Serebral protein sentezi In vivo bölgesel oranlarının belirlenmesi için nicel Autoradiographic yöntemi
Summary
Protein sentezini hücreler için kritik bir biyolojik süreçtir. Beyinde, adaptif değişiklikler için gereklidir. Sağlam beyinde protein sentezinin oranlarının ölçülmesi dikkatli metodolojik hususlar gerektirir. Burada L-[1-14C]-leucine nicel autoradiographic yöntemi, serebral protein sentezinin bölgesel oranlarının in vivo olarak belirlenmesi için sunuyoruz.
Abstract
Protein sentezi, nöronal fonksiyonun geliştirilmesi ve bakımı için gereklidir ve sinir sistemindeki adaptif değişikliklerle ilgilidir. Ayrıca, sinir sisteminde protein sentezi disregülasyon bazı gelişimsel bozukluklarda bir çekirdek fenotipi olabilir düşünülmektedir. Hayvan modellerinde serebral protein sentezi oranlarının doğru ölçümü Bu bozuklukları anlamak için önemlidir. Geliştirdiğimiz Yöntem, uyanık, hayvanlar gibi davranan çalışmaya uygulanacak şekilde tasarlandı. Bu bir niceliksel autoradiographic yöntemi, bu yüzden aynı anda beynin tüm bölgelerinde oranları elde edebilirsiniz. Yöntem bir izleyici amino asit kullanımı dayanmaktadır, L-[1-14C]-leucine, ve beyin L-leucine davranışının kinetik modeli. Biz seçti L-[1-14C]-leucine Tracer olarak çünkü yabancı etiketli metabolik ürünlere yol açmaz. Ya protein içine dahil veya hızlı bir şekilde etiketlenmemiş CO2 beyinde büyük bir havuzda seyreltilir 14Co2 verim metabolize edilir. Yöntem ve model aynı zamanda doku proteolden doku öncül havuzu protein sentezi için türetilen etiketli olmayan lösin katkısı için izin verir. Yöntem, hücre ve nörofobik katmanlarda protein sentezi oranlarının yanı sıra hipotalamik ve kranial sinir çekirdekleri belirlemek için uzamsal çözünürlüğe sahiptir. Güvenilir ve tekrarlanabilir nicel veriler elde etmek için, yordamsal ayrıntılara uymak önemlidir. Burada, nicel autoradiographic L-[1-14C]-leucine yöntemi ile bölgesel protein sentezi oranlarının belirlenmesi için ayrıntılı prosedürler sunuyoruz.
Introduction
Protein sentezi, sinir sistemindeki uzun süreli adaptif değişim için gerekli olan önemli bir biyolojik süreçtir1. Hem omurgasızlar hem de omurgalı protein sentezi blokları uzun süreli bellek depolama inhibe2. Protein sentezi, uzun vadeli potansiyelleşme (LTP) ve uzun vadeli depresyon (LTD)3, geliştirme sırasında nöronal hayatta kalma bazı formların geç aşamalarının bakımı için gereklidir4, ve nöron genel bakım ve onun sinaptik bağlantılar5. Beyin proteini sentezinin oranlarının ölçülmesi, uyarlanabilir değişikliklerin yanı sıra öğrenme ve hafızaya ilişkin nörogelişimsel bozukluklar ve bozuklukların incelenmesi için önemli bir araç olabilir.
Biz bir yöntem geliştirdik serebral protein sentezi oranlarını ölçmek için bir uyanık hayvan bu ex vivo veya in vitro preparatlar içinde oran tahmin diğer teknikler üzerinde doğal avantajları sunan beyin dokusu6. En önemlisi uyanık bir hayvan içinde bozulmamış beyin ölçümleri için uygulanabilirlik. Bu önemli bir dikkate çünkü sinaptik yapısı ve yerinde fonksiyon ve post mortem etkileri hakkında endişeleri olmadan ölçümleri sağlar. Dahası, kullandığımız nicel autoradiographic yaklaşımı yüksek derecede uzamsal lokalizasyonu elde eder. Oysa 14C enerji biz alt hücresel veya hücresel düzeyde izleyici yerelleştirmek olamaz gibi, biz hücre katmanları ve hipotalamik çekirdekler gibi küçük beyin bölgelerinde oranları ölçmek, yaklaşık 25 μm çözünürlük7.
Radiotracers ile in vivo ölçümlerin bir meydan okuma radiolabel ölçülmesi değil tepki ürünüdür emin olmak için faiz yerine tepki etiketlenmemiş etiketli öncüsü veya diğer yabancı etiketli metabolik ürünler6. Biz seçti L-[1-14C]-leucine Tracer amino asit olarak ya protein içine dahil ya da hızla 14Co2, hangi etiketlenmemiş Co2 büyük havuzda seyreltilmiş olduğu için yüksek oranda kaynaklanan beyin enerji metabolizması8. Dahası, herhangi bir 14c protein içine Incorporated öncelikle ücretsiz olarak var [14c]-leucine, hangi 60 min deneysel dönemde, neredeyse tamamen doku temizlenmiş6. Proteinler daha sonra formalin ile dokuya sabitlenir ve daha sonra su ile durulanır, herhangi bir ücretsiz [14C]-leucine autoradiography önce kaldırılır.
Başka bir önemli dikkate doku proteolizi türetilen etiketlenmemiş amino asitler tarafından preürosi amino asit havuzunun spesifik aktivite seyreltme konudur. Biz yetişkin sıçan ve fare göstermiştir, yaklaşık 40% beyin protein sentezi için preürosi lösin havuzun% protein arıza türetilen amino asitler gelir6. Bu, serebral protein sentezi (rCPS) bölgesel oranlar hesaplaması dahil edilmelidir ve bu ilişkinin değişeceği çalışmalarda onaylanmalıdır. Yöntemin teorik temeli ve varsayımları başka bir yerde6‘ da ayrıntılı olarak sunulmuştur. Bu yazıda, Bu metodoloji uygulamasının yordamsal konularına odaklanıyoruz.
Bu yöntem yer sincaplarda RCPS belirlenmesi için istihdam edilmiştir9, koyun10, Rhesus Monkeys11, fareler12,13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 tane , 21, Tüberöz skleroz kompleksi22bir fare modeli, kırılgan x sendromu bir fare modeli23,24,25,26, kırılgan x premutasyon fareler27, ve bir fenilketoniinin fare modeli28. Bu yazıda, rCPS ölçüm prosedürlerini In vivo autoradiographic L-[1-14C]-leucine yöntemiyle sunuyoruz. Biz uyanık bir kontrol fare beyin bölgelerinde rCPS mevcut. Ayrıca, bir tercüme inhibitörü olan anisomisin in vivo yönetiminde beynin protein sentezini ortadan kaldırmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deneysel hayvanlarda serebral protein sentezinin (rCPS) bölgesel oranlarının belirlenmesi için nicel bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, varolan yöntemleri üzerinde önemli avantajları vardır: 1. ölçümler uyanık davranan hayvan yapılır, bu nedenle işleyen beyin devam eden süreçleri yansıtacak. 2. ölçümler, beynin tüm bölgelerinde ve alt bölgeyi aynı anda RCPS belirleme yeteneğini sağlayan nicel otoradyografi tekniklerinde yoluyla yapılır. 3. yöntemin kinetik modeli, doku proteini bozulması v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, amino asitler ve filmlerin işlenmesi için fare, Tom burlin Genotipleme için zengyan Xia kabul etmek istiyorum, ve Mei Qin bazı RCPS deneyleri gerçekleştirmek için. Bu araştırma NIMH, ZıA MH00889 Intramural araştırma programı tarafından destekleniyordu. RMS ayrıca bir otizm konuşan doktora sonrası bursu 8679 ve FRAXA doktora sonrası bursu ile desteklenmektedir.
Materials
| Mice | The Jackson Laboratory | 003024 | Fmr1 knockout breeding pairs |
| Anisomycin | Tocris Bioscience | 1290 | |
| Microhematocrit Tubes | Drummond Scientific | 1-000-3200-H | capillary tubes |
| Critoseal Capillary Tube Sealant | Leica Microsystems | 39215003 | sealant putty |
| Glass vial inserts | Agilent | 5183-2089 | used to collect blood samples |
| Digi-Med Blood Pressure Analyzer | Micro-Med Inc. | BPA-400 | blood pressure analyzer |
| Bayer Breeze 2 Blood Glucose Monitoring System | Bayer Breeze | 9570A | glucose meter |
| Gastight syringe | Hamilton Co. | 1710 | tuberculin glass syringe |
| HeatMax HotHands-2 Hand Warmers | HeatMax | Model HH2 | warming pads |
| Heparin Lock Flush Solution | Fresenius Kabi USA, LLC | 504505 | heparin saline |
| Clear animal container | Instech | MTANK/W | animal enclosure |
| Spring tether | Instech | PS62 | catheter tube/rodent attachment |
| Swivel | Instech | 375/25 | hooks to spring tether |
| Swivel arm and mount | Instech | SMCLA | hooks to swivel and animal enclosure |
| Tether button | Instech | VAB62BS/22 | attaches to bottom of spring tether |
| Stainless steel tube | Made in-house | N/A | used to snake catheters through mouse |
| Matrx VIP 3000 | Matrx | 91305430 | isoflurane vaporizer |
| Isoflurane | Stoelting Co. | 50207 | isoflurane/halothane adsorber |
| Clippers | Oster Finisher | Model 59 | |
| Surgical skin hooks | Made in-house (??) | N/A (??) | |
| 0.9% Sodium Chloride Saline | APP Pharmaceuticals LLC | 918610 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Microscissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| UNIFY silk surgical sutures | AD Surgical | #S-S618R13 | 6-0 USP, non-absorbable |
| PE-8 polyethylene tubing | SAI Infusion Technologies | PE-8-25 | |
| Syringe | Becton Dickinson and Co. | 309659 | 1cc/mL |
| PE-10 polyethylene tubing | Clay Adams | 427400 | |
| MCID Analysis | Imaging Research Inc. | Version 7.0 | optical density analysis |
| Gelatin-coated slides (75x25mm) | FD Neurotechnologies | PO101 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Super RX-N medical x-ray film | Fuji | 47410-19291 | |
| Hypercassettes (8×10 in) | Amersham Pharmacia Biotech | 11649 | |
| [1-14C]leucine | Moravek | MC404E | |
| Microcentrifuge tube | Sarstedt Aktiengesellschaft & Co. | 72.692.005 | used to deproteinize blood samples |
| Glass pasteur pipette | Wheaton | 357335 | |
| Glass wool | Sigma-Aldrich | 18421 | |
| Nitrogen | NIH Supply Center | 6830009737285 | |
| Scintillation fluid | CytoScint | 882453 | |
| Liquid scintilllation counter | Packard Tri-Carb | 2250CA | |
| Amino acid analyzer | Pickering Laboratories | Pinnacle PCX | |
| HPLC unit | Agilent Technologies | 1260 Infinity | include 1260 Bio-Inert Pump |
| Surgical microscope | Wild Heerbrugg | M650 | |
| Sulfosalicylic acid | Sigma-Aldrich | MKBS1634V | 5-sulfosalicylic acid dihydrate |
| Norleucine | Sigma | N8513 | |
| 1.0 N HCl | Sigma-Aldrich | H9892 | |
| [H3]leucine | Moraevk | MC672 | |
| Falcon tube | Thermo Scientific | 339652 | 50 mL conical centrifuge tubes |
| Stopwatch | Heuer Microsplit | Model 1000 | 1/100 min |
| Euthanasia Solution | Vet One | H6438 | |
| Northern Light Precision Illuminator | Imaging Research Inc. | Model B95 | fluorescent light box |
| Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 | Nikon | 1442 | CDD camera |
References
- West, A. E., et al. Calcium regulation of neuronal gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 11024-11031 (2001).
- Siegel, G., Agranoff, B., Albers, R. W., Fisher, S., Uhler, M. . Basic Neurochemistry. , (1999).
- Nguyen, P. V., Abel, T., Kandel, E. R. Requirement of a critical period of transcription for induction of a late phase of LTP. Science. 265, 1104-1107 (1994).
- Mao, Z., Bonni, A., Xia, F., Nadal-Vicens, M., Greenberg, M. E. Neuronal activity-dependent cell survival mediated by transcription factor MEF2. Science. 286, 785-790 (1999).
- Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. Current advances in local protein synthesis and synaptic plasticity. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 7147-7150 (2006).
- Smith, C. B., Deibler, G. E., Eng, N., Schmidt, K., Sokoloff, L. Measurement of local cerebral protein synthesis in vivo: influence of recycling of amino acids derived from protein degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85, 9341-9345 (1988).
- Schmidt, K. C., Smith, C. B. Resolution, sensitivity and precision with autoradiography and small animal positron emission tomography: implications for functional brain imaging in animal research. Nuclear Medicine and Biology. 32, 719-725 (2005).
- Banker, G., Cotman, C. W. Characteristics of different amino acids as protein precursors in mouse brain: advantages of certain carboxyl-labeled amino acids. Archives of Biochemistry and Biophysics. 142, 565-573 (1971).
- Frerichs, K. U., et al. Suppression of protein synthesis in brain during hibernation involves inhibition of protein initiation and elongation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 14511-14516 (1998).
- Abrams, R. M., Burchfield, D. J., Sun, Y., Smith, C. B. Rates of local cerebral protein synthesis in fetal and neonatal sheep. The American Journal of Physiology. 272, R1235-R1244 (1997).
- Nakanishi, H., et al. Positive correlations between cerebral protein synthesis rates and deep sleep in Macaca mulatta. The European Journal of Neuroscience. 9, 271-279 (1997).
- Sun, Y., Deibler, G. E., Sokoloff, L., Smith, C. B. Determination of regional rates of cerebral protein synthesis adjusted for regional differences in recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool in conscious adult rats. Journal of Neurochemistry. 59, 863-873 (1992).
- Scammell, T. E., Schwartz, W. J., Smith, C. B. No evidence for a circadian rhythm of protein synthesis in the rat suprachiasmatic nuclei. Brain Research. 494, 155-158 (1989).
- Smith, C. B., Eintrei, C., Kang, J., Sun, Y. Effects of thiopental anesthesia on local rates of cerebral protein synthesis in rats. The American Journal of Physiology. 274, E852-E859 (1998).
- Sun, Y., Deibler, G. E., Smith, C. B. Effects of axotomy on protein synthesis in the rat hypoglossal nucleus: examination of the influence of local recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 13, 1006-1012 (1993).
- Smith, C. B., Yu, W. H. Rates of protein synthesis in the regenerating hypoglossal nucleus: effects of testosterone treatment. Neurochemical Research. 19, 623-629 (1994).
- Orzi, F., Sun, Y., Pettigrew, K., Sokoloff, L., Smith, C. B. Effects of acute and delayed effects of prior chronic cocaine administration on regional rates of cerebral protein synthesis in rats. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 272, 892-900 (1995).
- Nadel, J., et al. Voluntary exercise regionally augments rates of cerebral protein synthesis. Brain Research. 1537, 125-131 (2013).
- Sun, Y., et al. Rates of local cerebral protein synthesis in the rat during normal postnatal development. The American Journal of Physiology. 268, R549-R561 (1995).
- Smith, C. B., Sun, Y., Sokoloff, L. Effects of aging on regional rates of cerebral protein synthesis in the Sprague-Dawley rat: examination of the influence of recycling of amino acids derived from protein degradation into the precursor pool. Neurochemistry International. 27, 407-416 (1995).
- Ingvar, M. C., Maeder, P., Sokoloff, L., Smith, C. B. The effects of aging on local rates of cerebral protein synthesis in rats. Monographs in Neural Sciences. 11, 47-50 (1984).
- Sare, R. M., Huang, T., Burlin, T., Loutaev, I., Smith, C. B. Decreased rates of cerebral protein synthesis measured in vivo in a mouse model of Tuberous Sclerosis Complex: unexpected consequences of reduced tuberin. Journal of Neurochemistry. 145, 417-425 (2018).
- Liu, Z. H., Huang, T., Smith, C. B. Lithium reverses increased rates of cerebral protein synthesis in a mouse model of fragile X syndrome. Neurobiology of Disease. 45, 1145-1152 (2012).
- Qin, M., et al. Altered cerebral protein synthesis in fragile X syndrome: studies in human subjects and knockout mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33, 499-507 (2013).
- Qin, M., Kang, J., Burlin, T. V., Jiang, C., Smith, C. B. Postadolescent changes in regional cerebral protein synthesis: an in vivo study in the FMR1 null mouse. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 25, 5087-5095 (2005).
- Qin, M., et al. R-Baclofen Reverses a Social Behavior Deficit and Elevated Protein Synthesis in a Mouse Model of Fragile X Syndrome. The International Journal of Neuropsychopharmacology. 18, pyv034 (2015).
- Qin, M., et al. Cerebral protein synthesis in a knockin mouse model of the fragile X premutation. ASN Neuro. 6, (2014).
- Smith, C. B., Kang, J. Cerebral protein synthesis in a genetic mouse model of phenylketonuria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 11014-11019 (2000).
- Reivich, M., Jehle, J., Sokoloff, L., Kety, S. S. Measurement of regional cerebral blood flow with antipyrine-14C in awake cats. Journal of Applied Physiology. 27, 296-300 (1969).
