Kwantitatieve autoradiografische methode voor de bepaling van de regionale tarieven van cerebrale eiwitsynthese in vivo

Eiwitsynthese is een belangrijk biologisch proces dat nodig is voor lange termijn adaptieve veranderingen in het zenuwstelsel¹. Remming van de eiwitsynthese blokkeert lange termijn geheugen opslag in zowel ongewervelde dieren en gewervelde dieren². Eiwitsynthese is essentieel voor het onderhoud van de late fasen van sommige vormen van lange termijn potentiëring (LTP) en lange termijn depressie (LTD)³, neuronale overleving tijdens ontwikkeling⁴, en voor algemeen onderhoud van het neuron en zijn synaptische verbindingen⁵. Meting van de tarieven van de hersenen eiwitsynthese kan een belangrijk instrument waarmee te studeren adaptieve veranderingen evenals neuroontwikkelingsstoornissen en aandoeningen met betrekking tot leren en geheugen.

We hebben een methode ontwikkeld om de percentages van de cerebrale eiwitsynthese in vivo te kwantificeren in een wakker dier dat inherente voordelen biedt ten opzichte van andere technieken die de percentages in ex vivo of in vitro preparaten van hersenweefsel⁶inschatten. De belangrijkste is de toepasbaarheid op metingen in het intacte brein in een wakker dier. Dit is een belangrijke overweging, omdat het toelaat metingen met synaptische structuur en functie op zijn plaats en zonder zorgen over post mortem effecten. Bovendien bereikt de kwantitatieve autoradiografische benadering die wij hanteren een hoge mate van ruimtelijke lokalisatie. Overwegende dat de energie van ¹⁴C zodanig is dat we de Tracer niet op het subcellulaire of cellulaire niveau kunnen lokaliseren, we kunnen de tarieven in cellagen en kleine hersengebieden zoals hypothalamische kernen meten, met ongeveer een 25 μm-resolutie⁷.

Een uitdaging van in vivo metingen met radiotracers is om ervoor te zorgen dat radio label gemeten is in het product van de reactie van belang in plaats van ongereageerde gelabelde precursor of ander vreemd gelabelde metabole producten⁶. We kozen voor L-[1-¹⁴C]-Leucine als de Tracer aminozuur omdat het ofwel is opgenomen in eiwitten of snel gemetaboliseerd tot ¹⁴co_2, die wordt verdund in de grote pool van niet-gelabelde co₂ in de hersenen als gevolg van de hoge snelheid van energiemetabolisme⁸. Bovendien bestaat ¹⁴c niet opgenomen in eiwitten voornamelijk als vrij [¹⁴c]-Leucine, die gedurende de experimentele periode van 60 minuten bijna volledig uit het weefsel⁶wordt geklaard. Eiwitten worden vervolgens vastgemaakt aan weefsel met formaline en vervolgens gespoeld met waterom elke vrije [¹⁴C]-Leucine te verwijderen voor autoradiografie.

Een andere belangrijke overweging is de kwestie van de verdunning van de specifieke activiteit van de precursor aminozuur pool door niet-gelabelde aminozuren afgeleid van weefsel proteolyse. We hebben aangetoond dat bij volwassen rat en muis, ongeveer 40% van de precursor Leucine pool voor eiwitsynthese in de hersenen komt uit aminozuren afgeleid van eiwitafbraak⁶. Dit moet worden opgenomen in de berekening van de regionale tarieven van cerebrale eiwitsynthese (Rcp’s) en moet worden bevestigd in studies waarin deze relatie kan veranderen. De theoretische basis en de veronderstellingen van de methode zijn in detail elders gepresenteerd⁶. In dit document richten we ons op de procedurele kwesties van de toepassing van deze methodologie.

Deze methode is gebruikt voor de bepaling van de rcp’s in de grondeekhoorns⁹, schapen¹⁰, rhesus monkeys¹¹, ratten^{12,13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21}, een muismodel van het Tubereuze sclerose^{complex 22}, een muismodel van fragiel x-syndroom^23,24,25,26, fragiele x premutatie muizen²⁷, en een muismodel van fenylketonurie²⁸. In dit manuscript presenteren we de procedures voor het meten van Rcp’s met de in vivo autoradiographic L-[1-¹⁴C]-Leucine-methode. We presenteren Rcp’s in hersengebieden van een wakker besturings muis. We tonen ook aan dat in vivo toediening van anisomycine, een remmer van de vertaling, afschaffing van de eiwitsynthese in de hersenen.