd in 96-wells-plaat testen met passende wijziging van goed volume. Het gebruik van een 96-wells-plaat-formaat kan helpen bij de vermindering overgeslagen putten voor antibiotica die bijzonder gevoelig voor kleine veranderingen in de entmateriaal zijn. Bij de berekening van “fic”ik, kunnen er situaties waarin de microfoon uit-schaal (d.w.z., hoger dan getest), met inbegrip van situaties waarin de geteste drug heeft geen activiteit individueel tegen het soort organisme wordt getest. In deze gevallen, kan het “fic” worden berekend op basis van uitgaande van dat de microfoon is een verdunning hoger dan de hoogste geteste concentratie. Dit is de meest conservatieve strategie, zoals wordt ervan uitgegaan de maximale mogelijke “fic” waarde voor elke verdunning waar remming wordt waargenomen dat tijdens het testen van synergie. Bijvoorbeeld, als de werkelijke MIC in plaats daarvan twee verdubbeling verdunningen bovenstaande werden de hoogste concentratie getest, dan de overeenkomstige FICs zou twee-voudige lager dan de conservatieve toewijzingen, enzovoort.

Om nauwkeurig beoordelen de bactericide activiteit van drugs in een test van de tijd-doden, is het essentieel dat culturen in logaritmische-fase groei, met name wanneer de celwand actieve antibiotica worden geteste28. Voor de snel groeiende bacteriën gebruikt in dit voorbeeld (K. pneumoniae), 3 uur incubatie met schudden was nodig om te bereiken deze groeifase, maar verschillende hoeveelheden tijd nodig kunnen zijn voor andere organismen. In het algemeen de cultuur moet worden zichtbaar maar niet zwaar troebel weergegeven. De juiste hoeveelheid tijd kan worden bepaald door de aanleg van een groeicurve met kolonie graven op38punten (bijvoorbeeld elke 30 min voor 4-6 h) seriële tijd genomen. Het beoogde begin entmateriaal in de tijd-kill studie is ook belangrijk. De concentratie van de doelgroep van de startende entmateriaal is ongeveer 5 x 105 tot en met 1 x 106 CFU/mL. De hier beschreven verdunning (100 μl van een 1.0 McFarland suspensie in 10 mL van media) genereert deze entmateriaal op Klebsiella pneumoniae en andere soorten van de Enterobacteriaceae die we hebben getest. Als de dichtheid van de startende entmateriaal in een experiment met verschillende organismen aanzienlijk hoger of lager zijn dan dit is, kan dan een andere verdunning nodig zijn. (De aangewezen verdunning die nodig zijn voor een bepaalde soort kan worden bepaald door een kiemgetal van 0,5 of 1.0 McFarland schorsing uit te voeren om te bepalen hoeveel organismen dit troebelheid vertegenwoordigt, dan het berekenen van het bedrag waarmee de eerste schorsing moet worden verdund om te bereiken van de juiste eindconcentratie.) Indien over herziening van de graven van de plaat uit de studie van de synergie, de startende entmateriaal van om het even welk van de antibiotica-bevattende buisjes wordt gevonden te zijn aanzienlijk lager dan de startende entmateriaal van het groei-besturingselement, kan dit erop wijzen beide antibiotica overdracht of zeer snelle doden van bacteriën in de korte tijd tussen de toevoeging van bacteriën aan de antibiotica-bevattende buis en verwijdering van het afgepipetteerde deel voor beplating. Als het werkelijke aantal kolonies in het onverdunde drop in een serie lager dan het aantal kolonies in latere verdunningen is, suggereert dit antibioticum overdracht effect. Verschillende opties zijn beschreven voor het voorkomen van dit effect, met inbegrip van een één aliquot verspreiding via een hele plaat38 of spinnen naar beneden van het monster, de bovendrijvende vloeistof verwijderen en opnieuw schorsen in steriele zoutoplossing voorafgaand aan39plating. Op elk tijdstip in de tijd-kill-methode is het ook cruciaal voor de onderzoeker efficiënt maar nauwkeurig verwijderen van een aliquoot deel van elke cultuur buis en seriële verdunningen uit te voeren. Vertragingen tijdens dit proces, met name tijdens de vroege tijdstippen die in nauwe opvolging optreden, kunnen leiden tot langere periodes gedurende welke culturen niet zijn geïncubeerd en geschud, overwegende dat onzorgvuldige verstrekking en seriële verdunningen tot onnauwkeurige plaat leiden kunnen graven. In vergelijking met de verspreiding plaat methode van de plaat tellen, waarin 100 μl van elke verdunning wordt gespreid over een hele agarplaat, de beschreven methode van de drop-plaat is veel meer snelle, vereist een veel kleiner aantal agar platen, en voorziet in snellere tellen, als de maximale hoeveelheid aftelbare aantal kolonies voor elke daling is 30, terwijl tot 300 kolonies kan meestal worden geteld van een plaat van de verspreiding. De methode van de plaat verspreiding is echter ook een optie als onderzoekers meer vertrouwd bent met deze techniek. Als druppels verspreid in elkaar na verstrekking met een meerkanaalspipet, kan individuele toepassing van grotere schaal verdeelde druppels met een pipet één-kanaals in plaats daarvan worden uitgevoerd. In onze ervaring leek koeling platen bij 4 ° C vóór de verstrekking van druppels om buitensporige verspreiden.

Een beperking van de hier beschreven technieken is dat de resultaten van de twee soorten synergie assay (dambord matrix en tijd-kill) niet altijd concordant zijn, en aangezien meest gepubliceerde synergie artikelen één methode of de andere plaats beide samen gebruiken, het kan moeilijk zijn om te weten hoe om gegevens uit de twee typen van tests te integreren. Omdat de geautomatiseerde dambord matrix methode die we ontwikkeld eenvoudig is en high-throughput, we hebben het gebruikt in feite als een soort scherm testcombinaties tegen een groter aantal isolaten en te bepalen welke concentratie combinaties waren synergetische. We uitgevoerd dan een kleiner aantal tijd-kill studies, combinaties en concentraties die had gewerkt in de matrix dambord te selecteren. Van de nota, omdat de dambord bepaling worden doorgaans uitgevoerd op een schaal van microbroth verdunning, terwijl de tijd-kill-bepaling maakt gebruik van grotere volumes (vergelijkbaar met een verdunning van macrobroth), vonden we dat FICs soms verschillend tussen de twee methoden waren, met hogere concentraties in het algemeen nodig in de bepaling van de tijd-doden om aan te tonen van de activiteit. Dit verschijnsel is geconstateerd eerder als macrobroth en microbroth verdunning MIC assay resultaten worden vergeleken voor gramnegatieve bacillen26 en wanneer grotere entmateriaal (zoals gebruikt in de tijd-kill studies) worden vergeleken met de standaard entmateriaal gebruikt in microbroth verdunnings- en dambord matrix testen32. Een specifieke beperking van het dambord-matrix is de inherente variabiliteit in microbroth verdunning MIC testen van22. Terwijl “fic”ik cutoffs voor synergie-account voor deze variabiliteit wiskundig6 dergelijke variabiliteit onvermijdelijk leidt tot bezorgdheid over de betrouwbaarheid en consistentie van dambord matrix resultaten.

Vanwege de beperkingen die inherent zijn aan alle in vitro synergie testmethoden (met inbegrip van de teelt van bacteriën in een kunstmatige groeimedium, statische antibiotica concentraties en een beperkte tijdsverloop), volgens deze methoden verkregen resultaten moeten worden bevestigd en verder geëvalueerd met behulp van aanvullende technieken. Dergelijke methoden omvatten in vitro farmacokinetische/farmacodynamische (PK/PD) studies (bijvoorbeeld de holle vezel infectie model40), dierlijke modellen, en, uiteindelijk, menselijke PK/PD en werkzaamheid studies. De geautomatiseerde dambord matrix methode hier beschreven, door het verstrekken van een snelle methode waarmee aan scherm combinaties voor potentiële synergetische activiteit, zorgt voor meer gerichte gebruik van deze technieken. Verdere automatisering van al deze methoden, als goed als meer systematische onderzoek naar de relatie tussen in vitro parameters en de klinische resultaten, dient bij schaal-up van het gebruik van de synergie testen en de klinische toepasbaarheid ervan verhogen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Thea Brennan-Krohn werd gesteund door een Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health en menselijke ontwikkeling pediatrische-infectieziekten onderzoek opleiding grant (T32HD055148), een National Institute of Allergy en infectieziekten opleiding subsidie) T32AI007061), een Boston Children’s Hospital Office van faculteit ontwikkeling faculteit Career Development fellowship, en een National Institute of Allergy and Infectious Diseases carrière ontwikkeling award (1K08AI132716). J.E.K. werd gesteund door de National Institute of Allergy and Infectious Diseases van de National Institutes of Health onder award nummer R33 AI119114. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de National Institutes of Health.

Materials

Escherichia coli strain ATCC 25922 ATCC 25922 QC strain
0.5 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1605-0000
1 L 0.22 µm bottle-top filter Thermo Scientific Nalgene 597-4520
12 mm x 75 mm borosilicate glass round bottom culture tubes Fisherbrand 14-961-26
15 mL conical tubes Phenix SS-PH15
15 x 100 mm or 15 x 150 mm Mueller Hinton agar plates Thermo Scientific R01620 or R04050
25 mm stainless steel closures for 25 x 150 mm glass culture tubes Bellco 2005-02512
25 x 150 mm borosilicate glass round bottom culture tubes Bellco 2011-25150
348-well sterile clear, flat-bottom, untreated microplates with lids Greiner Bio-One 781186
50 mL conical tubes Phenix SS-PH50
50 mL sterile reagent reservoirs Corning 4870
96 deep well polypropylene microplate with 2 mL wells Fisherbrand 12-566-612
96-well sterile clear, round-bottom, untreated microplates with lids Evergreen 222-8032-01R
Cation adjusted Mueller Hinton broth BD Diagnostics 212322
Colistin sulfate Alfa Aesar J60915
D300e Control Software HP/Tecan
DensiCHEK Plus McFarland reader bioMérieux 21250
Excel spreadsheet software Microsoft
Extra long SHARP 10 µL Precision Barrier Tips Denville Scientific P1096-FR
HP D300 digital dispenser HP/Tecan
HP D300 T8+ cassettes HP/Tecan 30097370
Minocycline hydrochloride Chem-Impex 14302
Picus 12-channel 10-300 µL pipette Sartorius 735461
Polysorbate 20 Fisher Bioreagents BP-337 Brand name: Tween 20
Sodium chloride Fisher Chemical S271
Spectrophotometer Tecan Infinite M1000 PRO
Xplorer 12-channel 50-1200 µL pipette Eppendorf 2231000328
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Temkin, E., Adler, A., Lerner, A., Carmeli, Y. Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae: Biology, epidemiology, and management. Annals of the New York Academy of Sciences. 1323 (1), 22-42 (2014).
  2. Spellberg, B. The future of antibiotics. Critical Care. 18 (3), (2014).
  3. Spellberg, B., et al. The epidemic of antibiotic-resistant infections: a call to action for the medical community from the Infectious Diseases Society of America. Clinical infectious diseases an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 46 (2), 155-164 (2008).
  4. Elemam, A., Rahimian, J., Doymaz, M. In vitro evaluation of antibiotic synergy for polymyxin B-resistant carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae. Journal of Clinical Microbiology. 48 (10), 3558-3562 (2010).
  5. Poirel, L., Kieffer, N., Nordmann, P. In vitro evaluation of dual carbapenem combinations against carbapenemase-producing Enterobacteriaceae. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 71 (1), 156-161 (2016).
  6. Odds, F. C. Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52, (2003).
  7. Zusman, O., et al. Systematic review and meta-analysis of in vitro synergy of polymyxins and carbapenems. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (10), 5104-5111 (2013).
  8. Clock, S. A., et al. In vitro activity of doripenem alone and in multi-agent combinations against extensively drug-resistant Acinetobacter baumannii and Klebsiella pneumoniae. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 76 (3), 343-346 (2013).
  9. Hirsch, E. B., et al. Assessment of antimicrobial combinations for Klebsiella pneumoniae carbapenemase-producing K. pneumoniae. Journal of Infectious Diseases. 207 (5), 786-793 (2013).
  10. Tängdén, T., et al. Evaluation of double- and triple-antibiotic combinations for VIM- and NDM-producing klebsiella pneumoniae by in vitro time-kill experiments. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (3), 1757-1762 (2014).
  11. Tascini, C., et al. Synergistic activity of colistin plus rifampin against colistin-resistant kpc-producing klebsiella pneumoniae. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (8), 3990-3993 (2013).
  12. Paul, M., et al. Combination therapy for carbapenem-resistant Gram-negative bacteria. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 69 (9), 2305-2309 (2014).
  13. Rafailidis, P. I., Falagas, M. E. Options for treating carbapenem-resistant Enterobacteriaceae. Current Opinion in Infectious Diseases. 27 (6), 479-483 (2014).
  14. Smith, K. P., Kirby, J. E. Verification of an automated, digital dispensing platform for at-will broth microdilution-based antimicrobial susceptibility testing. Journal of Clinical Microbiology. 54 (9), 2288-2293 (2016).
  15. Brennan-Krohn, T., Truelson, K., Smith, K. P., Kirby, J. E. Screening for Synergistic Activity of Antimicrobial Combinations Against Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Using Inkjet Printer-Based Technology. J Antimicrob Chemother. 72 (10), 2775-2781 (2017).
  16. Brennan-Krohn, T., Pironti, A., Kirby, J. E. Synergistic Activity of Colistin-Containing Combinations against Colistin-Resistant Enterobacteriaceae. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , (2018).
  17. Falagas, M. E., Kasiakou, S. K., Saravolatz, L. D. Colistin: The Revival of Polymyxins for the Management of Multidrug-Resistant Gram-Negative Bacterial Infections. Clinical Infectious Diseases. 40 (9), 1333-1341 (2005).
  18. Nation, R. L., Li, J. Colistin in the 21st century. Current Opinion in Infectious Diseases. 22 (6), 535-543 (2009).
  19. Ah, Y. -. M., Kim, A. -. J., Lee, J. -. Y. Colistin resistance in Klebsiella pneumoniae. International Journal of Antimicrobial Agents. 44 (1), 8-15 (2014).
  20. Bratu, S., et al. Carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae in Brooklyn, NY: Molecular epidemiology and in vitro activity of polymyxin B and other agents. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 56 (1), 128-132 (2005).
  21. Barth, N., Ribeiro, V. B., Zavasckid, A. P. In vitro activity of polymyxin B plus imipenem, meropenem, or tigecycline against KPC-2-producing Enterobacteriaceae with high MICs for these antimicrobials. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (6), 3596-3597 (2015).
  22. MacLowry, J., Jaqua, M., Selepak, S. Detailed methodology and implementation of a semiautomated serial dilution microtechnique for antimicrobial susceptibility testing. Appl Microbiol. 20 (1), 46-53 (1970).
  23. Brennan-Krohn, T., Smith, K. P., Kirby, J. E. The poisoned well: Enhancing the predictive value of antimicrobial susceptibility testing in the era of multidrug resistance. Journal of Clinical Microbiology. 55 (8), 2304-2308 (2017).
  24. Doern, C. D. When does 2 plus 2 equal 5? A review of antimicrobial synergy testing. Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4124-4128 (2014).
  25. CLSI. . Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. 28th ed. CLSI supplement M100. , (2018).
  26. CLSI. . Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard – Tenth Edition. CLSI document M07-A10. , (2015).
  27. Clinical and Laboratory Standards Institute. . M07: Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically, 11th Edition. , (2018).
  28. Clinical and Laboratory Standards Institute. . Methods for determining bactericidal activity of antimicrobial agents; approved guideline M26-A. 19 (18), 7 (1999).
  29. Naghili, H., Tajik, H., Mardani, K., Razavi Rouhani, S. M., Ehsani, A., Zare, P. Validation of drop plate technique for bacterial enumeration by parametric and nonparametric tests. Veterinary research forum. 4 (3), 179-183 (2013).
  30. Chen, C. Y., Nace, G. W., Irwin, P. L. A 6×6 drop plate method for simultaneous colony counting and MPN enumeration of Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, and Escherichia coli. Journal of Microbiological Methods. 55 (2), 475-479 (2003).
  31. Queenan, A. M., Foleno, B., Gownley, C., Wira, E., Bush, K. Effects of Inoculum and Activity in AmpC- and Extended-Spectrum (ESBL)-Producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae Clinical Isolates Tested by Using NCCLS ESBL Methodology. Journal of Clinical Microbiology. 42 (1), 269-275 (2004).
  32. Smith, K. P., Kirby, J. E. The Inoculum Effect in the Era of Multidrug Resistance: Minor Differences in Inoculum Have Dramatic Effect on Minimal Inhibitory Concentration Determination. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , (2018).
  33. Leber, A. L. Synergism Testing: Broth Microdilution Checkerboard and Broth Macrodilution Methods. Clinical Microbiology Procedures Handbook, Fourth Edition. , (2016).
  34. Leber, A. L. Time-Kill Assay for Determining Synergy. Clinical Microbiology Procedures Handbook, Fourth Edition. , (2016).
  35. Hindler, J. A., Humphries, R. M. Colistin MIC variability by method for contemporary clinical isolates of multidrug-resistant gram-negative bacilli. Journal of Clinical Microbiology. 51 (6), 1678-1684 (2013).
  36. Sutherland, C. A., Nicolau, D. P. To add or not to add Polysorbate 80: Impact on colistin MICs for clinical strains of Enterobacteriaceae and Pseudomonas aeruginosa and quality controls. Journal of Clinical Microbiology. 52 (10), 3810 (2014).
  37. Fuchs, P. C., Barry, a. L., Brown, S. D. Susceptibility testing quality control studies with fosfomycin tromethamine. European journal of clinical microbiology & infectious diseases official publication of the European Society of Clinical Microbiology. 16 (7), 538-540 (1997).
  38. Leber, A. L. Minimum Bactericidal Concentration Testing. Clinical Microbiology Procedures Handbook, Fourth Edition. 5.14.1.11. , (2016).
  39. Cai, Y., et al. In vitro activity of polymyxin B in combination with various antibiotics against extensively drug-resistant Enterobacter cloacae with decreased susceptibility to polymyxin B. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (9), 5238-5246 (2016).
  40. Bulman, Z. P., et al. Polymyxin combinations combat Escherichia coli harboring mcr-1 and blaNDM-5: Preparation for a postantibiotic Era. mBio. 8 (4), (2017).

Tags

Antimicrobial Synergy TestingInkjet Printer-assisted Automated Checkerboard ArrayManual Time-kill MethodAntibiotic ResistanceCombination Drug TestingColistinMinocyclineBacterial ConcentrationMcFarland TurbidityCation-adjusted Mueller-Hinton BrothColony-forming Units

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Brennan-Krohn, T., Kirby, J. E. Antimicrobial Synergy Testing by the Inkjet Printer-assisted Automated Checkerboard Array and the Manual Time-kill Method. J. Vis. Exp. (146), e58636, doi:10.3791/58636 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image