生体内における脳タンパク質合成の局所速度の決定のための定量的自動放射線法

タンパク質合成は、神経系1における長期適応変化に必要な重要な生物学的プロセスである。タンパク質合成を阻害することは、無脊椎動物と脊椎動物の両方における長期記憶貯蔵をブロック^する2.タンパク質合成は、長期増強(LTP)および長期うつ病(LTD)3、開発^時のニューロン生存、およびニューロンおよびその一般的な維持のために、いくつかの形態の後期段階の維持に不可欠である。シナプス接続⁵.脳タンパク質合成率の測定は、適応的変化だけでなく、神経発達障害や学習と記憶に関連する障害を研究するための重要なツールである可能性があります。

我々は、脳組織6のex vivoまたはインビトロ製剤の速度を推定する他の技術よりも固有の利点を提供する覚醒動物における生体内の脳タンパク質合成の速度を定量する方法を開発した。何よりも、目を覚ました動物の無傷の脳での測定への適用性です。これは、シナプス構造と機能を備えた測定を可能にし、死後の影響を気にすることなく、重要な考慮事項です。さらに、我々が採用する定量的な自動放射線アプローチは、高度な空間ローカリゼーションを達成する。^14Cのエネルギーは、細胞レベルまたは細胞レベルでトレーサーを局在化できないほどですが、視床下部核などの細胞層や小脳領域の速度を測定することができ、約25μmの分解能7を持つ。

放射線トレーサーによる生体内測定の1つの課題は、測定された放射性標識が未反応標識前駆体または他の無関係標識代謝^産物6ではなく、関心のある反応の産物であることを確実にすることである。トレーサーアミノ酸としてL-[1-14 C]-ロイシンを選んだのは、タンパク質に組み込まれるか、14CO2に急速に代謝され、高い割合から生じる脳内の標識されていないCO2の大きなプールで希釈されるからである。 エネルギー代謝⁸.さらに、タンパク質に組み込まれなかった^任意の14Cは、主に自由[14C]-ロイシンとして存在し、60分の実験期間にわたって、組織6からほぼ完全にクリアされる。タンパク質は、ホルマリンで組織に固定され、その後、自己放射器の前に任意の^自由[14C]-ロイシンを除去するために水ですすいでください。

もう一つの重要な考慮事項は、組織プロテオリシスに由来する標識のないアミノ酸による前駆体アミノ酸プールの特定活性の希釈の問題である。成体ラットおよびマウスにおいて、脳内のタンパク質合成のための前駆体ロイシンプールの約40%がタンパク質分解6に由来するアミノ酸に由来することを示した。これは、脳タンパク質合成(rCPS)の局所率の計算に含まれなければならず、この関係が変化する可能性のある研究で確認されなければならない。理論上の基礎と方法の仮定は、他の場所で詳細に提示されている⁶.本稿では,この方法論の応用の手続き上の問題点に焦点を当てる.

この方法は、地上リス9、羊10、ケサスサル11、ラット12、13、14、15、16におけるrCPSの決定のために用いられた^{,17歳,18歳,19歳,20歳,21、}結節性硬化症^複合体22のマウスモデル、脆弱X症候群23、24、25、26、脆弱X変異^{マウス27、}およびフェニルケトン尿^症28のマウスモデル。本原稿では、生体内自動放射線L-[1-14 C]-ロイシン法を用いてrCPSを測定する手順を提示する。覚醒コントロールマウスの脳領域にrCPSを提示する.また、翻訳の阻害剤であるアニソマイシンの生体内投与では、脳内のタンパク質合成を廃止することを実証する。